兰州大尾羊PPARG基因的克隆和原核表达载体的构建方法

摘要

本发明通过设计克隆PPARG基因全长cDNA的PCR引物，通过RACE技术，从绵羊尾部脂肪组织克隆绵羊PPARG基因全长cDNA，确定绵羊PPARG基因编码区cDNA序列。将目的基因定向克隆于pET32a原核表达载体中，获得pET32a（+）-PPARG重组原核表达载体，诱导表达重组PPARG蛋白。本发明生产的重组PPARG蛋白，用于绵羊前体脂肪细胞的诱导分化，为兰州大尾羊等地方绵羊遗传资源的保护和肉羊育种中优良性状的利用提供参考，具有重要的实践价值。

权利要求

1.一种兰州大尾羊PPARG基因的全长cDNA，如SEQ ID NO：7所示。

2.权利要求1所述的兰州大尾羊PPARG基因全长cDNA的编码蛋白，如SEQ ID NO：8所示。

3.一种表达载体，包含权利要求1所述的兰州大尾羊PPARG基因的全长cDNA。

4.权利要求1所述的兰州大尾羊PPARG基因全长cDNA的用途，用于绵羊前体脂肪细胞的诱导分化。

说明书

兰州大尾羊PPARG基因的克隆和原核表达载体的构建方法

技术领域

[0001] 本发明涉及动物分子生物学领域,具体涉及一种兰州大尾羊PPARG基因的克隆和原核表达载体的构建方法。

背景技术

[0002] 过氧化物 酶体增殖 物激活受 体(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)是调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员，主要表达于免疫系统和脂肪组织，是胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类药物作用的靶分子，与机体免疫、胰岛素抵抗、脂肪细胞分化关系密切。PPAR按结构分为α、β、γ三种类型，PPARG基因（γ型）是脂肪细胞分化的主要候选基因。

[0003] 1990年Issemann等首先发现这种脂肪酸样化合物，因其能被过氧化物酶体增殖剂(peroxisome proliferators,PP)激活而被命名为PP激活受体。1997年，Lehmann MJ等研究发现，PPARG在脂肪、巨噬细胞、肝、肾、肺、直肠中均有表达。哺乳动物中，PPARG在脂肪组织中表达量最高，其次为肝脏和肌肉。

[0004] 以往的研究认为脂肪细胞数量在动物出生时就已固定不变，脂肪沉积只是其体积肥大的过程。但目前研究表明脂肪细胞的分化贯穿于机体的整个生命过程，表现在两个方面，一方面是正常脂肪细胞的更新，另一方面是机体需要储备更多能量时导致脂肪细胞的分化。Chuang S研究表明，ERK（extra-cellular signal regulated protein kinase）信号通路可以诱导白细胞介素表达，使其下游PPARG被磷酸化，导致PPARG下游生脂相关的靶基因表达水平降低，从而抑制了脂肪细胞分化。2011年，Pachakkil研究表明，香草精通过激活ERK通路，上调了前体脂肪细胞中PPARG基因的表达，增加了细胞葡萄糖的摄取量，促进了脂肪细胞分化。所以，PPARG基因是脂肪代谢过程中，尤其是在脂肪细胞分化过程中起重要作用。

[0005] 兰州大尾羊是清朝同治年间由陕西大荔一带引进的同羊与兰州当地蒙古羊杂交选育而成的地方绵羊品种，具有耐粗饲、抗病能力强、饲料利用率高、适应性强、肉质鲜美等优点的优良地方绵羊品种，因其尾部脂肪过度沉积，导致尾大、脂肪充实而得名，其尾部脂肪细胞分化与其它绵羊差异显著，但是，国内外目前对于兰州大尾羊脂肪细胞分化相关基因的研究甚少，PPARG基因研究未见报道。

[0006] 因此，本发明利用RACE技术获得兰州大尾羊PPARG基因全长cDNA序列，进一步构建原核表达载体，获得重组PPARG蛋白，进一步研究PPARG基因的结构和功能，以及对绵羊脂肪细胞分化过程中的作用。

