一种牛睾丸细胞系及其建立方法和应用

摘要

本发明提供了一种牛睾丸细胞系。本发明还提供了该细胞系的建立方法，主要步骤为：(1)原代培养：无菌获取初生犊牛睾丸，清除粘附组织，采用胰酶消化法分离获得高活力的牛睾丸细胞；将分离得到的高活力的牛睾丸细胞培养于DMEM培养基中，置于37℃，5％CO2条件下培养，得原代牛睾丸细胞；(2)转染和筛选：提取纯化含有hTERT基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT，采用脂质体转染法，将提取纯化的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入步骤(1)原代培养的牛睾丸细胞进行转染；(3)筛选和扩大培养。本发明牛睾丸细胞易于培养，生长速度较快，能稳定传代，细胞活率高、纯度高且能很好保藏；本发明方法操作简便，便于推广应用。本细胞系可应用于生产猪瘟疫苗、羊痘、羊口疮疫苗等。

权利要求

1.一种牛睾丸细胞系，其保藏号为：CCTCC NO：C201399。

2.权利要求1所述的牛睾丸细胞系的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是指在生产猪瘟疫苗、羊痘、羊口疮疫苗中的应用。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是指所述的牛睾丸细胞系在研究猪瘟病毒、羊痘病毒及羊口疮病毒在睾丸细胞增殖中的应用。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是指所述的牛睾丸细胞系在研制羊痘病毒疫苗的应用。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是所述的牛睾丸细胞系在外源基因转染、细胞凋亡及细胞融合研究中的应用。

说明书

一种牛睾丸细胞系及其建立方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于动物细胞工程技术领域，涉及一种新的细胞系，具体涉及一种牛睾丸细胞系及其建立方法和应用。

背景技术

[0002] 疫苗是防治猪瘟主要的预防措施。用异源动物细胞生产疫苗可防止种毒毒力返强及避免使用同源动物造成其他疾病传播，如牛睾丸、羊睾丸、羊肾等原代细胞增殖CSFVC株疫苗。

[0003] 猪瘟病毒(CSFV)能在牛睾丸细胞中增殖，却不使细胞产生病变(CPE)，而且病毒的增殖能够增加原代牛睾丸细胞的传代次数和维待时间。然而长期以来，我国的猪瘟兔化弱毒牛睾丸细胞苗在生产中存在着许多问题：在猪瘟犊牛睾丸细胞苗生产过程中，因多利用奶牛场淘汰的新生犊牛睾丸为生产原料，受供体数量的限制而影响每批产量，如果只应用当天收集的犊牛睾丸，往往因为数量少而不便生产安排。为满足生产需求，生产中通常采用恒温保存，而常常由于冰箱的制冷机制造成的短时间温度过低（不恒温）影响睾丸细胞培养和疫苗的生产。

[0004] 随着养猪业的快速发展，猪瘟牛睾丸细胞苗需求量愈来愈大，单纯依靠犊牛睾丸细胞原代的培养难以满足生产的需要，所以建立牛睾丸细胞系迫在眉睫。同时，原代牛睾丸细胞需要采集犊牛睾丸组织来分离，其来源受到很大限制。因此，现在急需对其方法进行改进，使牛睾丸细胞能够稳定传代下去，达到高细胞活率、高纯度的标准且能得到很好的保藏并延续下去。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种高活性、高纯度的牛睾丸细胞系。

[0006] 本发明建立了一种牛睾丸细胞系，达到了上述发明目的。所述细胞系的保藏号为：CCTCCNO:C201399。

[0007] 上述牛睾丸细胞系可用于生产猪瘟疫苗、羊痘疫苗和羊口疮疫苗，还可在研究病毒在猪瘟病毒、羊痘病毒、羊口疮病毒在睾丸细胞中增殖中应用；还可在分离鉴定羊痘病毒以及研制羊痘病毒疫苗中应用；还可在外源基因转染、细胞凋亡及细胞融合研究中应用。

[0008] 本发明的还提供上述细胞系的建立方法，该方法通过采集初生犊牛睾丸进行原代培养；然后向原代细胞导入编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT进行转染，后筛选含该目的基因的阳性细胞；接着进行筛选和扩大培养，以获得永生化的牛睾丸细胞系，最后对该细胞进行冻存并保藏。

