一种定向突变的半乳糖基转移酶的应用

摘要

本发明公开了一种定向突变的半乳糖基转移酶的应用。本发明经过研究发现定向突变的半乳糖基转移酶1能够从野生型的转移半乳糖变为基本只转移乙酰氨基半乳糖，并非如现有技术中报道的突变后的β1,4-半乳糖基转移酶1将同时转移半乳糖和乙酰氨基半乳糖，并且两者的转移效率相接近都为50%，有很大的区别。因此，定向突变的半乳糖基转移酶1可在生产不含乳糖或极低乳糖含量的天然奶中的应用。突变后的半乳糖基转移酶1从转移半乳糖变为转移乙酰氨基半乳糖，所以改变了乳汁中的乳糖成分，使其成为一种乳糖类似物，所以通过突变育种技术突变哺乳动物的半乳糖基转移酶1基因可以生产出几乎不含乳糖的新型奶，即可避免乳糖不耐症的发生。

权利要求

1.定向突变的半乳糖基转移酶1在生产不含乳糖或极低乳糖含量的天然奶中的应用，其中，所述的定向突变的半乳糖基转移酶1是通过基因工程手段定向突变牛野生型β1,4-半乳糖基转移酶1氨基酸序列第289位酪氨酸定向突变为亮氨酸，或者猪野生型β1,4-半乳糖基转移酶1氨基酸序列第288位酪氨酸定向突变为亮氨酸，使野生型β1,4-半乳糖基转移酶1的转移半乳糖基到乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖上变为突变型β1,4-半乳糖基转移酶1的转移乙酰氨基半乳糖到乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖上；其中所述的定向突变后的牛β1,4-半乳糖基转移酶1氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；定向突变后的猪β1,4-半乳糖基转移酶1氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种生产不含乳糖或极低乳糖含量的天然奶的方法，其特征在于将牛野生型β1,4-半乳糖基转移酶1氨基酸序列的第289位酪氨酸，或者猪野生型β1,4-半乳糖基转移酶1氨基酸序列的第288位酪氨酸定向突变为亮氨酸，使野生型β1,4-半乳糖基转移酶

1的转移半乳糖基到乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖上变为突变型β1,4-半乳糖基转移酶1的转移乙酰氨基半乳糖到乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖上，从而使乳汁中的乳糖Galβ1,4Glc发生改变成为乳糖类似物GalNAcβ1,4Glc；其中，定向突变后的牛β1,4-半乳糖基转移酶1氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，定向突变后的牛β1,4-半乳糖基转移酶1氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

说明书

一种定向突变的半乳糖基转移酶的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物工程领域，涉及一种定向突变的半乳糖基转移酶1的应用。

背景技术

[0002] 随着基因工程技术的迅速发展，我们已经可以通过基因改造手段培育各种生物新品系，尤其是针对一些模式生物的技术手段已经非常成熟。现在常用的基因改造手段有：转基因技术、常规基因敲除技术、基因敲入技术和条件敲除技术等。比如基因敲入技术，可以特异性地在靶基因中引入突变点以模拟人类家族遗传病的基因突变类型，也可以将外源基因整合到基因组的特定位点，或者进行物种间同源基因的替代。但是对具体突变位点以及突变方向的选择，关系到突变型生物的具体功能，还需要进行大量研究。

[0003] 糖基转移酶催化糖从供体的转移过程，并负责糖苷键的形成。糖基转移酶对核苷酸糖供体和接纳体具有特异性。β1,4-半乳糖基转移酶1是目前人们研究最为广泛和深入的糖基转移酶之一。该酶在哺乳动物的乳腺中表达量很高，且随哺乳过程表达增高。在细胞中，半乳糖基转移酶1主要分布在高尔基体上，其基本功能是负责将半乳糖基从糖供体UDP-半乳糖苷转移至乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖上，形成β-1,4糖苷键。但已有的文献表明，突变后的β1,4-半乳糖基转移酶1将同时转移半乳糖和乙酰氨基半乳糖，并且两者的转移效率相接近，都为50%[1]。