发明内容

[0007] 本发明提供兰州大尾羊PPARG基因全长cDNA序列，并构建原核表达载体获得重组PPARG蛋白，研究它的结构与功能以及对绵羊脂肪细胞分化过程中的作用。

[0008] 兰州大尾羊PPARG基因是一种调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员，与脂肪细胞分化密切相关的基因，其cDNA序列全长1774bp，其CDS区片段长1428bp，编码475个氨基酸，首次提供绵羊编码区两侧翼，分别具有5’-UTR131bp（1-131nt）和3’-UTR214bp（1560-1774nt）。

[0009] 本发明进一步提供构建绵羊PPARG基因原核表达载体并获得重组PPARG蛋白的方法。

[0010] 更具体的，本发明提供一种兰州大尾羊PPARG基因的全长cDNA，如SEQ ID NO：7所示。

[0011] 更具体的，本发明提供一种兰州大尾羊PPARG基因全长cDNA的编码蛋白，如SEQ IDNO：8所示。

[0012] 更具体的，本发明提供一种表达载体，包含上述的兰州大尾羊PPARG基因的全长cDNA。

[0013] 更具体的，本发明提供兰州大尾羊PPARG基因全长cDNA的用途，用于绵羊前体脂肪细胞的诱导分化。

附图说明

[0014] 图1：PPARG基因5’-RACE片段、3’-RACE片段和CDS片段扩增产物电泳图[0015] M1.DL2000DNAmarker;M2.1500bp DNAmarker;1.5’-RACE cDNA片段;2.3’-RACE cDNA片段.;3.CDS片段.

[0016] 图2 PPARG基因同源性分析和系统发育树

[0017] 左图：PPARG基因同源性分析结果；右图：PPARG基因系统发育树

[0018] 图3兰州大尾羊与其他物种PPARG基因序列间多序列对位排列

[0019] 黑色部分表示氨基酸序列完全相同；红色部分表示有一个以上氨基酸序列不同。

[0020] 图4重组质粒pET-32a（+）-PPARG的酶切鉴定

[0021] M1.λ-Hind Ⅲ digest;1.pDM-19T(+)-PPARG;2.pDM-19T(+)-PPARG-Hind Ⅲ/Xho Ⅰ;3.pET-32a（+）-PPARG-Hind Ⅲ/Xho Ⅰ;4.pET32a-Hind Ⅲ/Xho Ⅰ ;M2.DL2,000DNAMarker

[0022] 图5重组菌株pET-32a（+）-PPARG表达产物的SDS-PAGE分析

[0023] M1.蛋白质相对分子质量标准；1.pET-32a全细胞；2.pET-32a上清；3.pET-32a沉淀；4.pET-32a(+)-PPARG全细胞；5.pET-32a（+）-PPARG上清;6.pET-32a(+)-PPARG沉淀.[0024] 图6 MTT比色法绘制生长曲线

具体实施方式

[0025] 实施例1PPARG基因克隆

[0026] 按照SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit要求，设计克隆PPARG基因全长cDNA的嵌套PCR引物GSP1(SEQ ID NO：1)、NGSP1(SEQ ID NO：2)、GSP2(SEQ ID NO：3)和NGSP2(SEQ ID NO：4)，确定绵羊PPARG基因编码区序列，设计克隆绵羊PPARG编码区的PCR引物，上游引物CDS1(SEQ ID NO：5)，下游引物CDS2(SEQ ID NO：6);

[0027] 将克隆PPARG基因全长cDNA克隆于pET32a原核表达载体中，获得pET32a-PPARG重组载体并转入BL21感受态细胞中，对阳性克隆进行诱导表达，获得PPARG基因原核表达系统，生产重组PPARG蛋白，通过SDS-PAGE方法鉴定重组蛋白表达。

[0028] （1）实验材料：选购正在育肥的6月龄兰州大尾羊（羯羊）1只，颈静脉放血后，快速切取尾部脂肪组织，切成小块，用锡箔纸包裹后液氮速冻后带回实验室，80℃保存备用。

[0029] （2）实验过程：

[0030] 脂肪组织总RNA的提取

[0031] 由于脂肪组织含有大量油脂，RNA丰度低的特点，对RNAiso Plus试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)说明书关于脂肪组织中总RNA的提取部分操作进行了改进和完善，具体步骤如下：