[0009] 上述的牛睾丸细胞系的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：

[0010] （1）原代培养：采集初生犊牛睾丸，剪成0.5～2.0mm3的组织块，分离得高活力的牛睾丸细胞，培养，得原代牛睾丸细胞，

[0011] （2）转染和筛选：提取、纯化含有hTERT基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT，将提取、纯化的的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入步骤(1)所得原代牛睾丸细胞进行转染；

[0012] （3）筛选和扩大培养：细胞转染真核表达质粒pCI-neo-hTERT后待细胞汇合至80％时，传至另一个24孔培养板中，48h后用G418筛选液进行G418筛选；

[0013] 待对照孔的细胞全部死亡后，将G418筛选液的浓度降低维持G418筛选，将G418筛选阳性的克隆细胞接种到96孔培养板中，然后消化传代至24孔培养板扩大培养，继续进行G418筛选，得抗G418的阳性细胞；

[0014] （4）将步骤（3）所得抗G418的阳性细胞于培养箱内进行体外连续传代培养，培养超过60代，获得永生化的牛睾丸细胞系；所述体外连续传代培养采用消化法。

[0015] 上述牛睾丸细胞系的建立方法，其特征在于，还包括细胞冻存步骤，该步骤按顺序如下：

[0016] 更换步骤（4）培养瓶内的培养基，继续培养；

[0017] 用胰酶消化培养细胞，然后加入培养基终止反应；

[0018] 计数；

[0019] 收集：离心，去上清液，加入冻存液，混匀，使细胞重悬，将培养的细胞分装入冻存管封口；

[0020] 预冻：4℃预冻冻存管30～60min，-20℃预冻1～2h，-70℃预冻6～12h；

[0021] 冻存：将-70℃预冻的冻存管迅速投入液氮柜中；

[0022] 所述的冻存液的各成分所占体积百分比为：10%DMSO、60%胎牛血清和30%DMEM。

[0023] 上述牛睾丸细胞系的建立方法，其特征在于，步骤（1）所述的培养是指高活力的牛睾丸细胞培养于完全的DMEM培养基中；

[0024] 所述完全的DMEM培养基为向液态DMEM培养基中加入体积比为10%的胎牛血清的DMEM培养基；

[0025] 所述的液态DMEM培养基可以使用直接购买的该液体培养基，也可以是使用购买的DMEM培养基干粉配制而成。

[0026] 上述牛睾丸细胞系的建立方法，其特征在于，所述转染包括如下步骤：

[0027] （1）转染前24h，将牛睾丸细胞用消化成单个细胞，接种到24孔板内，使细胞在转染当天能达到80％～90％的融合；

[0028] （2）转染前4h，将完全的DMEM培养基更换成液态DMEM培养基；

[0029] （3）用液态DMEM培养基将三份5μL的pCI-neo-hTERT质粒均稀释至50μL，得稀释的质粒DNA；

[0030] （4）用液态DMEM培养基分别稀释6μL、9μL、12μL的Lipofectamine2000到50μL，得稀释的Lipofectamine2000；

[0031] （5）分别混合步骤（3）的稀释的质粒DNA和步骤（4）的稀释的Lipofectamine2000，得混合物；

[0032] （6）吸出步骤（1）的24孔板中的培养基，用D-Hank’s清洗，加入900μL液态DMEM培养基；

[0033] （7）加入步骤（5）的混合物到不同孔中，混匀；同时设立空白对照；

[0034] （8）于体积分数为5％CO2饱和湿度培养箱中孵育，弃去培养基，加入完全的DMEM培养基；

[0035] （9）观察细胞，并及时换液。

[0036] 本发明牛睾丸细胞系具有以下特征：细胞生长速度快，生长健康，形态良好，细胞凋亡率低。细胞纯度在99.9%以上，细胞活率不小于92.8%。

[0037] 本发明牛睾丸细胞系的生物学特性检测各项指标均达到美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)细胞系鉴定标准，且外源基因在牛睾丸细胞系中的表达率在40%以上。