发明内容

[0004] 本发明的目的是通过基因敲入技术，提供一种定向突变的半乳糖基转移酶1。

[0005] 本发明的另一目的是提供该定向突变的半乳糖基转移酶1的应用。

[0006] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：

[0007] 定向突变的半乳糖基转移酶1在生产不含乳糖或极低乳糖含量的天然奶中的应用，其中，所述的定向突变的半乳糖基转移酶1是通过基因工程手段定向突变牛野生型β1,4-半乳糖基转移酶1氨基酸序列的第289位酪氨酸，或者猪野生型β1,4-半乳糖基转移酶1氨基酸序列的第288位酪氨酸，或者其他哺乳动物相似位点的酪氨酸，使野生型的转移半乳糖基到乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖上变为突变型的转移乙酰氨基半乳糖到乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖上。

[0008] 所述的酪氨酸优选定向突变为亮氨酸。

[0009] 定向突变后的牛β1,4-半乳糖基转移酶1氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0010] 定向突变后的猪β1,4-半乳糖基转移酶1氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0011] 一种生产不含乳糖或极低乳糖含量的天然奶的方法，对哺乳动物β1,4-半乳糖基转移酶1氨基酸序列特定位点的酪氨酸进行突变，使野生型的转移半乳糖基到乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖上变为突变型的转移乙酰氨基半乳糖到乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖上，从而使乳汁中的乳糖(Galβ1,4Glc)发生改变成为乳糖类似物(GalNAcβ1,4Glc)一种在牛初[2]乳中本身微量存在的物质 。

[0012] 本发明所述的极低乳糖含量是指基本不含有乳糖。

[0013] 所述的哺乳动物选自猪、牛或羊。

[0014] 所述的方法优选将牛野生型β1,4-半乳糖基转移酶1氨基酸序列的第289位酪氨酸，或者猪野生型β1,4-半乳糖基转移酶1氨基酸序列的第288位酪氨酸定向突变为亮氨酸。

[0015] 定向突变后的牛β1,4-半乳糖基转移酶1氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0016] 定向突变后的牛β1,4-半乳糖基转移酶1氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0017] 有益效果：

[0018] 本发明经过研究发现定向突变的半乳糖基转移酶1能够从野生型的转移半乳糖变为基本只转移乙酰氨基半乳糖，并非如现有技术中报道的突变后的β1,4-半乳糖基转移酶1将同时转移半乳糖和乙酰氨基半乳糖且两者的转移效率相接近都为50%，我们的实验结果与现有报道有很大的区别。

[0019] 因为乳汁中乳糖的来源是由β1,4-半乳糖基转移酶1转移一个半乳糖基到葡萄糖基，从而生成乳糖。当我们突变了β1,4-半乳糖基转移酶1后，β1,4-半乳糖基转移酶1就转移一个乙酰氨基半乳糖到葡萄糖基上，生成一种乳糖的类似物（GalNAcβ1,4Glc），而不再转移半乳糖，所以乳汁中的乳糖则基本不再生成。

[0020] 基于本发明的上述重大发现，以及哺乳动物乳汁中的乳糖来源很大程度上依靠的是半乳糖基转移酶1，本发明提出了定向突变的半乳糖基转移酶1在生产不含乳糖的天然奶中的应用。突变后的半乳糖基转移酶1从转移半乳糖变为转移乙酰氨基半乳糖，所以改变了乳汁中的乳糖成分，使其成为一种乳糖类似物，所以通过突变育种技术突变哺乳动物的半乳糖基转移酶1基因可以生产出含有新型游离寡糖而几乎不含乳糖的新型奶，这样便可以避免乳糖不耐症的发生。

附图说明

[0021] 图1为本发明猪源β4GalT1和β4GalT1Mut的western-blot结果图[0022] 图2为本发明牛源β’4GalT1和β’4GalT1Mut的western-blot结果图[0023] 图3为本发明猪、牛源β4GalT1(β’4GalT1)和β4GalT1Mut(β’4GalT1Mut)分别独立加入UDP-Gal和UDP-GalNAc两种底物的反应体系的LC谱图。