[0032] ①组织研磨：将超低温冻结的150～200mg脂肪组织块直接放入预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状（无明显的可见颗粒，如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量）。

[0033] ②研磨成的粉末组织转移至离心管中，然后加入适量的RNAiso Plus（约2ml）中，把离心管置于冰浴中进行混匀，直至均浆液呈无颗粒透明状。

[0034] ③冰上静置5min，4℃12,000r/min离心10min，除去上层油脂，取中间层匀浆液转移至新的离心管中，切勿吸取沉淀。

[0035] ④在离心管中加入氯仿（约1/5的RNAiso Plus，即400μl），盖紧离心管盖，用手剧烈震荡15s（氯仿沸点低，易挥发，震荡时应小心离心管盖突然弹开）。待溶液充分乳化（无分相现象）后，在冰上静置10min。

[0036] ⑤12,000r/min4℃离心15min。

[0037] ⑥从离心机中小心取出离心管，此时均浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层）。

[0038] ⑦向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在冰上静置15min。

[0039] ⑧12,000r/min4℃离心10min。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。

[0040] ⑨弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇1ml（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，8,000r/min4℃离心5min后小心弃去乙醇（为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇）。

[0041] ⑩室温干燥沉淀5min左右（不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解），加入适量的RNAase-free水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于–80℃保存。

[0042] （3）cDNA第一链合成

[0043] cDNA第一条链的合成根据SMARTerTM RACE cDNA扩增试剂盒(clonetech公司)说明书进行操作。操作步骤如下：

[0044] ①为了所有的5′和3′race cDNA合成反应，准备足够的下列Buffer Mix，并加额外的1反应以确保足够的量。每次的cDNA合成反应总体积为10μl。混合以下试剂，短暂地离心混匀，然后直到⑦都放于冰上。

[0045]

[0046] ②在不同的PCR管中分别混合以下试剂：

[0047] 5′race cDNA的准备：2.75μlRNA和1.0μl5′-CDS Primer A；

[0048] 3′race cDNA的准备：3.75μlRNA和1.0μl3′-CDS Primer A。

[0049] ③加无菌水到离心管中，使5′RACE的最终体积达到3.75μl，3′RACE的最终体积达到4.75μl。

[0050] ④短暂离心混匀混合物。

[0051] ⑤把离心管放于72℃3min，然后将离心管冷却至42℃2min。冷却后，在14000r/min，离心10s，以收集管底的物质。

[0052] ⑥5′RACE cDNA合成反应，在每个PCR管中再加1μl的SMARTer IIA oligo。

[0053] ⑦为所有的5′和3′race cDNA合成反应，在室温条件下混合以下试剂，准备足够的Master Mix。

[0054]

[0055] ⑧加5.25μl的MasterMix到来自Step5(3′RACE cDNA)和Step6(5′RACE cDNA)的RNA中，使总体积达到10μl。

[0056] ⑨用移液器轻轻地混合PCR管中的物质，然后短暂离心以收集管底的物质。

[0057] ⑩42℃，90min；70℃，10min后每管加入25μlTricine-EDTA Buffer稀释第一链反应的产物，–20℃保存。

[0058] （4）cDNA5′末端快速扩增—5′RACE

[0059] 根据SMARTerTM RACE cDNA扩增试剂盒中5′-full race试剂盒说明书进行，具体方法如下：

[0060] ①准备足够的Master Mix用于所有的PCR反应，外加1额外的反应以确保足够的量。每次的反应总体积是50μlPCR反应。混合以下试剂：

[0061]

[0062] ②短暂地离心混匀。

[0063] ③PCR反应体系：

[0064]

[0065] PCR反应程序：

[0066] 94℃预变性3min；94℃变性30s，72℃复性延伸2min，5个循环：94℃变性30s，70℃复性30s，72℃延伸2min，5个循环；94℃变性30s，68℃复性30s，72℃延伸2min，25个循环；72℃延伸10min。

