具有优异广谱抗微生物活性和高选择性的阳离子肽多糖

摘要

本发明提供式I的阳离子肽多糖，其具有细菌肽聚糖模拟结构，并且显示突出的针对临床上重要的细菌和真菌的广谱活性。这些化合物与微生物细胞壁组分的结构亲和性促进其通过细胞质膜，导致优异的抗微生物活性并显示高选择性。

权利要求

1.式I的化合物：

或其药用盐，其中：

各个R独立地选自氢，取代或未取代的烷基，取代或未取代的烯基，取代或未取代的炔基，取代或未取代的环烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳烷基，取代或未取代的杂芳基，取代或未取代的杂芳烷基，(CH2)jOR1，(CH2)jC(O)R1，(CH2)jC(O)OR1，(CH2)jOC(O)R1，(CH2)jNR2R3，(CH2)jC(O)NR2R3，(CH2)jOC(O)NR2R3，(CH2)jC(NR4)NR2R3，(CH2)jNR4C(O)R1，(CH2)jNR4C(O)OR1，(CH2)jNR4C(O)NR2R3，(CH2)jNR4C(O)NR2R3，(CH2)jNR4C(NH)NR2R3，(CH2)jSH，(CH2)jS(O)kCH3，(CH2)jNR4S(O)kCH3，(CH2)jS(O)kNR2R3和(CH2)jNR4S(O)kNR2R3，其中j是独立选自0至6的整数，k是独立选自0至2的整数，并且其中各个R基团任选独立地被1-3个取代基取代，各个取代基独立地选自烷基，烯基，炔基，环烷基，全氟烷基，氨基，氰基，卤素，羟基，硝基，芳基，芳烷基，杂环，杂芳基，和杂芳烷基；

R1，R2，R3和R4各自独立地选自氢，取代或未取代的烷基，取代或未取代的烯基，取代或未取代的炔基，取代或未取代的环烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳烷基，取代或未取代的杂芳基，取代或未取代的杂芳烷基，其中各个R1，R2，R3和R4基团任选独立地被1-

3个取代基取代，各个取代基独立地选自烷基，烯基，炔基，环烷基，全氟烷基，氨基，氰基，卤素，羟基，硝基，芳基，芳烷基，杂环，杂芳基，和杂芳烷基；

m是独立地选自1至100,000的整数；

n是独立地选自1至100,000的整数；并且

x是独立地选自1至5,000的整数。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中：

R独立地选自取代或未取代的(C1-C6)烷基，取代或未取代的(C2-C6)烯基，取代或未取代的(C2-C6)炔基，取代或未取代的(C3-C8)环烷基，取代或未取代的(C6-C10)芳基，取代或未取代的(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基，取代或未取代的(C3-C10)杂芳基，取代或未取代的(C3-C10)杂芳基(C1-C6)烷基，(CH2)OR1，(CH2)C(O)R1，(CH2)C(O)OR1，(CH2)OC(O)R1，(CH2)NR2R3，(CH2)C(O)NR2R3，(CH2)OC(O)NR2R3，(CH2)C(NR4)NR2R3，(CH2)NR4C(O)R1，(CH2)NR4C(O)OR1，(CH2)NR4C(O)NR2R3，(CH2)NR4C(O)NR2R3，(CH2)NR4C(NH)NR2R3，(CH2)SH，(CH2)S(O)kCH3，(CH2)NR4S(O)kCH3，(CH2)S(O)kNR2R3和(CH2)NR4S(O)kNR2R3；并且R1，R2，R3和R4各自独立地选自氢，取代或未取代的(C1-C6)烷基，取代或未取代的(C2-C6)烯基，取代或未取代的(C2-C6)炔基，取代或未取代的(C3-C8)环烷基，取代或未取代的(C6-C10)芳基，取代或未取代的(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基，取代或未取代的(C3-C10)杂芳基，和取代或未取代的(C3-C10)杂芳基(C1-C6)烷基。

3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中：

R独立地选自(C1-C6)烷基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C3-C8)环烷基，(C6-C10)芳基，(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基，杂(C3-C10)芳基，杂(C3-C10)芳基(C1-C6)烷基，OR1，C(O)R1，C(O)OR1，OC(O)R1，NR2R3，C(O)NR2R3，OC(O)NR2R3，C(NR4)NR2R3，NR4C(O)R1，NR4C(O)OR1，NR4C(O)NR2R3，NR4C(O)NR2R3，NR4C(NH)NR2R3，SH，S(O)kCH3，NR4S(O)kCH3，S(O)kNR2R3和NR4S(O)kNR2R3；

并且

R1，R2，R3和R4各自独立地选自氢，(C1-C6)烷基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C3-C8)环烷基，(C6-C10)芳基，(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基，(C3-C10)杂芳基，和(C3-C10)杂芳基(C1-C6)烷基。

4.根据权利要求1或2所述的化合物，其中R独立地选自CH3，CH2CH3，CH2CH2CH3，CH(CH3)2，CH2CH2CH2CH3，CH(CH3)CH2CH3，CH2CH(CH3)2，C6H5，CH2C6H5，CH2C6H4(对-OH)，CH2C6H5，CH2OH，CH2CH(OH)CH3，CH2C(O)NH2，(CH2)2C(O)NH2，(CH2)4NH2，(CH2)3NHC(NH)NH2，CH2(C3H2N2)，CH2(C8H6N)，CH2SH和CH2SCH3。

5.根据权利要求1或2所述的化合物，其中所述式I的化合物选自：

6.药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至5中任一项所述的式I的化合物，和药用载体。

7.用于防治通过微生物的感染的治疗组合物，所述组合物包含治疗有效量的根据权利要求1至5中任一项所述的式I的化合物和药用载体。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述微生物选自细菌、真菌、病毒和原生动物。

9.治疗有效量的根据权利要求6所述的药物组合物在制备用于治疗或防止由微生物引起的受试者的感染的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其中所述微生物选自革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。

11.对物品的表面消毒的方法，所述方法包括向所述表面施加有效量的组合物的步骤，其中所述组合物包含根据权利要求1至5中任一项所述的式I的化合物。

12.消毒液，所述消毒液包含根据权利要求1至5中任一项所述的式I的化合物，和任选的可接受的载体。

13.制备式I的化合物或其药用盐的方法，

所述方法包括以下步骤：

a)将式II的化合物与式III的化合物反应以提供式IV的化合物；和b)将所述式IV的化合物去保护从而提供所述式I的化合物：其中：

各个PG是保护基；

各个R独立地选自氢，取代或未取代的烷基，取代或未取代的烯基，取代或未取代的炔基，取代或未取代的环烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳烷基，取代或未取代的杂芳基，取代或未取代的杂芳烷基，(CH2)jOR1，(CH2)jC(O)R1，(CH2)jC(O)OR1，(CH2)jOC(O)R1，(CH2)jNR2R3，(CH2)jC(O)NR2R3，(CH2)jOC(O)NR2R3，(CH2)jC(NR4)NR2R3，(CH2)jNR4C(O)R1，(CH2)jNR4C(O)OR1，(CH2)jNR4C(O)NR2R3，(CH2)jNR4C(O)NR2R3，(CH2)jNR4C(NH)NR2R3，(CH2)jSH，

4 2 3 4 2 3

(CH2)jS(O)kCH3，(CH2)jNRS(O)kCH3，(CH2)jS(O)kNRR 和(CH2)jNRS(O)kNRR ，其中j是独立选自0至6的整数，k是独立选自0至2的整数，并且其中各个R基团任选独立地被1-3个取代基取代，各个取代基独立地选自烷基，烯基，炔基，环烷基，全氟烷基，氨基，氰基，卤素，羟基，硝基，芳基，芳烷基，杂环，杂芳基，和杂芳烷基；

1 2 3 4

R，R ，R和R各自独立地选自氢，取代或未取代的烷基，取代或未取代的烯基，取代或未取代的炔基，取代或未取代的环烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳烷基，取代或未取代的杂芳基，取代或未取代的杂芳烷基，其中各个R1，R2，R3和R4基团任选独立地被1-