[0038] 本发明牛睾丸细胞系的建立方法中，步骤（1）中所述的初生牛睾丸组织效果最佳。

[0039] 本发明牛睾丸细胞系的建立方法中，胰酶消化的具体步骤是：向培养瓶内加入2.5g/L胰酶1.5～2.5mL，倒置培养瓶于温箱中预热至37℃后后翻转消化30～60S。

[0040] 本发明牛睾丸细胞系的建立方法中，根据实际需要可以将冻存的细胞进行复苏，具体步骤为：将冻存管从液氮中取出置入38℃水浴中，晃动1分种后，将细胞移入加有完全的DMEM培养基的培养瓶中吹打均匀，放置含37℃，5%CO2的CO2培养箱中继续培养48h后即可继续传代培养。

[0041] 本发明的优点与效益：本发明对于贴壁培养方法及培养基成分的改进调整，并采用细胞单克隆的方法，可以使培养出的牛睾丸细胞无上皮细胞等杂质细胞，细胞纯度与现有技术相比有大幅提高；对于冻存条件的改进使复苏的细胞与冻存前相比，细胞形态和生长速度没有发生变化，冻存细胞质量稳定，且细胞冻存后的细胞活率可达到92.8%～96.7%之间，且细胞传代生长稳定，与现有细胞培养技术培养的细胞相比有显著提高，适合大规模培养。对于培养基的调整及培养方法的改进，还可以使成本大幅降低。本发明方法弥补了现有牛睾丸细胞系缺乏的现状，牛睾丸细胞系存活率及纯度的提升也使猪瘟及相关疾病研究和疫苗等生物制剂研制提供手段，而且也为羊痘等病毒的分离鉴定以及疫苗的研制提供科学素材和工具；同时还可用于外源基因转染、细胞凋亡及细胞融合研究之用。

[0042] 本发明牛睾丸细胞系不仅能够生产猪瘟疫苗，还能够研究病毒在睾丸细胞中增值的基本特性和规律，为疫苗生产中猪瘟病毒产量的提高提供新的思路。同时，牛睾丸细胞还能生产其他病毒疫苗：如羊痘疫苗、羊口疮疫苗等。

[0043] 本发明方法易于培养，生长速度较快，操作方法简便，获得细胞纯度高、存活率高且传代生长稳定，便于推广应用。

[0044] 生物材料保藏信息

[0045] 分类命名：牛睾丸细胞系WWX-BTC02

[0046] 保藏编号：CCTCC NO:C201399

[0047] 保藏机构：中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC）

[0048] 保藏机构地址：中国，武汉，武汉大学邮编：430072

[0049] 保藏时间：2013年6月24日

附图说明

[0050] 图1为原代牛睾丸细胞显微镜图；

[0051] 图2为转染后阳性牛睾丸细胞克隆；

[0052] 图3为牛睾丸细胞系第5代细胞显微镜图；

[0053] 图4为牛睾丸细胞系第30代细胞显微镜图；

[0054] 图5为牛睾丸细胞系第50代细胞显微镜图；

[0055] 图6为iBTCs核型图；

[0056] 图7为牛睾丸细胞系软琼脂实验结果图；

[0057] 图8为HELA细胞软琼脂阳性对照；

[0058] 图9为iBTCs生长曲线图。

具体实施方式

[0059] 下面结合附图及最佳实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。前述部分己经充分公开了本发明可以实施的保护范围，因此凡依照本发明公开内容进行的任何本领域公知的等同替换，均属于对本发明的 侵犯。

[0060] G418是一种氨基糖苷类抗生素，在分子遗传试验中，是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。

[0061] 本发明的试剂的浓度、温度和其他变量的值只是举例说明本发明的应用，而不构成对本发明的限制。

[0062] 本发明实验材料的来源：

[0063] 生物材料：

[0064] 胎牛血清商购于胎牛血清是Gibco公司，货号：10099-141。

[0065] 含有hTERT基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT由天津农学院李吉霞博士馈赠。

[0066] 申请人声明，以上生物材料均在申请人实验室有保存，自申请日起二十年内可向公众发放用于验证试验。

[0067] 试剂的来源及规格如下：

[0068] DMSO商购于Sigma，Dimethyl sulfoxide，cat.D8418，规格100mL；

[0069] G418商购于Invitrogen，Cat no.11811023，规格：1g；

[0070] DMEM培养基干粉购于Dulbecco’s Modified Eagle Medium，Gibco公司，规格：10×1L；培养基为粉末状powder，low glucose低糖；货号：Cat.no.31600-034,Lot No.843267；