[0067] ④如果③的不明显条带或产生了拖尾，以100倍稀释的③PCR产物5μl代替RACE cDNAs，NUP引物1μl和巢式NGSP2(SEQ ID NO：4)1μl为引物，做巢式PCR反应。

[0068] 反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，68℃复性30s，72℃延伸2min，25个循环；72℃延伸10min。

[0069] （5）cDNA3′末端快速扩增—3′RACE

[0070] ①准备足够的Master Mix用于所有的PCR反应，外加1额外的反应以确保足够的量。每次的反应总体积是50μlPCR反应。混合以下试剂：

[0071]

[0072] ②混匀试剂混合物，然后在手掌离心机做短暂地离心以混匀物质。

[0073] ③PCR反应体系：

[0074]

[0075] PCR反应程序：

[0076] 94℃预变性3min；94℃变性30s，72℃复性延伸2min，5个循环：94℃变性30s，70℃复性30s，72℃延伸2min，5个循环；94℃变性30s，68℃复性30s，72℃延伸2min，25个循环；72℃延伸10min。

[0077] ④如果③的不明显条带或产生了拖尾，以100倍稀释的③PCR产物5μl代替RACE cDNAs，NUP引物1μl和巢式NGSP1(SEQ ID NO：2)1μl为引物，做巢式PCR反应。

[0078] 反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，68℃复性30s，72℃延伸2min，25个循环；72℃延伸10min。

[0079] 用CDS区引物1(SEQ ID NO：5)和引物2(SEQ ID NO：6)按常规方法进行RT-PCR扩增。反应结束后各取3′-RACE PCR产物、5′-RACE PCR产物和CDS区PCR产物5.0μL，用12g·L-1琼脂糖凝胶电泳(见图1)。分别将3′-RACE cDNA、5′-RACE cDNA和CDS区PCR产物经DNA凝胶回收试剂盒进行回收和纯化，连接至pDM-19T载体(也可选用其他可用测序用载体)，获得质粒pDM-19T-3′-RACE cDNA、pDM-19T-5′-RACEcDNA和pDM-19T-PPARG。
送上海生工生物工程公司测序。经序列拼接获得全长cDNA序列(如SEQ ID NO：7所示)。
并与其他物种PPARG基因同源性分析(见图2、3)。

[0080] （7）原核表达载体的构建

[0081] 用Hind Ⅲ和XhoⅠ对质粒pDM-19T-PPARG进行酶切，将目的基因PPARG与同样酶切的载体pET32a连接。将构建的表达载体pET32a（+）-PPARG酶切鉴定后热转化至E.coli Competent Cells BL21，涂布平板，37℃过夜培养。挑选阳性菌落，37℃培养过夜再转接到新鲜培养基中，培养至OD600nm值约为0.6,添加IPTG进行诱导剂，37℃培养4h。集菌后，1.0OD相当的菌体加入160ulPBS，悬浊后进行超声波破碎，对菌体破碎液进行离心，取各抽提液（全蛋白、上清、沉淀）8ul，进行SDS-PAGE电泳鉴定。(见图4)

[0082] （8）重组蛋白的纯化

[0083] 取诱导表达72ｈ后的菌液离心，12000r·min-1离心10min，先用超滤管将上清进行浓缩，将浓缩液上样至ＮｉＮＴＡ树脂，用缓冲液和洗脱液进行洗脱，将洗脱下的目的蛋白放入透析袋中，在500mmol·Ｌ-1Ｔris（pＨ7.6）中透析过夜，4℃下用聚乙二醇20000浓缩。最后取30μL样品进行SDS-PAGE检测，并测定蛋白含量。(见图5，SEQ ID NO：8)[0084] 实施例2功能验证实验

[0085] 材料与方法：

[0086] DMEM/F12培养液：称取15.60gDMEM/F12(Gibco)，3.50g NaHCO3，10mL胎牛血清（民海生物），蒸馏水定容至IL。不加入胎牛血清即为无血清培养液。