3个取代基取代，各个取代基独立地选自烷基，烯基，炔基，环烷基，全氟烷基，氨基，氰基，卤素，羟基，硝基，芳基，芳烷基，杂环，杂芳基，和杂芳烷基；

m是独立地选自1至100,000的整数；

n是独立地选自1至100,000的整数；并且

x是独立地选自1至5,000的整数。

14.根据权利要求13所述的方法，其中：

PG是三苯基甲基保护基；

R独立地选自取代或未取代的(C1-C6)烷基，取代或未取代的(C2-C6)烯基，取代或未取代的(C2-C6)炔基，取代或未取代的(C3-C8)环烷基，取代或未取代的(C6-C10)芳基，取代或未取代的(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基，取代或未取代的(C3-C10)杂芳基，取代或未取代的(C3-C10)杂芳基(C1-C6)烷基，(CH2)OR1，(CH2)C(O)R1，(CH2)C(O)OR1，(CH2)OC(O)R1，(CH2)NR2R3，(CH2)C(O)NR2R3，(CH2)OC(O)NR2R3，(CH2)C(NR4)NR2R3，(CH2)NR4C(O)R1，(CH2)NR4C(O)OR1，(CH2)NR4C(O)NR2R3，(CH2)NR4C(O)NR2R3，(CH2)NR4C(NH)NR2R3，(CH2)SH，(CH2)S(O)kCH3，(CH2)NR4S(O)kCH3，(CH2)S(O)kNR2R3和(CH2)NR4S(O)kNR2R3；并且R1，R2，R3和R4各自独立地选自氢，取代或未取代的(C1-C6)烷基，取代或未取代的(C2-C6)烯基，取代或未取代的(C2-C6)炔基，取代或未取代的(C3-C8)环烷基，取代或未取代的(C6-C10)芳基，取代或未取代的(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基，取代或未取代的(C3-C10)杂芳基，和取代或未取代的(C3-C10)杂芳基(C1-C6)烷基。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中：

R独立地选自(C1-C6)烷基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C3-C8)环烷基，(C6-C10)芳基，

1 1

(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基，杂(C3-C10)芳基，杂(C3-C10)芳基(C1-C6)烷基，OR ，C(O)R ，C(O)OR1，OC(O)R1，NR2R3，C(O)NR2R3，OC(O)NR2R3，C(NR4)NR2R3，NR4C(O)R1，NR4C(O)OR1，NR4C(O)NR2R3，NR4C(O)NR2R3，NR4C(NH)NR2R3，SH，S(O)kCH3，NR4S(O)kCH3，S(O)kNR2R3和NR4S(O)kNR2R3；

并且

1 2 3 4

R ，R ，R 和R 各自独立地选自氢，(C1-C6)烷基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C3-C8)环烷基，(C6-C10)芳基，(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基，(C3-C10)杂芳基，和(C3-C10)杂芳基(C1-C6)烷基。

16.根据权利要求13或14所述的方法，其中R独立地选自CH3，CH2CH3，CH2CH2CH3，CH(CH3)2，CH2CH2CH2CH3，CH(CH3)CH2CH3，CH2CH(CH3)2，C6H5，CH2C6H5，CH2C6H4(对-OH)，CH2C6H5，CH2OH，CH2CH(OH)CH3，CH2C(O)NH2，(CH2)2C(O)NH2，(CH2)4NH2，(CH2)3NHC(NH)NH2，CH2(C3H2N2)，CH2(C8H6N)，CH2SH和CH2SCH3。

17.根据权利要求13所述的方法，其中所述式I的化合物选自：

18.权利要求1-5任一项的式I的化合物在制备用于防治、消毒和/或处理微生物的药物中的应用。

说明书

具有优异广谱抗微生物活性和高选择性的阳离子肽多糖

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请依据35U.S.C.§119(e)要求于2011年10月3日提交的名称为“阳离子肽多糖显示优异广谱抗微生物活性和显示高选择性(CATIONIC PEPTIDOPOLYSACCHARIDES SHOW 
EXCELLENT BROAD-SPECTRUM ANTI-MICROBIAL ACTIVITIES AND RECORD HIGH 
SELECTIVITY)”的美国临时申请号61/542,321的优先权，所述申请的整个公开内容以其整
体通过引用结合于此用于所有目的。
发明领域

[0003] 本发明涉及微生物学领域，并且更具体地，涉及杀灭或抑制微生物如细菌、真菌和原生动物的生长的抗微生物剂的领域。

[0004] 发明背景

[0005] 对常规抗生素的微生物抗性的出现是对人类公众健康的严峻挑战并且已导致势不可挡的对新的抗微生物剂的需求。与靶向微生物代谢的常规抗生素不同，天然抗微生物
肽(AMP)通过破坏微生物的细胞质膜而发挥其抗微生物活性。据信，这种抗微生物活性模式
相比于代谢靶向较不易于发展抗性。尽管天然AMP高度有效，但是它们的应用受其高毒性、
较差蛋白水解稳定性和药动学，以及高生产成本的限制。同样靶向病原体细胞质膜的阳离
子AMP及其类似物提供用于降低病原体抗性的可能性的有希望的途径。对于所有有效的抗
微生物剂，微生物细胞质膜由需要被渗透的作为必然屏障的细胞壁包围。然而，之前的阳离
子抗微生物聚合物设计通常没有考虑抗微生物剂与微生物细胞壁的结构亲和性。因此，本
领域仍然需要设计、合成和测试新的作用于膜的无毒、生物相容且廉价制备的阳离子AMP及
其类似物。

[0006] 发明概述

[0007] 本发明通过提供新且改进的化合物、组合物、以及用于防治、消毒和处理微生物的方法而解决了这些需要。

[0008] 因此，在一个实施方案中，本发明提供式I的化合物:

[0009]

[0010] 或其药用盐，其中：

[0011] 各个R独立地选自氢，取代或未取代的烷基，取代或未取代的烯基，取代或未取代的炔基，取代或未取代的环烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳烷基，取代或未
取代的杂芳基，取代或未取代的杂芳烷基，(CH2)jOR1，(CH2)jC(O)R1，(CH2)jC(O)OR1，(CH2)jOC(O)R1，(CH2)jNR2R3，(CH2)jC(O)NR2R3，(CH2)jOC(O)NR2R3，(CH2)jC(NR4)NR2R3，(CH2)jNR4C(O)R1，(CH2)jNR4C(O)OR1，(CH2)jNR4C(O)NR2R3，(CH2)jNR4C(O)NR2R3，(CH2)jNR4C(NH)NR2R3，(CH2)jSH，(CH2)jS(O)kCH3，(CH2)jNR4S(O)kCH3，(CH2)jS(O)kNR2R3和(CH2)jNR4S(O)kNR2R3，其中j是独立选自0至6的整数，k是独立选自0至2的整数，并且其中各个R基团任选独立地被1-3个取代
基取代，各个取代基独立地选自烷基，烯基，炔基，环烷基，全氟烷基，氨基，氰基，卤素，羟
基，硝基，芳基，芳烷基，杂环，杂芳基，和杂芳烷基；

[0012] R1，R2，R3和R4各自独立地选自氢，取代或未取代的烷基，取代或未取代的烯基，取代或未取代的炔基，取代或未取代的环烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳烷
基，取代或未取代的杂芳基，取代或未取代的杂芳烷基，其中各个R1，R2，R3和R4基团任选独
立地被1-3个取代基取代，各个取代基独立地选自烷基，烯基，炔基，环烷基，全氟烷基，氨
基，氰基，卤素，羟基，硝基，芳基，芳烷基，杂环，杂芳基，和杂芳烷基；

[0013] m是独立地选自1至100,000的整数；

[0014] n是独立地选自1至100,000的整数；并且

[0015] x是独立地选自1至5,000的整数。

[0016] 在另一个实施方案中，本发明提供药物组合物，所述药物组合物包含式I的化合物和药用载体。

[0017] 在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗组合物，其用于防治通过微生物的感染，所述组合物包含治疗有效量的所述式I的化合物和药用载体。

[0018] 在另一个实施方案中，本发明提供用于防治微生物的方法，所述方法是通过施用治疗有效量的组合物，其中所述组合物包含所述式I的化合物和可接受的载体。

[0019] 在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗有需要的受试者或预防由微生物引起的受试者的感染的方法，所述方法是通过施用治疗有效量的所述式I的化合物的药物组合
物和药用载体。