具体实施方式

[0024] 结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实例。

[0025] 实施例1

[0026] 根据Gene Bank中猪源β1,4-半乳糖基转移酶1的基因序列设计引物，引物两端带有限制性内切酶EcoR1和Xho1的碱基序列以及保护性碱基。

[0027] P1-F:5'-CGGAATTCCGAGGGGCCGCACCGCAG-3'（SEQ ID NO.3）

[0028] P1-R:5'-CCGCTCGAGCTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCACT-3'（SEQ ID NO.4）[0029] 从猪肝中抽提RNA，采用Takara公司的Trizol试剂盒进行RNA的抽提实验。得到的RNA进行反转录得到cDNA，反转录试剂盒来自Promega公司。

[0030] 采用Takara公司提供的PCR试剂盒，以cDNA为模板，P1-F和P1-R进行PCR扩增。PCR循环参数：预变性98℃,5min;98℃,40s；62℃，1min;72℃,1min共进行35个循环；72℃再延伸10min。

[0031] 采用Axygen公司的胶回收试剂盒将目的基因片段进行纯化。将纯化后的目的基因和空载体pet30a分别进行EcoR1和Xho1双酶切，分别将双酶切后的目的基因和载体pet30a进行切胶回收，然后将目的基因和载体进行常规连接反应。

[0032] 将连接产物转化大肠杆菌TOP10。将转化后的细胞涂布于含有Kana的LB琼脂平板，培养过夜。从平板上挑取菌落PCR验证，阳性克隆送样测序，得到完全正确的克隆菌株。其基因的genbank登录号为GI:545853190。

[0033] 抽提含有正确目的片段的菌株的质粒β4GalT1-pet30a，抽提试剂盒由Axygen公司提供。将质粒转化进表达工程菌BL21（DE3）。

[0034] 实施例2

[0035] 根据stratagene公司的Quick-change点突变试剂盒的要求，设计如下引物：

[0036] P2-F:5'-CCTTATGTGCAGCTGTTCGGCGGTGTCTCTG-3'（SEQ ID NO.5）[0037] P2-R:5'-GACACCGCCGAACAGCTGCACATAAGGGAG-3'（SEQ ID NO.6）[0038] PCR的过程以实施例1构建的β4GalT1-pet30a质粒为模板，将β4GalT1基因的865-867位碱基TAT改为CTG，即将猪源β1,4-半乳糖基转移酶1第288位酪氨酸（Tyr）突变为亮氨酸(Leu)，PCR循环参数：预变性98℃,1min;98℃,50s；60℃，50s;68℃,8min共进行18个循环；68℃再延伸10min。得到的PCR产物用限制性内切酶Dpn1消化原始质粒模板，将经限制性内切酶Dpn1消化的PCR产物转化高效率的感受态细胞。培养后挑菌提取质粒进Mut Mut
行测序，即可得到含有突变基因的质粒β4GalT1 -pet30a。抽提质粒β4GalT1 -pet30a转化表达工程菌BL21(DE3)。

[0039] 实施例3β1,4-半乳糖基转移酶1及其突变体的诱导表达

[0040] 将经鉴定后的β4GalT1-pet30a和β4GalT1Mut-pet30a重组质粒转化到表达宿主E.coliBL21(DE3)中。置于37℃培养箱中培养至长成大小合适的菌落。挑取含有重组质粒的转化子分别接种至含kana(50μg/mL)的LB液体培养液，置摇床37℃，250r/min震荡培养过夜。按1%接种量（v/v）转接至新鲜LB（400mL）培养液中，37℃，250r/min振荡培养至对数期（OD600≈0.6-0.8），分别加入诱导剂IPTG至终浓度1.0mmol/L,置25℃摇床，250r/min诱导表达3h。实施例4目的蛋白的纯化

[0041] 取适量实施例3方法进行诱导表达的重组菌培养液，4800g/min离心20min收集菌体，菌体重悬于裂解液10mL（p H7.550mM NaCl;50mM Tris-HCl;1%Triton）缓冲液中，冰浴中超声破碎细胞。将超声破碎后的样品13000r/min,4℃离心20min取上清即为粗酶液。