[0071] 液态DMEM培养基可以使用直接购买的液体培养基，本发明是使用购买的DMEM培养基干粉配制而成，配制方法见实施例1；

[0072] 完全的DMEM培养基为在上述自行配制的液态DMEM培养基中加入体积比为10%的Gibco胎牛血清；

[0073] G418筛选液为在上述自行配制的液态DMEM培养基中加入G418而得；

[0074] D-Hank’s，即D-Hank'S 液：NaCl8g，KCl0.4g，Na2HPO4·H2O0.06g，KH2PO40.06g，NaHCO30.35g溶于1000m1双蒸水，调节pH值至7.2-7.4，高压灭菌，4℃下保存备用。试剂均为分析纯；

[0075] 胰酶，购于胰酶Invitrogen，货号：27250-018，10g，2.5g/L；

[0076] Lipofectamine2000Reagent，商购于invitrogen公司，中文名称为脂质体2000，Cat.no.11668-027；

[0077] 其他的没有列出的化学试剂都是常规的化学试剂，分析纯级，商购途径获得，一般化学用品公司可以购买到。

[0078] 仪器设备的来源及规格如下：

[0079] Endo-Free Plasmid Maxi Kit无内毒素质粒提取试剂盒，购于Omega公司，货号：D6926-01；当量大时，质粒提取可采用质粒大量提取试剂盒，公司：QIAGEN，货号：12163；

[0080] DNA/质粒纯化回收试剂盒，购于Omega公司，货号：D2500-01，Gel Extraction Kit；

[0081] 本发明所用的培养基有两种：液态DMEM培养基和完全DMEM培养基，其中液态DMEM培养基是使用商购的DMEM培养基干粉（购于Dulbecco’s Modified Eagle Medium，Gibco公司）自行配制，而完全DMEM培养基是在液态DMEM培养基中加入体积比为10%的Gibco胎牛血清；

[0082] 本发明所使用的筛选液是在液态DMEM培养基中加入了G418，所述的400μg/mL G418筛选液是指每ml G418筛选液中含有400μg G418的DMEM培养基；所述的200μg/mL G418筛选液是指每ml G418筛选液中含有200μg G418的DMEM培养基；G418是一种抗生素，此处液态DMEM培养基中加入G418即作为G418筛选液；

[0083] 本发明胰酶消化所用胰酶均为质量体积比为2.5g/L的胰酶；

[0084] DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型（低于4500mg/L）和低糖型(低于
1000mg/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。

[0085] DMEM是dulbecco's modified eagle medium的缩写，所以其特点主要包括以下：

[0086] （1）氨基酸含量为依格尔培养基的2倍，且含有非必需氨基酸，如甘氨酸等；

[0087] （2）维生素含量为依格尔培养基的4倍；

[0088] （3）含有糖酵解途径中的重要物质—丙酮酸；

[0089] （4）含有微量的铁离子。

[0090] BTC全称bovine testis cells，即牛睾丸细胞，本专利建立的细胞系，命名为牛睾丸细胞系WWX-BTC01，就是通过向分离的牛睾丸组织原代细胞转染端粒酶基因后建成的细胞系。来源：由牛睾丸组织分离，牛是滨州市农户家健康新生牛犊。

[0091] 质粒DNA即为纯化的pCI-neo-hTERT质粒DNA；

[0092] 实施例1.液态DMEM培养基的配制

[0093] 液态DMEM培养基为自行配制，配制方法如下：

[0094] （1）制备新鲜的三蒸水或millipore超纯水，所述millipore超纯水的制备步骤如下：自来水经过第一级过滤器过滤，再经过第二级CTO活性炭过滤器过滤，进入第三级保安过滤机过滤后，由超净高压水泵处理，再由RO逆渗透膜过滤，最后经过多级纯水柱处理后得到超纯水；

[0095] （2）将一包DMEM培养基干粉（购于Dulbeccos Modified Eagle Medium，Gibco公司）加入约终一半的三蒸水中；需用水洗包装袋内面2次，导入培养基中，保证所有干粉都溶解成培养基。磁力搅拌或人工搅拌使之完全溶解；