[0020] 在另一个实施方案中，本发明提供用于对物品的表面消毒的方法，其是通过向所述表面施加有效量的组合物，其中所述组合物包含所述式I的化合物。

[0021] 在另一个实施方案中，本发明提供一种消毒液，所述消毒液包含所述式I的化合物，和任选的可接受的载体。

[0022] 在另一个实施方案中，本发明提供用于制备式I的化合物的方法。

[0023] 在另一个实施方案中，本发明提供式I的化合物，其通过本文中公开的方法制备。

[0024] 附图描述

[0025] 图1示出了阳离子肽多糖(脱乙酰壳多糖-接枝-多肽)(R=Lys,Phe等侧链)和细菌细胞壁肽聚糖(R=Ala,Glu,Lys等侧链)的化学结构。

[0026] 图2示出了所提出的阳离子肽多糖对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的作用模式。

[0027] 图3示出了各种病原体细胞在用CS-g-K16处理之前(左)和处理后(右)的形态学。

[0028] 图4示出了以下各项的存活/死亡(LIVE/DEAD)细菌生存力测定：(a)大肠杆菌(E.coli)对照；和(b)用CS-g-K16处理的大肠杆菌。

[0029] 图5示出了：(图5a)来自用CS-g-K16处理的大肠杆菌的膜电势敏感染料DiSC3(5)泄漏；和(图5b)在具有0μM、5μM和500μM小单层脂质体(POPC/POPG4:1)的20mM磷酸钠缓冲液中
的CS-g-K16的CD谱。

[0030] 图6示出了来自用CS-g-K16处理的金黄色葡萄球菌(S.aureus)的膜电势敏感染料DiSC3(5)泄漏。

[0031] 图7示出了以下各项的MTT：(图7a)在一系列浓度的CS-g-K16中培养1h的SMC(p>0.05，无显著差异)；(图7b)用100μg ml-1CS-g-K16培养1至5天的SMC。在以下各项中温育6h
后，SMC与大肠杆菌的共培养：(图7c)在没有抗生素和CS-g-K16的培养基中，细菌生长良好但
SMC脱离培养皿并且变成圆形；(图7d)在具有100μg ml-1CS-g-K16的培养基中，细菌被抑制
并且SMC生长良好。

[0032] 实施方案详述

[0033] 定义

[0034] 除非另有定义，关于本发明使用的科学和技术术语应具有由本领域普通技术人员所通常理解的含义。而且，除非上下文另有要求，单数术语包括复数并且复数术语应包括单
数。一般地，关于本文中描述的细胞和组织培养、分子生物学、以及蛋白质和寡核苷酸或多
核苷酸化学和杂交使用的命名以及技术是熟知的且在本领域常用的那些。标准技术用于重
组DNA、寡核苷酸合成，以及组织培养和转化(例如，电穿孔，脂转染)。酶反应和纯化技术根
据制造商说明或如本领域通常完成的那样或如本文所述进行。关于分析化学、合成有机化
学以及本文中描述的医药和药物化学使用的命名、以及实验室程序和技术是熟知的且本领
域常用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送，以及患者治疗。

[0035] 还利用以下术语、定义和缩写：

[0036] 术语“烷基”，以其自身或作为另一取代基的一部分，除非另有说明，是指直链(即未支化的)或支链，或环状烃基，或其组合，其可以是完全饱和的、单或多不饱和的，并且可
以包括二价或多价基团，具有指定的碳原子数(即C1-C10是指一至十个碳)。饱和烃基的实例
包括但不限于基团如甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，叔丁基，异丁基，仲丁基，环己基，(环己基)甲基，环丙基甲基，例如以下各项的同系物或异构体，正戊基，正己基，正庚基，正
辛基等。不饱和烷基是具有一个或多个双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括但不限
于乙烯基，2-丙烯基，丁烯基，2-异戊烯基，2-(丁二烯基)，2,4-戊二烯基，3-(1,4-戊二烯
基)，乙炔基，1-和3-丙炔基，3-丁炔基，以及更高级同系物和异构体。局限于烃基的烷基称
为“同型烷基(homoalkyl)”。

[0037] 本文对于基团、取代基和范围所列的具体值用于举例说明，它们不排除其他定义的值或在对基团和取代基定义的范围内的其他值。例如，“烷基”可以是甲基，乙基，丙基，异
丙基，丁基异丁基，仲丁基，戊基，3-戊基，或己基；环烷基可以是环丙基，环丁基，环戊基，或环己基；“-O(C1-C6)烷基(烷氧基)”可以是甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基，丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基，戊氧基，3-戊氧基，或己氧基。

[0038] 术语“亚烷基”，以其自身或作为另一取代基的一部分，是指衍生自烷基的二价基团，作为例示但不限于–CH2CH2CH2CH2-，-CH2CH=CHCH2-，-CH2CH=CCH2-，-CH2CH2CH(CH2CH2CH3)CH2-。典型地，烷基(或亚烷基)具有1至24个碳原子，其包括具有10个以下碳原子的那些基
团。“低级烷基”或“低级亚烷基”是较短链的烷基或亚烷基，一般具有8个以下的碳原子。

[0039] 术语“烷基，烷氧基，烯基，炔基”等是指直链和支链基团二者，但提及单个基团如“丙基”包括直链基团，支链异构体如“异丙基”被具体提及。

[0040] 术语“杂烷基”，以其自身或与另一个术语结合，除非另有说明，是指稳定的直链或支链、或环状烃基，或其组合，其由至少一个碳原子和至少一个杂原子组成，所述杂原子选
自由O，N，P，Si和S组成的组，并且其中氮、磷和硫原子可以任选地被氧化并且氮杂原子可以
任选地被季铵化。杂原子O，N，P和S及Si可以位于杂烷基的任何内部位置或者是在烷基与分
子的剩余部分连接的位置处。实例包括但不限于-CH2-CH2-O-CH3，-CH2-CH2-NH-CH3，-CH2-
CH2-N(CH3)-CH3，-CH2-S-CH2-CH3，-CH2-CH2，-S(O)-CH3，-CH2-CH2-S(O)2-CH3，-CH=CH-O-CH3，-Si(CH3)3，-CH2-CH=N-OCH3，-CH=CH-N(CH3)-CH3，O-CH3，-O-CH2-CH3，和-CN。多至两个或三个杂原子可以是连续的，如，例如，-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“杂亚烷基”，以其自身或作为另一取代基的一部分，是指衍生自杂烷基的二价基团，作为例示但不限于-
CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烷基，杂原子也可以占据链末端中
的一端或两端(例如，亚烷基氧代，亚烷基二氧代，亚烷基氨基，亚烷基二氨基等)。仍进一步
地，对于亚烷基和杂亚烷基连接基团，没有通过其中撰写连接基团的化学式的方向暗示连
接基团的定向。例如，式-C(O)OR’-包括-C(O)OR’-和-R’OC(O)-二者。如上所述，如本文使用
的，杂烷基包括通过杂原子连接至分子的剩余部分的那些基团，如-C(O)R’，-C(O)NR’，-NR’
R’，-OR’，-SR’，和/或-SO2R’。在叙述“杂烷基”，接着叙述具体杂烷基，如-NR’R’’等的情况下，应理解，术语杂烷基和-NR’R’’不是多余的或者相互排他的。相反，叙述具体的杂烷基以
更清楚。因此，术语“杂烷基”在本文中不应解释为排除具体的杂烷基，如-NR’R’’等。

[0041] 术语“环烷基”和“杂环烷基”，以其自身或结合其他术语，除非另有说明，分别是指“烷基”和“杂烷基”的环状形式。另外，对于杂环烷基，杂原子可以占据该杂环连接至分子剩
余部分的位置。环烷基的实例包括但不限于环戊基，环己基，1-环己烯基，3-环己烯基，环庚
基等。杂环烷基的实例包括但不限于1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)，1-哌啶基，2-哌啶基，3-哌
啶基，4-吗啉基，3-吗啉基，四氢呋喃-2-基，四氢呋喃-3-基，四氢噻吩-2-基，四氢噻吩-3-
基，1-哌嗪基，2-哌嗪基等。术语“环亚烷基”和“杂环亚烷基”分别是指环烷基和杂环烷基的
二价衍生物。