[0042] 由于设计的β4GalT1-pet30a和β4GalT1Mut-pet30a表达质粒表达产物N端带有6个连续的组氨酸，可以通过亲和层析柱（Ni-NTA琼脂糖凝胶）亲和纯化。首先用洗脱液平衡柱子（pH8.050mM NaCl50mM Tris-HCl）,将粗酶液负载上柱；采用5倍体积洗脱液（pH8.050mM NaCl50mM Tris-HCl10mM咪唑）进行洗脱除去杂蛋白，然后用一定量的洗脱液（pH8.050mM NaCl50mM Tris-HCl250mM咪唑）收集目的蛋白。保存目的蛋白，用于后续实验。

[0043] 实施例5纯化过后的目的蛋白，做western-blot验证目的蛋白的表达[0044] 分别取β1,4-半乳糖基转移酶1及其突变体两种初纯化目的蛋白30μL，加入5X的上样缓冲液，在100℃加热10min使其失活，采用12%的聚丙烯酰胺浓度的SDS-PAGE跑蛋白样品，浓缩胶80v电压半小时左右，分离胶100v电压2个小时左右，然后进行2个小时的转膜，使其转到硝酸纤维素膜上，电压使用150v。转膜完成后进行1-2小时的封闭。然后使用小鼠来源的抗组氨酸标签的单克隆抗体（来自Sigma公司）按照说明书的要求孵育过夜，二抗采用山羊来源的抗小鼠的抗体在室温下孵育1-2小时，最后使用DAB进行显色反应。Western-bolt图如1所示。

[0045] 实施例6

[0046] 根据Gene Bank中牛源β1,4-半乳糖基转移酶1的基因序列设计引物，引物两端带有限制性内切酶Kpn1和EcoR1的碱基序列以及保护性碱基。

[0047] P3-F:5'-GGGGTACCAAGATGAAGTTTCGGGAGCCG-3'（SEQ ID NO.7）[0048] P3-R:5'-GGAATTCCTAGCTCGGCGTCCCGATGT-3'（SEQ ID NO.8）

[0049] 从牛肝中抽提RNA，采用Takara公司的Trizol试剂盒进行RNA的抽提实验。得到的RNA进行反转录得到cDNA，反转录试剂盒来自Promega公司。

[0050] 采用Takara公司提供的PCR试剂盒，以cDNA为模板，P3-F和P3-R进行PCR扩增。PCR循环参数：预变性98℃,5min;98℃,40s；62℃，1min;72℃,1min共进行35个循环；72℃再延伸10min。

[0051] 采用Axygen公司的胶回收试剂盒将目的基因片段进行纯化。将纯化后的目的基因和空载体pet30a分别进行双酶切，限制性内切酶Kpn1和EcoR1由Thermo公司提供。分别将双酶切后的目的基因和载体pet30a进行切胶回收，然后将目的基因和载体进行常规连接反应。

[0052] 将连接产物转化大肠杆菌TOP10。将转化后的细胞涂布于含有Kana的LB琼脂平板，培养过夜。从平板上挑取菌落PCR验证，阳性克隆送样测序，得到完全正确的克隆菌株。其genbank的登录号为GI:31343557。

[0053] 抽提含有正确目的片段的菌株的质粒β’4GalT1-pet30a，抽提试剂盒由Axygen公司提供。将质粒转化进表达工程菌BL21（DE3）。

[0054] 实施例7

[0055] 根据stratagene公司的Quick-change点突变试剂盒的要求，设计如下引物：

[0056] P4-F:5'-CCTTACGTGCAGCTGTTTGGAGGTGTCTCTGCTC-3'（SEQ ID NO.9）[0057] P4-R:5'-AGACACCTCCAAACAGCTGCACGTAAGGTAGGCTA-3'（SEQ ID NO.10）[0058] PCR的过程以实施例6构建的β’4GalT1-pet30a质粒为模板，将β’4GalT1基因的868-870位碱基TAT改为CTG，即将牛源β1,4-半乳糖基转移酶1第289位酪氨酸（Tyr）突变为亮氨酸(Leu)，PCR循环参数：预变性98℃,1min;98℃,50s；60℃，50s;68℃,8min共进行18个循环；68℃再延伸10min。用限制性内切酶Dpn1消化原始质粒模板，将经限制性内切酶Dpn1消化的PCR产物转化高效率的感受态细胞。培养后挑菌提取质粒进行测序，Mut Mut即可得到含有突变基因的质粒β’4GalT1 -pet30a。抽提质粒β’4GalT1 -pet30a转化表达工程菌BL21(DE3)。