[0096] （3）根据包装袋上要求补加3.7g的碳酸氢钠，加水定容到终体积1L；

[0097] （4）用无菌0.22μm滤膜过滤除菌，分装于无菌血清瓶中，4℃冰箱保存。

[0098] 完全的DMEM培养基为在上述自行配制的无血清的DMEM培养基中加入体积比为10%的Gibco胎牛血清；

[0099] 实施例2.牛睾丸细胞系的制备培养

[0100] （1）原代培养：无菌采集初生犊牛睾丸，用PBS漂洗3～5次以清除粘附组织，剪3
成0.5～2.0mm的组织块，采用胰酶消化法消化分离获得高活力的原代牛睾丸细胞；将分离得到的高活力的原代牛睾丸细胞中加入完全的DMEM培养基，计数后按照5000个细胞/mL的浓度接种于（含有10%胎牛血清的液态DMEM培养基）24孔板中，置于37℃，5％CO2条件下培养，得原代牛睾丸细胞；

[0101] 所述完全的DMEM培养基为向液态DMEM培养基中加入体积比为10%的胎牛血清的DMEM培养基。

[0102] （2）转染和筛选：将保存在-80℃的含有pCI-neo-hTERT质粒的DH5а菌取出，接种在含有氨苄的LB培养基中，振荡培养10h，取菌液提取质粒，用质粒提取试剂盒进行提取（质粒提取采用质粒大量提取试剂盒，公司：QIAGEN，货号：12163）；采用DNA/质粒纯化回收试剂盒对质粒进行纯化，得含有hTERT基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT，采用脂质体转染法，将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入步骤(1)原代培养的牛睾丸细胞进行转染，转染的具体包括如下步骤：

[0103] A、转染前24h，将牛睾丸细胞用2.5g/L胰酶消化成单个细胞，以1×105个细胞/孔接种到24孔板内，使细胞在转染当天能达到80％～90％的融合；

[0104] B、转染前4h，将完全的DMEM培养基更换成液态DMEM培养基；

[0105] C、用液态DMEM培养基稀释5μL pCI-neo-hTERT质粒至体积为50μL，轻轻混匀，质粒浓度达到300ng/μL～400ng/μL室温作用5min，得稀释的质粒DNA；

[0106] D、用液态DMEM培养基分别稀释Lipofectamine2000至6μL、9μL、12μL到50μL，轻轻混匀，室温作用5min，得稀释的Lipofectamine2000；

[0107] E、混步骤C的稀释的质粒DNA和步骤D的稀释的的Lipofectamine2000，此时总体积为100μL。轻轻混匀，室温作用20min，得混合物；

[0108] F、将24孔板中的旧培养基吸出，用D-Hank’s清洗，加入900μL液态DMEM培养基；

[0109] G、逐滴加入步骤E的混合物到不同孔中，边加边前后来回摇动培养板，轻轻混匀；同时设立2孔未转染作为空白对照；

[0110] H、在37℃、体积分数比为5％CO2饱和湿度培养箱中孵育4～6h，弃去培养基，加入完 全的DMEM培养基；

[0111] I、24h～48h观察细胞，并及时换液。；

[0112] （3）筛选和扩大培养：待细胞转染pCI-neo-hTERT真核表达质粒48小时后待细胞汇合至80％时，使用2.5g/L胰酶消化，以1:1传至另一个24孔培养板中，48h后加入400μg/mL G418筛选液（液态DMEM培养基中加入G418）进行G418筛选，每三天更换一次完全的DMEM培养基，且加入同样浓度的G418筛选液进行G418筛选，第7天时，可用胰酶于原孔消化细胞，弃去消化液并补加G418筛选液，连续培养两周，每两天换相同浓度筛选液1次，每天观察细胞生长及死亡情况；待对照孔的细胞全部死亡后，将G418筛选液的浓度降至200μg/mL维持G418筛选；继续G418筛选细胞一个月左右，每两天换1次液，直到阳性克隆细胞可见为止；将G418筛选阳性的克隆细胞消化并计数后，将细胞进行无限稀释，按每孔数量≤2个接种到96孔细胞培养板中，标记每一个细胞的孔，待单细胞长出克隆团后，用2.5g/L胰酶进行消化，并将细胞传至24孔培养板，于37℃、5%的CO2条件下进行扩大培养，继续利用G418筛选，得到抗G418的阳性细胞；此处的，在96孔培养板中相当于在利用单克隆的方法纯化细胞。