[0042] 更具体地，术语“烷基”是指1至6个碳原子的支化或未支化的饱和烃基，如甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，叔丁基，戊基等。本文中烷基含有1至6个碳原子，如，例如，甲基，乙基等。如本文中使用的，术语“烷基”也包括术语“环烷基”，其是指三至八个(包括三个、五个或六个)碳原子的环状烷基。如本文中使用的，术语“环亚烷基”是指二价环状
亚烷基，典型地是3-，5-，6-或8-元环。

[0043] 如本文中使用的，术语“烷氧基”是指通过单个、末端醚键结合的烷基，即烷氧基可以定义为-OR，其中R是如本文所定义的烷基。“低级烷氧基”是指含有1至6个碳原子的烷氧
基。

[0044] 除非另有说明，术语“芳基”是指多不饱和的、芳族烃取代基，其可以是单个环或稠合在一起或共价连接的多个环（1至3个环)。术语“杂芳基”是指含有一至四个选自N、O和S的
杂原子（在多个环的情况下，在各个单独环中)的芳基(或环)，其中氮和硫原子任选被氧化，
并且氮原子任选被季铵化。杂芳基可以通过碳或杂原子连接至分子的剩余部分。芳基和杂
芳基的非限制实例包括苯基，1-萘基，2-萘基，4-联苯，1-吡咯基(1-pynolyl)，2-吡咯基，3-
吡咯基，3-吡唑基，2-咪唑基，4-咪唑基，吡嗪基，2- 唑基，4- 唑基，2-苯基-4- 唑基，
5- 唑基，3-异 唑基，4-异 唑基，5-异 唑基，2-噻唑基，4-噻唑基，5-噻唑基，2-呋喃
基，3-呋喃基，2-噻吩基，3-噻吩基，2-吡啶基，3-吡啶基，4-吡啶基，4-嘧啶基，5-苯并噻唑
基，嘌呤基，2-苯并咪唑基，5-吲哚基，1-异喹啉基，5-异喹啉基，2-喹喔啉基，5-喹喔啉基，
3-喹啉基，和6-喹啉基。用于上述芳基和杂芳基环系统中各个的取代基选自以下描述的可
接受取代基的组。术语“亚芳基”和“亚杂芳基”分别是指芳基和杂芳基的二价基团。

[0045] 为了简便起见，当联合其他术语使用时(例如，芳基氧代，芳基硫氧代，芳烷基)，术语“芳基”包括如上所定义的芳基和杂芳基环二者。因此，术语“芳烷基”意图包括其中芳基
连接至烷基的那些基团(例如，苄基，苯乙基，吡啶基甲基等)，所述烷基包括其中碳原子(例
如，亚甲基)已被例如氧原子替代的那些烷基(例如，苯氧基甲基，2-吡啶基氧基甲基，3-(1-
萘基氧基)丙基等)。然而，如本文使用的，术语“卤代芳基”意图涵盖被一个或多个卤素取代
的芳基。

[0046] 如本文使用的，术语“芳基”是指芳族碳环，典型地6或10元，其中至少一个环是芳族的。例如，“芳基”是指苯基或其中至少一个环是芳族的具有约九至十个环原子的邻位稠
合的二环碳环基。

[0047] “杂芳基”涵盖经由含有五或六个由碳和一至四个杂原子组成的环原子的单环芳族环的环碳连接的基团，其中所述杂原子各自独立地可以是非过氧化物氧、硫和N(X)，其中
X不存在或是H，O，(C1-C4)烷基，苯基或苄基；以及由其衍生的约八至十个环原子的邻位稠合
的二环-杂环的基团，尤其是苯衍生物或者通过向其稠合亚丙基、三亚甲基、或四亚甲基二
基团(digroup)衍生的基团。

[0048] 在杂烷基、杂环烷基或杂芳基包括具体数目的元件(例如“3至7元”)的情况下，术语“元件”是指碳或杂原子。

[0049] 术语“卤代”或“卤素”，以其自身或作为另一取代基的一部分，除非另有说明，是指氟、氯、溴或碘原子。另外，术语如“卤代烷基”意图包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术
语“卤代(C1-C4)烷基”意图包括但不限于三氟甲基，2,2,2-三氟乙基，4-氯丁基，3-溴丙基
等。术语“卤代”也指氟、氯、溴或碘。

[0050] 如本文使用的，术语“氧代(oxo)”是指与碳原子双键结合的氧。

[0051] 上述术语(例如，“烷基”，“杂烷基”，“环烷基和“杂环烷基”，“芳基”，“杂芳基”以及它们的二价基团衍生物)各自意图包括所述基团的取代和未取代形式。用于每种类型的基团的取代基在以下提供。

[0052] 用于烷基，杂烷基，环烷基，杂环烷基一价和二价衍生物基团(包括经常称为亚烷基，烯基，杂亚烷基，杂烯基，炔基，环烷基，杂环烷基，环烯基，和杂环烯基的那些基团)的取代基可以是选自但不限于以下的各种各样的基团中的一个或多个：-OR’，=O，=NR’，=N-
OR’，-NR’R’’，-SR’，-卤素，-SiR’R’’R’’’，-OC(O)R’，-C(O)R’，-CO2R’，-C(O)NR’R’’，-OC(O)NR’R’’，-NR’’C(O)R’，-NR’-C(O)NR’’R’’’，-NR’’C(O)OR’，-NR-C(NR’R’’)=NR’’’，-S(O)R’，-S(O)2R’，-S(O)2NR’R’’，-NRSO2R’，-CN和-NO2，数量范围为零至(2m’+1)，其中m’是这样的基团中的碳原子的总数。R’，R’’，R’’’和R’’’’各自独立地是指氢，取代或未取代的杂烷基，取代或未取代的环烷基，取代或未取代的杂环烷基，取代或未取代的芳基(例如，被
1-3个卤素取代的芳基)，取代或未取代的烷基，烷氧基或硫代烷氧基，或芳烷基。当本发明
的化合物包含超过一个R基团时，例如，R基团中的每个被独立地选择，如同各个R’，R’’，
R’’’和R’’’’(当存在超过一个的这些基团时)那样。当R’和R’’’连接至同一氮原子时，它们可以与该氮原子组合而形成4-，5-，6-，或7-元环。例如，-NR’R’’意图包括但不限于1-吡咯
烷基和4-吗啉基。从以上的取代基讨论，本领域技术人员将理解，术语“烷基”意图包括包含
结合至不同于氢基的基团的碳原子的基团，如卤代烷基(例如，-CF3和-CH2CF3)和酰基(例
如，-C(O)CH-，-C(O)CF3，-C(O)CH2OCH3等)。

[0053] 类似于对于以上烷基所述的取代基，用于芳基和杂芳基(以及它们的二价衍生物)的示例性取代基是变化的并且选自，例如：卤素，-OR’，-NR’R’’，-SR’，-卤素，-SiR’R’’R’’’，-OC(O)R’，-C(O)R’，-CO2R’，-C(O)NR’R’’，-OC(O)NR’R’’，-NR’’C(O)R’，-NR’-C(O)NR’’R’’’，-NR’’C(O)OR’，-NR-C(NR’R’’R’’’)=NR’’’’，-NR-C(NR’R’’)=NR’’’，-S(O)R’，-S(O)2R’，-S(O)2NR’R’’，-NRSO2R’，-CN和-NO2，-R’，-N3，-CH(Ph)2，氟(C1-C4)烷氧基，和氟(C1-C4)烷基，其数量范围为零至芳族环系统上的开放价的总数；并且其中R’，R’’，R’’’和R’’’’独立地选自氢，取代或未取代的烷基，取代或未取代的杂烷基，取代或未取代的环烷基，取
代或未取代的杂环烷基，取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基。当本发明的化合
物包含超过一个R’基团时，例如，R基团中的每个被独立地选择，如同各个R’，R’’，R’’’和R’’’’(当存在超过一个的这些基团时)那样。

[0054] 芳基或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可以任选地形成式-T-C(O)-(CRR’)q-U-的环，其中T和U独立地是-NR-，-O-，-CRR’-或单键，并且q是0至3的整数。备选
地，芳基或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可以任选地被式-A-(CH2)，-B-的取代
基替代，其中A和B独立地是-CRR’-，-O-，-NR-，-S-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)2NR’-或单键，并且r是1至4的整数。如此形成的新环的单键中的一个可以任选地被一个双键替代。备选地，
芳基或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可以任选地被式-(CRR’)5-X’-(C’’R’’’
)d-的取代基替代，其中s和d独立地是0至3的整数，并且X’是-O-，-NR’-，-S-，-S(O)-，-S
(O)2-，或-S(O)2NR’-。取代基R，R’，R’’和R’’’独立地选自氢，取代或未取代的烷基，取代或未取代的环烷基，取代或未取代的杂环烷基，取代或未取代的芳基，和取代或未取代的杂芳
基。

