一种比伐卢定中三氟乙酸的含量测定方法

摘要

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种比伐卢定中三氟乙酸的含量测定方法，检测方法为高效液相色谱法；本发明提供了一种检测方法，克服了比伐卢定不易从色谱柱上洗脱下来的缺点；本发明的技术方案特点是：以磷酸溶液为流动相A，甲醇为流动相B，其中，流动相A为0.05%～0.10%磷酸溶液，磷酸溶液要用10%氢氧化钠溶液调pH值至3.01～4.00；采用梯度洗脱的方式，该梯度洗脱的方式很容易将比伐卢定从色谱柱上洗脱下来。

权利要求

1.一种高效液相色谱法测定比伐卢定中三氟乙酸含量的方法，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其特征在于：流动相由流动相A、流动相B组成，以0.05％～0.10％磷酸溶液为流动相A，其中磷酸溶液用10％氢氧化钠溶液调pH值至3.01～4.00，甲醇为流动相B，洗脱方式采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的流动相浓度，洗脱时间如下表：

2.根据权利要求1所述测定方法，其特征在于：梯度洗脱的方式，包括流动相浓度，洗脱时间如下表：

3.根据权利要求1或2所述的测定方法，比伐卢定中三氟乙酸含量的测定方法如下：

精密称取三氟乙酸对照品适量，用流动相配制成每1ml中含1mg三氟乙酸的溶液，作为对照品溶液；精密称取比伐卢定适量，用流动相配制成每1ml中含比伐卢定10mg的溶液，作为供试品溶液；依据中国药典2010年版二部附录V D，照高效液相色谱法测定；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.05％～0.10％磷酸溶液为流动相A，其中磷酸溶液用10％氢氧化钠溶液调pH值至3.01～4.00，甲醇为流动相B，进行梯度洗脱，流速为0.8～1.5ml/min，柱温为25～35℃，检测波长为200～220nm，进样量为20μl，梯度洗脱；梯度洗脱的方式，包括流动相浓度，洗脱时间如下表：分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，得到样品中三氟乙酸的含量。

说明书

一种比伐卢定中三氟乙酸的含量测定方法

技术领域：

[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种高效液相色谱法测定比伐卢定中三氟乙酸含量的方法。背景技术：

[0002] 比伐卢定为新型抗凝药，抗凝成分是水蛭素衍生物（片段），系一合成20肽，相对分子量2180。本品为凝血酶直接的、特异的、可逆性抑制剂。无论凝血酶处于血循环中还是与血栓结合，本品均可与其催化位点和阴离子结合位点（又称底物识别位点）发生特异性结合，从而直接抑制凝血酶的活性。因凝血酶可水解本品多肽顺序中Arg3和Pro4之间的肽键，使本品失活，所以本品对凝血酶的抑制作用是可逆而短暂的，大大降低了临时抗凝带来的出血风险，使该药在高危患者中也得到了广泛的应用，取得了较好的临床应用效果。

[0003] 在比伐卢定的合成工艺中，为保护比伐卢定的氨基游离而遭受氧化而变质，最后一步是将比伐卢定制成三氟乙酸盐，以保证比伐卢定的质量。通过检测比伐卢定中三氟乙酸的含量，来保证其均已成盐（全部成盐后，三氟乙酸的理论含量为9.5%）。

[0004] 三氟乙酸的含量测定方法多采用气相色谱法，由于三氟乙酸的极性大，酸性强，所以对气相色谱柱损伤大，分析成本高，且效果不很理想。而用氧瓶燃烧法测定氟的含量，操作繁琐且误差较大。也可以考虑用强酸型阳离子交换色谱柱测定三氟乙酸的含量，但也不是实验室常用手段。

[0005] 目前比伐卢定中三氟乙酸的含量测定已发表（高效液相色谱法测定比伐卢定中三氟乙酸含量，中国生化药物杂志，2010年第30卷第2期）的方法为HPLC法，具体如下：

[0006] 精密称取三氟乙酸对照品适量，用流动相配制成每1ml中含0.5mg三氟乙酸的溶液，作为对照品溶液；精密称取比伐卢定适量，用流动相配制成每1ml中含比伐卢定5mg的溶液，作为供试品溶液。照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录V D）测定。用十八烷基硅烷键合硅胶（C18柱）为填充剂，以0.07%磷酸溶液（pH3.0）-甲醇（98:2）为流动相；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为210nm。分别精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，得到样品中三氟乙酸的含量。

[0007] 经研究发现，在实际操作过程中，上述方法存在不足：采用上述流动相无法将比伐卢定从C18柱上洗脱下来，虽多次进样尚未发现其对三氟乙酸测定存在干扰，但主峰未洗脱易使色谱柱污染而减少其寿命。发明内容：