[0113] （4）37℃条件下，采用消化法将步骤（3）所得阳性细胞于5%的CO2培养箱内进行体外连续传代培养，分选后细胞呈现长梭状单层贴壁生长，细胞间存在接触抑制，培养超过60代，获得永生化的牛睾丸细胞系。

[0114] （5）细胞冻存：

[0115] A、弃除并更换培养瓶内液态DMEM培养基5～8mL，继续培养24h；

[0116] B、用胰酶消化培养细胞，然后加入液态DMEM培养基5～8mL终止反应；

[0117] C、用红细胞计数板计算冻存前细胞总数；

[0118] D、收集：1000rpm离心5～8min，去上清液，加入4℃预冷的冻存液1mL，混匀后用吸管轻轻吹打使细胞重悬；所述冻存液各成分所占体积百分比为：10%DMSO十60%胎牛血清+30%DMEM（也就是，100mL冻存液中，DMSO占总体积的10%，胎牛血清占总体积的60%，DMEM培养基占30%）；

[0119] E、将细胞培养物分装入灭菌的冻存管中封口；

[0120] F、预冻：4℃，将冻存管预冻30～60min，转移到-20℃预冻1～2h，然后转入-70℃预冻6～12h；

[0121] G、冻存：将-70℃预冻的冻存管迅速投入液氮柜中，即完成细胞冻存。

[0122] 将上述所得到的牛睾丸细胞系送到保藏在中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏入册登入册编号为CCTCC C201399，保藏单位地址为：湖北省武汉市武汉大学保藏中心。

[0123] 邮编：430072；电话：[phone]

[0124] 保藏日：2013年6月24日，保藏号：CCTCC C201399，建议的分类命名为牛睾丸细胞系。

[0125] 实施例3.实施例2所得牛睾丸细胞系的效果验证

[0126] 对实施例2培养的牛睾丸细胞系进行生物学特性检查，方法及结论如下。

[0127] 一、细胞形态学观察

[0128] 方法：细胞在体外培养过程中，对细胞进行常规检查，观察细胞生长状态、培养基颜色变化情况以及细胞是否发生污染。

[0129] 结论：如图1至图4所示，当细胞生长状态良好时，其形态呈现梭形或不规则三角形。对细胞群体的全貌观察，所培养的细胞均呈放射状、火焰状或漩涡状走势，证明细胞生长健康，形态良好。

[0130] 二、微生物检测

[0131] 1、细菌、真菌检测

[0132] 方法:

[0133] （1）取冻存细胞量0.5%的冻存细胞，于8mL无抗培养基中混匀，细胞悬液以1000rpm离心20min，并重复两次，以消除抗生素的影响。再重悬于2mL无抗生素的培养基中。

[0134] （2）将细胞以0.8mL接种到胰蛋白豆胨和麦芽汁培养基中，分别置于37℃和26℃的培养箱中培养两周。

[0135] （3）设对照为：

[0136] A.阳性对照：枯草芽抱杆菌和白假丝酵母菌分别接种到胰蛋白豆陈和麦芽汁培养基中培养，置于37℃和26℃的培养箱中培养两周。

[0137] B.阴性对照：胰蛋白豆陈培养基和麦芽汁培养基，分别置于37℃和26℃的培养箱中培养两周。

[0138] 结论：肉眼观察接种有牛睾丸细胞的大豆胰蛋白脉培养基和麦芽汁培养基，均呈现清亮透明状，将试管置于显微镜下观察，细胞呈圆形的透明状亮点漂浮在培养基中，无其它异物。证明在细胞培养冻存及细胞复苏的整个过程中，细胞未被细菌、真菌污染。