[0055] 如本文中使用的，术语“杂原子”或“环杂原子”意图包括氧(O)，氮(N)，硫(S)，磷(P)和硅(Si)。

[0056] 如本文使用的，“氨基烷基”是指共价结合至亚烷基连接物的氨基。所述氨基是-NR’R’’，其中R’和R’’典型地选自氢，取代或未取代的烷基，取代或未取代的杂烷基，取代或未取代的环烷基，取代或未取代的杂环烷基，取代或未取代的芳基，或取代或未取代的杂芳
基。

[0057] 如本文使用的，“取代基”是指选自以下部分的基团：

[0058] (A)-OH，-NH2，-SH，-CN，-CF3，-NO2，氧代，卤素，未取代的烷基，未取代的杂烷基，未取代的环烷基，未取代的杂环烷基，未取代的芳基，未取代的杂芳基，和

[0059] (B)烷基，杂烷基，环烷基，杂环烷基，芳基，和杂芳基，其被选自以下中的至少一个取代基取代：

[0060] (i)氧代，-OH，-NH2，-SH，-CN，-CF3，-NO2，卤素，未取代的烷基，未取代的杂烷基，未取代的环烷基，未取代的杂环烷基，未取代的芳基，未取代的杂芳基，和

[0061] (ii)烷基，杂烷基，环烷基，杂环烷基，芳基，和杂芳基，其被选自以下中的至少一个取代基取代：(a)氧代，-OH，-NH2，-SH，-CN，-CF3，-NO2，卤素，未取代的烷基，未取代的杂烷基，未取代的环烷基，未取代的杂环烷基，未取代的芳基，未取代的杂芳基，和

[0062] (b)烷基，杂烷基，环烷基，杂环烷基，芳基，或杂芳基，其被选自以下中的至少一个取代基取代：氧代，-OH，-NH2，-SH，-CN，-CF3，-NO2，卤素，未取代的烷基，未取代的杂烷基，未取代的环烷基，未取代的杂环烷基，未取代的芳基，和未取代的杂芳基。

[0063] 如本文使用的，“限制大小的取代基”或“限制大小的取代基基团”，是指选自以上对于“取代基”描述的所有取代基中的基团，其中各个取代或未取代的烷基是取代或未取代
的C1-C20烷基，各个取代或未取代的杂烷基是取代或未取代的2至20元杂烷基，各个取代或
未取代的环烷基是取代或未取代的C4-C8环烷基，并且各个取代或未取代的杂环烷基是取代
或未取代的4至8元杂环烷基。

[0064] 如本文使用的，“低级取代基”或“低级取代基基团”是指选自以上对于“取代基”描述的所有取代基中的基团，其中各个取代或未取代的烷基是取代或未取代的C1-C8烷基，各
个取代或未取代的杂烷基是取代或未取代的2至8元杂烷基，各个取代或未取代的环烷基是
取代或未取代的C5-C7环烷基，并且各个取代或未取代的杂环烷基是取代或未取代的5至7元
杂环烷基。

[0065] 本发明的化合物可以作为盐存在。本发明包括这样的盐。可用的盐形式的实例包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、马来酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、酒石酸盐(例如(+)-酒石酸盐，(-)-酒石酸盐或其混合物，包括外消旋混合物，琥珀酸盐、苯甲
酸盐和与氨基酸如谷氨酸的盐。这些盐可以通过本领域技术人员熟知的方法制备。还包括
的是碱加成盐如钠、钾、钙、铵、有机氨基或镁盐，或类似盐。当本发明的化合物含有相对碱
性官能团时，酸加成盐可以通过使这样的化合物的中性形式与足够量的所需酸（纯的或在
合适惰性溶剂中)接触而获得。可接受的酸加成盐的实例包括衍生自无机酸如盐酸、氢溴
酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等的那些盐，以及衍生自有机酸如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等的盐。还包括的是氨基酸如精氨酸等的盐，和有机酸如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸(galactunoric 
acids)等的盐。本发明的某些具体化合物含有允许该化合物转化为碱或酸加成盐的碱性和
酸性官能团二者。

[0066] 所述化合物的中性形式通过使所述盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体化合物而再生。所述化合物的母体形式在某些物理性质如在急性溶剂中的溶解度方面不同于各
种盐形式。

[0067] 本发明的某些化合物可以以非溶剂化形式以及溶剂化形式，包括水合形式存在。一般地，溶剂化形式相当于非溶剂化形式并且涵盖在本发明的范围内。本发明的某些化合
物可以以多种结晶或无定形形式存在。一般地，所有物理形式对于本发明所考虑的应用是
等效的并且意图在本发明的范围内。

[0068] 本发明的某些化合物具有不对称的碳原子(光学或手性中心)或双键；对映异构体、外消旋物、非对映异构体、互变异构体、几何异构体、立体异构体形式，其依据绝对立体
化学，可以被定义为(R)-或(S)-或者，对于氨基酸的(D)-或(L)-，并且个体异构体涵盖在本
发明的范围内。本发明的化合物不包括本领域已知是太不稳定而不能合成和/或分离的那
些化合物。本发明意图包括为外消旋和光学纯形式的化合物。任选地活性(R)-和(S)-，或
(D)-和(L)-异构体可以使用手性合成子或手性试剂制备，或者使用常规技术拆分。当本文
描述的化合物含有烯键或其他几何不对称中心，并且除非另有规定时，意图所述化合物包
括E和Z几何异构体二者。

[0069] 如本文中使用的，术语“互变异构体”是指以平衡存在且容易从一种异构形式转化至另一种异构形式的两种以上结构异构体中的一种。

[0070] 对于本领域技术人员将明显的是，本发明的某些化合物可以以互变异构体形式存在，所述化合物的所有这样的互变异构体形式在本发明的范围内。

[0071] 除非另有说明，本文中描述的结构还意图包括该结构的所有立体化学形式；即，每个不对称中心的R和S构型。因此，所述化合物的单个立体化学异构体以及对映异构体和外
消旋混合物在本发明的范围内。

[0072] 除非另有说明，本文中描述的结构还意图包括在一个或多个富含同位素原子的存在方面不同的化合物。例如，具有所述结构、不同之处在于氢被氘或氚替代、或碳被富含13C
或14C的碳替代的化合物在本发明的范围内。

[0073] 本发明的化合物也可以在构成这样的化合物的一个或多个原子上含有非天然比例的原子同位素。例如，所述化合物可以用放射性同位素如例如氚(3H)、碘-125(125I)或碳-
14
14( C)放射标记。本发明化合物的所有同位素变形，无论是否是放射性的，都涵盖在本发明
的范围内。

[0074] 在本发明通篇中，术语“约”某个值是指考虑了数值±25%的范围，并且优选数值±10%的范围，并且更优选数值±5%的范围。因此，例如，约20mol%的某种试剂包括以15%至
25%，优选18%至22%，并且更优选19%至73.5%存在的所述试剂。

[0075] 当提及本文中的取代基的基团使用时，术语“一个”、“一种”或“一项”是指至少一个。例如，在化合物被“一个”烷基或芳基取代的情况下，所述化合物任选地被至少一个烷基
和/或至少一个芳基取代。此外，在一个部分被R取代基取代的情况下，该基团可以被称为
“R-取代的”。在一个部分是R-取代的情况下，该部分被至少一个R取代基取代并且各个R取
代基任选是不同的。

[0076] 本发明的化合物的描述受本领域技术人员已知的化学成键的原则限制。因此，在一个基团可以被大量取代基中的一个或多个取代的情况下，选择这样的取代以符合化学成
键的原则，并获得不是固有不稳定和/或本领域普通技术人员已知为在环境条件下如含水、
中性、和若干已知的生理条件下可能是不稳定的化合物。例如，杂环烷基或杂芳基依照本领
域技术人员已知的化学成键的原则经由环杂原子连接至分子的剩余部分，从而避免固有不
稳定的化合物。