[0087] DMEM/F12+PPARG重组蛋白培养液：称取50mg PPARG重组蛋白加入到10mlDMEM/F12培养液。

[0088] 红细胞裂解液：8.24gNH4Cl，0.70g KHCO3，29.22mgEDTA，蒸馏水定容至1L。

[0089] 胶原酶消化液：0.10gI型胶原酶(Sigma)和2.00g牛血清白蛋白溶于100mL无血清培养液中。

[0090] 胰蛋白酶消化液：称取0.25g胰蛋白酶溶于100mL的无血清培养液中。上述溶液均调整pH至7.2～7.4，0.22μm微孔滤膜正压过滤除菌，分装后置-20℃保存。

[0091] 临床检查无异常的新生1日龄兰州大尾羊，颈部放血致死，无菌条件下取肾及肾3
周脂肪组织，低温运输，1h送至实验室进行试验。将脂肪组织处理成1mm左右的小块，转移至含有玻璃珠的25mL三角烧瓶中，加入1mg/mL的I型胶原酶消化液，置于37℃水浴中消化
50min（每5min振荡1次），过孔径为200目的钢筛，1000r/min离心5min弃上清，加入红细胞裂解液，吹打均匀，室温静置10min，1000r/min离心5min，弃上清液，分别用DMEM/F12培养液（对照组）和DMEM/F12+PPARG重组蛋白培养液（试验组）重悬，1000r/min离心5min，弃上清液，加入培养液并吹打均匀，即为绵羊前体脂肪细胞。台盼蓝染色计数，按5×104个/mL的浓度接种于96孔和24孔培养板中，37℃，5%CO2培养箱中培养，每2d换液1次，原代培养的前体脂肪细胞达到80%～90%汇合时，用胰蛋白酶消化液消化0.5～3.0min，用含血清培养液终止消化，按1：3的比例进行传代培养。传代培养过程中，每2d更换1次培养液，直至细胞汇合并铺满整个培养皿后，再重复上述操作。

[0092] 将原代细胞悬液按每孔103～104个细胞接种于96孔培养板中(0d)，白第1天起，每隔2d在同一时间取8孔，在每孔中加20_uL噻唑蓝溶液（MTT，5mg／mL、PBS配制），继续培养4h后终止培养，弃去孔内溶液后每孔加150_uL二甲基亚砜(DMSO)，避光震荡10min，在酶联检测仪上测定各孔OD490nm值，以时间为横坐标，OD490nm值（表示细胞相对数量）为纵坐标绘制生长曲线。

[0093] 结果：

[0094] 1.前期脂肪细胞形态学观察结果

[0095] 对照组：绵羊前体脂肪细胞为网形，3h后细胞开始贴壁，2d细胞呈梭形纤维状、三角形或不规则形状，4d形成单层汇合，部分细胞内出现微小脂滴，6d分化的细胞增多，并可见散在分布的大小不等的脂滴，9d脂滴逐渐融合，细胞核位于边缘，之后细胞停止生长，脂滴逐渐变得灰暗，部分细胞脱落，浮于培养液内。

[0096] 实验组与对照组相比：前2天无明显差异，但3d时已形成单层汇合，部分细胞内出现微小脂滴，5d时分化的细胞增多，并可见散在分布的大小不等的脂滴，7d脂滴逐渐融合，细胞核位于边缘，之后细胞停止生长，脂滴逐渐变得灰暗，部分细胞脱落，浮于培养液内。

[0097] 表明：添加PPARG重组蛋白可明显加快原代前期脂肪细胞的生长和分化进程。

[0098] 2.传代培养情况

[0099] 实验组与对照组细胞传代后2h内贴壁，传代细胞与原代细胞形态一致，增殖速度较原代细胞明显增快，2～3d即可达到单层汇合，但实验组还是明显快于对照组。对照组再次传代后细胞白主分化为脂肪细胞的能力逐渐减弱，4代后，几乎没有细胞分化为脂肪细胞，而实验组传至6代时任能分化为脂肪细胞。说明：PPARG重组蛋白具有促进绵羊脂肪细胞分化的生物学功能。

[0100] 3MTT比色法绘制生长曲线

[0101] 生长曲线图实验组和对照组均呈“S”型，试验组3-7d、对照组3-9d为指数生长期，之后进入平台期。相比试验组培增时间明显缩短。(见图6)