[0139] 三、细胞生长曲线绘制

[0140] 方法：

[0141] （1）悬液制备

[0142] 取待测生长状态良好的细胞，增至接近汇合时，用常规方法消化细胞制成细胞悬液，并计数。

[0143] （2）接种

[0144] 向24孔培养板内分别接种相同数量的细胞，于37℃CO2培养箱中继续培养。

[0145] （3）计数检测

[0146] 从接种时间算起，每隔24h计数3孔内的细胞密度，用血球计数板计算细胞总数，算出平均值，取3孔的平均值，如此至第8组结束。

[0147] （4）绘图

[0148] 以培养时间(d)为横坐标、细胞密度为纵坐标，将结果在坐标纸上绘图，即得培养细胞的生长曲线。

[0149] 结论：

[0150] 通过对所培养的牛睾丸细胞用常规方法制备细胞悬液，计数，接种24孔培养板，每孔1mL细胞悬液，对接种于24孔培养板的细胞进行连续7d定时记数，记录各次细胞密度，绘制而成培养细胞生长曲线如图7所示，接种后第2d细胞数开始增加，第3d进入对数生长期，第6d细胞生长缓慢，细胞生长期总体趋势均呈S型，细胞接种后均有24h的潜伏期，此期为细胞的适应阶段，是细胞由于接种时胰酶消化而致的损伤后的修复时期，此后细胞呈指数增殖，即指数生长期，最后进入停滞期，细胞生长缓慢，几乎停止，可见有细胞漂浮。而细胞分裂指数(MI最高值(培养第2d)在进入对数生长期前出现，并在培养第2～4d时维持于一个较高的水平，随后下降到初始水平。本发明方法培养的牛睾丸细胞系的纯度为99.9%，与现有技术培养细胞平均纯度91%相比有显著提高；且细胞群体倍增时间(PDT)为24h与现有技术胶原酶消化法和现有贴壁培养法获得的PDT-35.9h和48h相比具有显著的提高，证明细胞纯度高、生命力旺盛。

[0151] 四、细胞活率测定

[0152] 方法：

[0153] 检测冻存细胞的存活率可采用台盼蓝拒染试验，将待检细胞复苏后制成细胞悬液，取10μL细胞悬液加入10μL1%台盼蓝染液，混匀。血球计数板计数，健康活细胞胞体完整，细胞透明，不着色，凡着色呈蓝色者为死细胞。计数1000个细胞，计算细胞存活率。统计二种细胞总数，以活细胞占细胞总数的百分比反映细胞活力。

[0154] 结论：

[0155] 细胞冻存前后对牛睾丸细胞进行细胞活率测定。结果表明：冻存前细胞活率在96.8～98.7%之间，冻存后细胞活率为92.8%～96.7%，与现有细胞培养技术冻存后细胞活
78.6%相比有显著的提高。且复苏的细胞与冻存前相比，细胞形态发生变化，但生长速度没有发生变化，冻存细胞质量稳定。

[0156] 五、核型的制备

[0157] 方法：

[0158] 1、加秋水仙素：取对数生长期的细胞培养物，加秋水仙素到培养基内，终浓度为0.1～0.4g/mL。

[0159] 2、在37℃培养箱中继续培养1～4h，使大部分细胞处于分裂中期。

[0160] 3、采集分裂相细胞:加0.25%胰蛋白酶溶液用常规方法消化，然后加培养基，终止胰蛋白酶对细胞的作用。转入15mL离心管，以1000rpm离心8min，收集细胞。

[0161] 4、低渗：将沉淀细胞用预热至37℃，0.075M KCl溶液2mL，重悬，吹打均匀后，继续加KC1溶液至l0mL，放入37℃温箱中温育15min。

[0162] 5、预固定：悬液中加入新鲜固定液(醋酸:甲醇==1:3)1mL，轻轻打匀。

[0163] 6、固定：将悬液以1000rpm离心8min，去掉上清夜，加入新鲜固定液8mL，打匀，室温静置20min。

[0164] 7、重固定：重复2次，离心后去掉部分上清夜，剩余1～1.5mL，混匀。

[0165] 8、滴片：滴2～3滴细胞悬液于45。倾斜载玻片，使细胞分散均匀，室温下干燥。

[0166] 9、染色：用磷酸盐缓冲液(pH6.8)稀释10倍的Giemsa液染色l0min，自来水冲洗，空气干燥。