[0077] 本领域技术人员应理解，具有手性中心的本发明化合物可以以光学活性和外消旋形式存在和分离。一些化合物可以表现出多形性。应理解，本发明涵盖本发明化合物的任何
外消旋、光学活性、多形性或立体异构形式，或其混合物，其具有本文所述的有用性质。而
且，如果所指定的化合物包含手性中心，则本发明的范围还包括包含两种对映异构体的外
消旋混合物的组合物，以及包含单个的基本上不含另一种对映异构体的各个对映异构体的
组合物。因此，例如，本文考虑了包含基本上不含R对映异构体的S对映异构体的组合物，或
者包含基本上不含S对映异构体的R对映异构体的组合物。

[0078] “基本上不含”是指，所述组合物包含低于10%，或低于8%，或低于5%，或低于3%，或低于1%的少数对映异构体。如果指定的化合物包含超过一个手性中心，本发明的范围还包
括包含各种非对映异构体的混合物的组合物，以及包含基本上没有另一种非对映异构体的
各个非对映异构体的组合物。

[0079] 本领域熟知如何制备光学活性形式(例如，通过重结晶技术拆分外消旋形式，通过从光学活性原料合成，通过手性合成，或通过使用手性固定相的色谱分离)和如何使用本文
所述的标准测试或者使用本领域熟知的其他类似测试来确定抗癌活性。

[0080] 如本文中使用的，“基本上纯的”是指目标物质是主要物种(即，基于摩尔，其比组合物中任何其他的单个物种更丰富)，并且基本上纯化的级分是这样的组合物，其中目标物
种构成所有大分子物种的至少约50%(基于摩尔)。一般地，基本上纯的组合物构成组合物中
的所有大分子物种的约80%，例如超过约85%，90%，95%和99%。目标物种也可以被纯化至基本
均质(污染物种通过常规检测方法不能在组合物中检测到)，其中所述组合物基本由单一物
种组成。

[0081] 在抗微生物肽用作抗微生物剂的情况下，它们可以例如被配制在含有各种各样的盐和缓冲剂的缓冲含水介质中。所述盐的实例包括但不限于卤化物、磷酸盐和硫酸盐，例如
氯化钠、氯化钾或硫酸钠。可以在缓冲剂对被治疗的宿主在生理上可接受的程度使用各种
这样的缓冲剂如柠檬酸盐、磷酸盐、HEPES、Tris等。

[0082] 可以使用各种赋形剂或其他添加剂，在肽被配制作为冻干粉的情况下，用于后续用于溶液中。赋形剂可以包括各种多元醇、惰性粉末或其他增量剂(extender)。

[0083] 如本文中使用的，"治疗有效"是指数量足以改善所治疗的患者或动物的状态的任选地在药用载体中的制剂、组合物或试剂的量。"改善"是指减轻治疗接受者中的疾病状态
或病症的有害作用。在一个实施方案中，本发明的肽被施用于需要治疗的受试者。

[0084] 用于施用的药用载体制剂包括无菌或水溶液或非水溶液、混悬剂和乳剂。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包
括水、醇/水溶液、乳液或混悬液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外载体包括氯化钠溶液、
Ringer右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸化Ringer's(lactated Ringer's)或固定油。活性治
疗成分经常与药用且与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂包括水、盐水、右旋糖、
甘油和乙醇，或其组合。静脉内载体包括流体和营养补充物、电解质补充物，如基于Ringer
右旋糖等的那些。防腐剂和其他天添加剂也可以存在，如，例如，抗氧化剂、螯合剂和惰性气
体等。肽、含有这样的肽的制剂或组合物的实际剂量可以取决于许多因素，包括有机体的大
小/重量、年龄和健康，然而，本领域普通技术人员可以利用以下教导和本领域已知的描述
用于确定临床剂量的方法和技术的其他教导(Spiker B.,Guide to Clinical Studies 
and Developing Protocols(临床研究和开发方案指南),Raven Press,Ltd.,New York,
1984,pp.7-13,54-60;Spiker B.,Guide to Clinical Trials(临床试验指南),Raven 
Press,Ltd.,New York1991,pp.93-101;C.Craig和R.Stitzel,eds.,Modern 
Pharmacology,2d ed.,Little,Brown and Co.,Boston,1986,pp.127-133;T.Speight,
ed.,Avery's Drug Treatment:Principles and Practice of Clinical Pharmacology 
and Therapeutics (Avery药物治疗：临床药理学和治疗的原理和实践),3d ed.,Williams 
and Wilkins,Baltimore,1987,pp.50-56;R.Tallarida,R.Raffa和P.McGonigle,
Principles in General Pharmacology(一般药理学原理),Springer-Verlag,new York,
1988,pp.18-20)来确定要使用的合适剂量。

[0085] 如本文中使用的，术语"氨基酸"意图是指任何天然或非天然氨基酸，无论是天然或合成制备的，包括以L或D构型的任何这样的氨基酸。该术语还可以涵盖在肽模拟物
(peptidomimetics)或拟肽(peptoids)中使用的氨基酸类似物化合物。该术语可以包括修
饰的或不常见的氨基酸或氨基酸的合成衍生物，例如二氨基丁酸和二氨基丙酸等。

[0086] 所公开的抗微生物肽由通过肽键连接在一起的氨基酸构成。序列通常从氨基末端至羧基末端给出。除非另有注解，所述氨基酸是L-氨基酸。当所有氨基酸是L-构型时，肽被
说成是L-对映异构体。当所有氨基酸是D-构型时，肽被说成是D-对映异构体。

[0087] 术语"最小抑制浓度"(MIC)是指在特定条件下例如在液体肉汤培养基中阻止微生物生长或以其他方式改变微生物的功能所需的抗微生物剂(例如，肽)的最低浓度，并且可
以根据本领域熟知的标准技术对大量不同微生物确定。

[0088] 术语"最小溶血浓度"(MHC)是指引起血细胞溶血作用所需的试剂或肽的最低浓度。MHC可以利用来自各种物种的红细胞(RBC)包括人红细胞(hRBC)确定。

[0089] 术语"治疗指数"(TI)是抗微生物剂的最小溶血浓度(MHC)相对于最小抑制浓度(MIC)的比。越大的值通常指示更大的抗微生物特异性。

[0090] 术语"稳定性"可以是指抵抗降解、在给定环境中坚持和/或保持特定结构的能力。例如，肽稳定性性质可以指示对蛋白水解降解的抗性和保持α-螺旋结构构象。

[0091] 本文中使用以下缩写：A，Ala，丙氨酸；M，Met，甲硫氨酸；C，Cys，半胱氨酸；D，Asp，天冬氨酸；E，Glu，谷氨酸；F，Phe，苯丙氨酸；G，Gly，甘氨酸；H，His，组氨酸；I，Ile，异亮氨酸；K，Lys，赖氨酸；L，Leu，亮氨酸；N，Asn，天冬酰胺；P，Pro，脯氨酸；Q，Glu，谷氨酰胺；R，Arg，精氨酸；S，Ser，丝氨酸；T，Thr，苏氨酸；V，Val，缬氨酸；W，Trp，色氨酸；Y，Tyr，酪氨酸；RP-HPLC，反相高效液相色谱；MIC，最小抑制浓度；MHC，最小溶血浓度；CD，圆二色谱；TFE，三氟乙醇；TFA，三氟乙酸；RBC，红细胞；hRBC，人红细胞。

[0092] 术语"抗微生物活性"是指本发明的肽改变靶微生物的功能或代谢过程，例如至少部分地影响复制、营养生长、毒素产生、存活、休眠状态下的生存力或其他属性的能力。在一
个实施方案中，该术语涉及抑制微生物的生长。在一个特别实施方案中，抗微生物活性涉及
本发明的肽杀灭至少一种细菌物种的能力。在一个特别实施方案中，细菌物种选自由革兰
氏阳性和革兰氏阴性细菌组成的组。在一个实施方案中，该术语可以表示为杀微生物的或
微生物生长的抑微生物抑制。

[0093] 短语"改善的生物学性质"意图表明当通过本文所述的方案或通过任何其他本领域已知的标准方案进行测试时，相比于对照肽(例如，V.sub.681)，测试肽表现出较低的溶
血活性和/或更佳的抗微生物活性、或更佳的抗微生物活性和/或较低的溶血活性。一般地，
肽的改善的生物学性质在比对照肽更好的治疗指数(TI)中反映。