[0059] 实施例8β1,4-半乳糖基转移酶1及其突变体的诱导表达

[0060] 将经鉴定后的β’4GalT1-pet30a和β’4GalT1Mut-pet30a重组质粒转化到表达宿主E.coli BL21(DE3)中。置于37℃培养箱中培养至长成大小合适的菌落。挑取含有重组质粒的转化子分别接种至含kana(50μg/mL)的LB液体培养液，置摇床37℃，250r/min震荡培养过夜。按1%接种量（v/v）转接至新鲜LB（400mL）培养液中，37℃，250r/min振荡培养至对数期（OD600≈0.6-0.8），分别加入诱导剂IPTG至终浓度1.0mmol/L,置25℃摇床，250r/min诱导表达3h。

[0061] 实施例9目的蛋白的纯化

[0062] 取适量实施例8方法进行诱导表达的重组菌培养液，4800g/min离心20min收集菌体，菌体重悬于裂解液10mL（p H7.550mM NaCl;50mM Tris-HCl;1%Triton）缓冲液中，冰浴中超声破碎细胞。将超声破碎后的样品13000r/min,4℃离心20min取上清即为粗酶液。

[0063] 由于设计的β’4GalT1-pet30a和β’4GalT1Mut-pet30a表达质粒表达产物N端带有6个连续的组氨酸，可以通过亲和层析柱（Ni-NTA琼脂糖凝胶）亲和纯化。首先用洗脱液平衡柱子（pH8.050mM NaCl50mM Tris-HCl）,将粗酶液负载上柱；采用5倍体积洗脱液（pH8.050mM NaCl50mM Tris-HCl10mM咪唑）进行洗脱除去杂蛋白，然后用一定量的洗脱液（pH8.050mM NaCl50mM Tris-HCl250mM咪唑）收集目的蛋白。保存目的蛋白，用于后续实验。

[0064] 实施例10纯化过后的目的蛋白，做western-blot验证目的蛋白的表达[0065] 分别取β1,4-半乳糖基转移酶1及其突变体两种初纯化目的蛋白30μL，加入5X的上样缓冲液，在100℃加热10min使其失活，采用12%的聚丙烯酰胺浓度的SDS-PAGE跑蛋白样品，浓缩胶80v电压半小时左右，分离胶100v电压2个小时左右，然后进行2个小时的转膜，使其转到硝酸纤维素膜上，电压使用150v。转膜完成后进行1-2小时的封闭。然后使用小鼠来源的抗组氨酸标签的单克隆抗体（来自Sigma公司）按照说明书的要求孵育过夜，二抗采用山羊来源的抗小鼠的抗体在室温下孵育1-2小时，最后使用DAB进行显色反应。Western-bolt图如2所示。

[0066] 实施例11

[0067] 猪源及牛源的β1,4-半乳糖基转移酶1（实施例4和9制备）及其突变体的酶学性质测定一共进行8组反应：

[0068]

[0069]

[0070] 37℃反应1小时以后跑LC-MS分析结果，结果如图3所示。

[0071] 结果显示：野生型的猪源以及牛源β1,4-半乳糖基转移酶1能够产生乳糖，但不能产生乳糖类似物GalNAcβ1,4Glc；突变型的β1,4-半乳糖基转移酶1不能产生乳糖，只能产生乳糖类似物GalNAcβ1,4Glc。

[0072] 酶活检测中底物和产物的结构式如下：

[0073]

[0074]

[0075] 参考文献：

[0076] [1]Ramakrishnan,B.Qasba,P.K.Structure-based design ofbeta1,4-galactosyltransferase I(beta4Gal-T1)with equally efficient N-acetylgalactosaminyltransferase activity:point mutation broadens beta4Gal-T1donor specificity.J Biol Chem.(2002)20833-9.

[0077] [2]Van den Nieuwenhof,Ingrid M,Schiphorst,Wietske ECM,Van den Eijnden,Dirk H.The lactose analog GalNAcβ1 → 4Glc is present in bovine colostrum:Enzymatic basis for its occurrence.FEBS letters.(1999)377-380.