[0008] 为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供了一种检测方法，克服了比伐卢定不易从色谱柱上洗脱下来的缺点。本发明的技术方案特点是：以磷酸溶液为流动相A，甲醇为流动相B，其中，流动相A为0.05%～0.10%磷酸溶液，磷酸溶液要用10%氢氧化钠溶液调pH值至3.01～4.00；采用梯度洗脱的方式，该梯度洗脱的方式很容易将比伐卢定从色谱柱上洗脱下来。

[0009] 本发明的具体的梯度洗脱的方式，包括流动相浓度，洗脱时间如下表：

[0010]

[0011] 其中优选梯度洗脱的方式，包括流动相浓度，洗脱时间如下表：

[0012]

[0013]

[0014] 本发明通过梯度洗脱的方式，使得比伐卢定能够从C18柱上洗脱，并且确保了三氟乙酸和比伐卢定的分离度符合要求，从而确保了比伐卢定原料的质量可控（结果见附图1-3）。

[0015] 本发明还对比伐卢定中三氟乙酸的含量测定方法进行了深入研究：

[0016] 1.色谱条件的选择

[0017] （1）流动相

[0018] 我们通过实验比较了以0.07%磷酸溶液（pH3.0）-甲醇（98:2）为流动相和以0.05%～0.10%磷酸溶液（用10%氢氧化钠溶液调pH值至3.01～4.00）为流动相A，甲醇为流动相B，进行梯度洗脱的流动相测定样品的色谱图。以0.07%磷酸溶液（pH3.0）-甲醇（98:2）为流动相的样品色谱图，比伐卢定峰未洗脱出；而以0.05%～0.10%磷酸溶液（用
10%氢氧化钠溶液调pH值至3.01～4.00）为流动相A，甲醇为流动相B，进行梯度洗脱的流动相测定样品的色谱图，基线平稳，三氟乙酸与比伐卢定完全分离，峰型对称，响应高（见图
1和图2）

[0019] （2）样品浓度

[0020] 为了能准确的检测出样品中所含三氟乙酸的量，我们分别比较了进样量为20μl浓度为5mg/ml，10mg/ml和15mg/ml的供试品的色谱图和三氟乙酸含量，实验结果表明，浓度为10mg/ml的样品测得三氟乙酸含量最高，且主峰峰型对称没有过载，因此确定比伐卢定中三氟乙酸含量测定样品浓度为10mg/ml。

[0021] 2.检测条件的验证

[0022] （1）专属性

[0023] 取比伐卢定样品约100mg，加流动相溶解并稀释制成浓度为10mg/ml的溶液，同时向供试液中加含量占5%的三氟乙酸，取20μl注入色谱仪，记录色谱图。结果表明，在此检测条件下，样品中的三氟乙酸可以和主成分达到完全分离，专属性强。

[0024] （2）检测限

[0025] 精密称取三氟乙酸对照品适量，加流动相溶解，并经多步稀释后，作为供试液，取20μl注入色谱仪，记录色谱图，到峰高为基线噪音的三倍，测得三氟乙酸最小检出浓度为
3.97μg/ml。

[0026] （3）线性

[0027] 精密称取三氟乙酸对照品适量，加流动相溶解，并分别稀释制成198.4μg/ml，297.6μg/ml，396.8μg/ml，496.0μg/ml，992.0μg/ml的溶液。各取20μl注入色谱仪，计算线性和相关系数。该方法的线性回归方程为Y=557.0X–4783，r=0.9999，线性范围为
198.4μg/ml～992.0μg/ml。

[0028] （4）回收率

[0029] 用加样回收法，精密称取供试品100mg至10ml量瓶，流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为回收率空白溶液；另精密量取三氟乙酸溶液（含三氟乙酸10mg/ml）0.8ml，1.0ml，1.2ml各3份，分别置10ml量瓶中，空白溶液稀释至刻度，摇匀，作为回收率测定溶液。分别精密量取对照品溶液、空白溶液和回收率测定溶液各20μl，注入色谱仪，并计算回收率。
该方法的平均回收率为99.9%，RSD为0.41%。

[0030] 本发明比伐卢定中三氟乙酸的含量测定方法如下：

[0031] 精密称取三氟乙酸对照品适量，用流动相配制成每1ml中含1mg三氟乙酸的溶液，作为对照品溶液；精密称取比伐卢定适量，用流动相配制成每1ml中含比伐卢定10mg的溶液，作为供试品溶液。照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录V D）测定。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.05%～0.10%磷酸溶液（用10%氢氧化钠溶液调pH值至3.01～4.00）为流动相A，甲醇为流动相B，进行梯度洗脱；流速为0.8～1.5ml/min；柱温为25～35℃；检测波长为200～220nm，进样量为20μl。梯度洗脱。