[0094] 术语"微生物"在本文中宽泛地指细菌、真菌、病毒和原生动物。特别地，该术语可用于具有脂质双层膜的细胞或结构组分的微生物。在具体实施方案中，所述膜是细胞质膜。
如本领域已知的致病细菌、真菌、病毒和原生动物通常被涵盖。除了被分类在柔膜菌门
(Mollicutes)纲的各个目等中的有机体如支原体(Mycoplasma)和无胆甾原体属
(Acholeplasma genera)的物种外，细菌可以包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌。潜在敏感
的革兰氏阴性细菌的具体实例包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌
(Pseudomonas aeruginosa)、沙门氏菌(Salmonella)、流感嗜血菌(Hemophilus 
influenza)、奈瑟氏球菌(Neisseria)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、副溶血弧菌(Vibrio 
parahaemolyticus)和幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)。潜在敏感的革兰氏阳性细菌的
实例包括但不限于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌
(Staphylococcus epidermis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、A组链球菌
(Group  A streptococcus)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、粪肠球菌
(Enterococcus  faecalis)、B组革兰氏阳性链球菌(Group  B gram positive 
streptococcus)、干燥棒杆菌(Corynebacterium xerosis)和单核细胞增生利斯特氏菌
(Listeria monocytogenes)。潜在敏感的真菌的实例包括酵母如白色念珠菌(Candida 
albicans)。潜在敏感的病毒的实例包括麻疹病毒(measles virus)、单纯疱疹病毒(herpes 
simplex virus)(HSV-1和-2)、疱疹家族成员(HIV、丙型肝炎、疱疹性口炎病毒(VSV)、绵羊
髓鞘脱落病毒(visna virus)和巨细胞病毒(cytomegalo virus)(CMV)。潜在敏感的原生动
物的实例包括贾第虫(Giardia)。

[0095] 如本文中使用的，"治疗有效"是指数量足以改善所治疗的患者、动物、材料或对象的有害状态的制剂、组合物或在药用载体中的试剂或活性化合物的药用盐的量。"改善"是
指在治疗接受者中减轻疾病状态或病症的有害作用或减少污染。

[0096] 本发明的抗微生物肽自身具有抗微生物活性，或在与另一分子例如聚乙二醇或载体蛋白质如牛血清白蛋白共价缀合或以其他方式偶联或结合时具有抗微生物活性，只要所
述肽被这样放置以致其可以接触靶微生物的细胞或单元。这些肽可以通过本领域已知的方
法修饰，条件是所述抗微生物活性不被破坏或基本上不受损。

[0097] 脱乙酰壳多糖是由随机分布的β-(1-4)-连接的D-葡糖胺(脱乙酰单元)和N-乙酰基-D-葡糖胺(乙酰化单元)构成的线性多糖。脱乙酰壳多糖通过对几丁质进行脱乙酰化商
业生产，几丁质是甲壳类(crustaceans)如蟹和虾的外骨骼以及真菌的细胞壁中的结构组
分。脱乙酰程度(%DD)可以通过NMR谱确定。商业脱乙酰壳多糖的%DD的范围为60至100%。平
均地，商业生产的脱乙酰壳多糖的分子量为3,800至20,000道尔顿。用于合成脱乙酰壳多糖
的常用方法是使用过量氢氧化钠作为试剂和水作为溶剂对几丁质脱乙酰化。当允许进行完
成(完全脱乙酰化)时，此反应路径得到多至98%产物。

[0098] 基于其革兰氏染色保持性质，细菌传统地分为两大组：革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。试验可用于基于其细胞壁的结构差异将这两种不同类型的细菌进行分类。革兰氏阳
性细菌由于其细胞壁中的大量肽聚糖而在革兰氏染色方案中保留结晶紫染料并且被染成
深蓝色或紫色。对比地，革兰氏阴性细菌由于其包围肽聚糖层的脂多糖和蛋白质的外膜而
不保留结晶紫染色，而是相反地吸收复染剂(番红精(safranin)或碱性品红(fuchsine))并
显现红色或粉红色。尽管细菌传统地分成这两大组，但此分类系统是不明确的，因为它可以
涉及三个不同方面(染色结果，细胞包膜组织结构，分类学组)，这对于一些细菌物种不一定
相合。革兰氏阳性和革兰氏阴性染色响应也不是可靠的特性，因为这两种细菌不形成系统
发生一致组。

[0099] 虽然细菌的革兰氏染色响应是经验标准，但其基础在于自然中发现的两大类型的原核细胞的超微结构和化学组成中的标记差异。这两种细胞基于是否存在外部脂质膜彼此
区别开，这是细菌细胞的一种更可靠且基本的特性。革兰氏阳性细菌仅通过单个单元脂质
膜划界并且它们通常含有厚的负责保持革兰氏染色的肽聚糖层(20-80nm)。通过单一膜划
界但由于缺少肽聚糖层(支原体目)所致保持染色革兰氏阴性或者由于其细胞壁组成所致
其不能保持革兰氏染色的大量其他细菌，也显示与革兰氏阳性细菌的密切关系。

[0100] 人中的大多数病原体是革兰氏阳性有机体。六种革兰氏阳性细菌通常在人中是致病的。这之中的两种，链球菌(Streptococcus)和葡萄球菌(Staphylococus)是球菌(球形细
菌)。剩余的细菌是杆菌(杆形细菌)并且可以基于其形成孢子的能力进行细分。非孢子形成
菌有棒杆菌(Corynebacterium)和利斯特氏菌(Listeria)(一种球杆菌)，而芽孢杆菌
(Bacillus)和梭菌(Clostridum)产生孢子。孢子形成细菌可以再基于其呼吸作用划分：芽
孢杆菌(Bacillus)是兼性厌氧菌，而梭菌(Clostridum)是专性厌氧菌。

[0101] 与革兰氏阳性细菌相反，革兰氏阴性细菌以细胞质膜以及外部细胞膜为界并且它们仅在这两种膜之间含有薄的肽聚糖层(2-3nm)。内外细胞膜二者的存在限定这些细胞中
的新隔室、周质空间或隔室。

[0102] 变形菌(proteobacteria)是革兰氏阴性菌的一个主要组，其包括大肠杆菌(E.coli)，沙门氏菌(Salmonella)，志贺氏菌(Shigella)和其他肠杆菌科
(Enterobacteriaceae)，假单胞菌(Pseudomonas)，莫拉氏菌(Moraxella)，螺杆菌
(Helicobacter)，寡养单胞菌(Stenotrophomonas)，蛭弧菌(Bdellovibrio)，醋酸细菌
(acetic acid bacteria)，军团菌(Legionella)和大量其他细菌。其他值得注意的革兰氏
阴性细菌的组包括蓝细菌(cyanobacteria)，螺旋体(spirochaetes)，绿色硫磺细菌(green 
sulfur bacteria)和绿色非硫磺细菌(green non-sulfur bacteria)。医学相关的革兰氏
阴性球菌包括三种有机体，其引起性传播疾病(淋病奈瑟氏球菌(Neisseria 
gonorrhoeae))，脑膜炎(meningitis)(脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides))和
呼吸道症状(粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis))。医学相关的革兰氏阴性杆菌包
括大量物种。它们中的一些主要引起呼吸问题(流感嗜血菌(Hemophilus influenza)，肺炎
克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)，侵肺军团菌(Legionella pneumophila)，铜绿假单
胞菌(Pseudomonas aeruginosa))，原发性泌尿问题(大肠杆菌(Escherichia coli)，奇异
变形菌(Proteus mirabilis)，阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，粘质沙雷氏菌
(Serratia marcescens))，和原发性胃肠问题(幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)，肠炎
沙门氏菌(Salmonella enteritidis)，伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi))。与医院交叉感
染(nosocomial infection)相关的革兰氏阴性细菌包括鲍氏不动杆菌(Acinetobacter 
baumannii)，其引起菌血症(bacteremia)、继发性脑膜炎(secondary meningitis)和医院
机构的重症监护病房中的呼吸器相关性肺炎(ventilator-associated pneumonia)。

[0103] 抗微生物肽(AMP)