[0032] 梯度洗脱的方式，包括流动相浓度，洗脱时间如下表：

[0033]

[0034]

[0035] 分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，得到样品中三氟乙酸的含量。附图说明：

[0036] 图1为以磷酸溶液-甲醇为流动相等度洗脱的色谱图，1、三氟乙酸；图2为以磷酸溶液-甲醇为流动相梯度洗脱的色谱图，1、三氟乙酸，2、比伐卢定；

[0037] 图3为以磷酸溶液-甲醇为流动相梯度洗脱的空白溶剂的色谱图具体实施方式：

[0038] 下面通过具体实施例的方式对本发明做进一步详述，但不应理解为是对本发明保护范围的限制，凡基于上述技术思想，利用本领域普通技术知识和惯用手段所做的修改、替换、变更均属于本发明的范围。

[0039] 实施例1：比伐卢定中三氟乙酸的含量测定之一：

[0040] 1、实验仪器及色谱条件

[0041] 戴安U3000高效液相色谱仪，伊力特C18色谱柱（5μm，4.6*200mm），以0.05%磷酸溶液（用10%氢氧化钠溶液调pH值至3.01）为流动相A，甲醇为流动相B，进行梯度洗脱；流速为0.8～1.5ml/min；柱温为25～35℃；检测波长为200～220nm，梯度洗脱程序如下：

[0042]

[0043] 2、样品的测定

[0044] 精密称取三氟乙酸对照品适量，用流动相（流动相A为0.05%磷酸溶液，磷酸溶液要用10%氢氧化钠溶液调pH值至3.01，流动相B为甲醇，流动相A:B为95:5V/V）配制成每1ml中含1mg三氟乙酸的溶液，作为对照品溶液；精密称取比伐卢定适量，用上述相同的流动相配制成每1ml中含比伐卢定10mg的溶液，作为供试品溶液。照比伐卢定中三氟乙酸含量测定项下的色谱条件，精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，得到样品中三氟乙酸的含量（见图2）。

[0045] 实施例2：比伐卢定中三氟乙酸的含量测定之二：

[0046] 1、实验仪器及色谱条件

[0047] 戴安U3000高效液相色谱仪，伊力特C18色谱柱（5μm，4.6*200mm），以0.08%磷酸溶液（用10%氢氧化钠溶液调pH值至4.00）为流动相A，甲醇为流动相B，进行梯度洗脱；流速为0.8～1.5ml/min；柱温为25～35℃；检测波长为200～220nm，梯度洗脱的方式，包括流动相浓度，洗脱时间如下表：

[0048]

[0049] 2、样品的测定

[0050] 精密称取三氟乙酸对照品适量，用流动相（流动相A为0.08%磷酸溶液，磷酸溶液要用10%氢氧化钠溶液调pH值至4.00，流动相B为甲醇，流动相A：B为92:8V/V）配制成每1ml中含1mg三氟乙酸的溶液，作为对照品溶液；精密称取比伐卢定适量，用上述相同的流动相配制成每1ml中含比伐卢定10mg的溶液，作为供试品溶液。照比伐卢定中三氟乙酸含量测定项下的色谱条件，精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，得到样品中三氟乙酸的含量。

[0051] 实施例3：比伐卢定中三氟乙酸的含量测定之三：

[0052] 1、实验仪器及色谱条件

[0053] 戴安U3000高效液相色谱仪，伊力特C18色谱柱（5μm，4.6*200mm），以0.10%磷酸溶液（用10%氢氧化钠溶液调pH值至3.51）为流动相A，甲醇为流动相B，进行梯度洗脱；流速为0.8～1.5ml/min；柱温为25～35℃；检测波长为200～220nm，梯度洗脱程序如下：

[0054]

[0055] 2、样品的测定

[0056] 精密称取三氟乙酸对照品适量，用流动相（流动相A为0.10%磷酸溶液，磷酸溶液要用10%氢氧化钠溶液调pH值至3.51，流动相B为甲醇，流动相A:B为98:2V/V）配制成每1ml中含1mg三氟乙酸的溶液，作为对照品溶液；精密称取比伐卢定适量，用上述相同的流动相配制成每1ml中含比伐卢定10mg的溶液，作为供试品溶液。照比伐卢定中三氟乙酸含量测定项下的色谱条件，精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，得到样品中三氟乙酸的含量。