[0104] 大多数AMP的特征在于其阳离子电荷及其两亲性。这两个特性允许AMP被静电吸引至阴离子细胞质膜，然后渗透到微生物内部的疏水脂质双层中。已设计和合成了大量化学
结构来模拟天然AMP的阳离子和两亲性；这些包括合成肽、拟肽、聚甲基丙烯酸酯、聚吡啶
(polypryidine)、聚降冰片烯、多糖等。许多合成工作也已考虑了AMP与微生物的细胞质膜
的静电相互作用，但很大程度上忽视了其与复杂细胞壁结构的相容性。另外，大多数合成AMP
的相对较低的选择性导致对哺乳动物细胞的细胞毒性(更具体地，通过红细胞的溶血作用)。

[0105] 肽聚糖是细菌细胞壁的常见组分，其是动物细胞壁没有的特征。例如，革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌二者具有在细胞质膜外部的肽聚糖层。被设计为模拟细菌细胞壁组成的
AMP由于其与哺乳动物外膜组分的不一致性而可以比目前的AMP是更低溶血的。迄今，具有
肽聚糖模拟化学结构以促进渗透到细菌细胞壁中的肽多糖还没有被用作抗微生物的生物
大分子。

[0106] 然而，已令人惊讶地发现，模拟肽聚糖结构的化合物或聚合物可以用作抗微生物剂。因此，本发明提供出乎意料的一类新的基于阳离子肽多糖的抗微生物聚合物类型化合
物，其模拟细菌细胞壁的肽聚糖结构，并且其显示优异的抗微生物活性和选择性以及低的
溶血活性。

[0107] 因此，在一个实施方案中，本发明提供具有式I的化合物:

[0108]

[0109] 或其药用盐,其中:

[0110] 各个R独立地选自氢,取代或未取代的烷基,取代或未取代的烯基,取代或未取代的炔基,取代或未取代的环烷基,取代或未取代的芳基,取代或未取代的芳烷基,取代或未
取代的杂芳基,取代或未取代的杂芳烷基,(CH2)jOR1,(CH2)jC(O)R1,(CH2)jC(O)OR1,(CH2)jOC
(O)R1,(CH2)jNR2R3,(CH2)jC(O)NR2R3,(CH2)jOC(O)NR2R3,(CH2)jC(NR4)NR2R3,(CH2)jNR4C(O)
R1,(CH2)jNR4C(O)OR1,(CH2)jNR4C(O)NR2R3,(CH2)jNR4C(O)NR2R3,(CH2)jNR4C(NH)NR2R3,(CH2)
jSH,(CH2)jS(O)kCH3,(CH2)jNR4S(O)kCH3,(CH2)jS(O)kNR2R3和(CH2)jNR4S(O)kNR2R3,其中j是独
立选自0至6的整数,k是独立选自0至2的整数,并且其中各个R基团任选独立地被1-3个取代
基取代,各个取代基独立地选自烷基,烯基,炔基,环烷基,全氟烷基,氨基,氰基,卤素,羟
基,硝基,芳基,芳烷基,杂环,杂芳基,和杂芳烷基;

[0111] R1,R2,R3和R4各自独立地选自氢,取代或未取代的烷基,取代或未取代的烯基,取代或未取代的炔基,取代或未取代的环烷基,取代或未取代的芳基,取代或未取代的芳烷
基,取代或未取代的杂芳基,取代或未取代的杂芳烷基,其中各个R1,R2,R3和R4基团任选独
立地被1-3个取代基取代,各个取代基独立地选自烷基,烯基,炔基,环烷基,全氟烷基,氨
基,氰基,卤素,羟基,硝基,芳基,芳烷基,杂环,杂芳基,和杂芳烷基;

[0112] m是独立地选自1至100,000的整数;

[0113] n是独立地选自1至100,000的整数;并且

[0114] x是独立地选自1至5,000的整数。

[0115] 在另一个实施方案中，本发明提供具有式I的化合物,其中m和n各自是整数，各自独立选自1至90,000,或m和n各自是独立选自1至80,000的整数,或m和n各自是独立选自1至
70,000的整数,或m和n各自是独立选自1至60,000的整数,或m和n各自是独立选自1至90,
000的整数,或m和n各自是独立选自1至50,000的整数,或m和n各自是独立选自1至40,000的
整数,或m和n各自是独立选自1至30,000的整数,或m和n各自是独立选自1至20,000的整数,
或m和n各自是独立选自1至10,000的整数,或m和n各自是独立选自1至5,000的整数,或m和n
各自是独立选自1至3,000的整数,或m和n各自是独立选自1至2,000的整数,或m和n各自是
独立选自1至1,000的整数,或m和n各自是独立选自1至500的整数,或m和n各自是独立选自1
至250的整数,或m和n各自是独立选自1至100的整数,或m和n各自是独立选自1至50的整数,
或m和n各自是独立选自1至25的整数,或m和n各自是独立选自1至20的整数,或m和n各自是
独立选自1至10的整数,或m和n各自是独立选自1至5的整数,或m和n各自是独立选自1,2,3,
4和4的整数;并且

[0116] x是独立选自1至4,000的整数,或x是独立选自1至3,000的整数,或x是独立选自1至2,500的整数,或x是独立选自1至2,000的整数,或x是独立选自1至1,500的整数,或x是独
立选自1至1,000的整数,或x是独立选自1至900的整数,或x是独立选自1至800的整数,或x
是独立选自1至750的整数,或x是独立选自1至700的整数,或x是独立选自1至600的整数,或
x是独立选自1至500的整数,或x是独立选自1至400的整数,或x是独立选自1至300的整数,
或x是独立选自1至250的整数,或x是独立选自1至200的整数,或x是独立选自1至100的整
数,或x是独立选自1至75的整数,或x是独立选自1至50的整数,或x是独立选自1至40的整
数,或x是独立选自1至30的整数,或x是独立选自1至25的整数,或x是独立选自1至20的整
数,或x是独立选自1至15的整数,或x是独立选自1至10的整数,或x是独立选自1至5的整数,
或x是独立选自1,2,3,4和4的整数。

[0117] 在另一个实施方案中，本发明提供具有式I的化合物,其中:

[0118] R独立地选自取代或未取代的(C1-C6)烷基,取代或未取代的(C2-C6)烯基,取代或未取代的(C2-C6)炔基,取代或未取代的(C3-C8)环烷基,取代或未取代的(C6-C10)芳基,取代
或未取代的(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基,取代或未取代的(C3-C10)杂芳基,取代或未取代的
(C3-C10)杂芳基(C1-C6)烷基,(CH2)OR1,(CH2)C(O)R1,(CH2)C(O)OR1,(CH2)OC(O)R1,(CH2)
NR2R3,(CH2)C(O)NR2R3,(CH2)OC(O)NR2R3,(CH2)C(NR4)NR2R3,(CH2)NR4C(O)R1,(CH2)NR4C(O)
1 4 2 3 4 2 3 4 2 3
OR ,(CH2)NR C(O)NR R ,(CH2)NR C(O)NR R ,(CH2)NRC(NH)NR R ,(CH2)SH,(CH2)S(O)kCH3,
(CH2)NR4S(O)kCH3,(CH2)S(O)kNR2R3和(CH2)NR4S(O)kNR2R3;并且

[0119] R1,R2,R3和R4各自独立地选自氢,取代或未取代的(C1-C6)烷基,取代或未取代的(C2-C6)烯基,取代或未取代的(C2-C6)炔基,取代或未取代的(C3-C8)环烷基,取代或未取代
的(C6-C10)芳基,取代或未取代的(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基,取代或未取代的(C3-C10)杂芳
基,和取代或未取代的(C3-C10)杂芳基(C1-C6)烷基.

[0120] 在另一个实施方案中，本发明提供具有式I的化合物,其中:

[0121] R独立地选自(C1-C6)烷基,(C2-C6)烯基,(C2-C6)炔基,(C3-C8)环烷基,(C6-C10)芳1 1
基,(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基,杂(C3-C10)芳基,杂(C3-C10)芳基(C1-C6)烷基,OR ,C(O)R ,C
(O)OR1,OC(O)R1,NR2R3,C(O)NR2R3,OC(O)NR2R3,C(NR4)NR2R3,NR4C(O)R1,NR4C(O)OR1,NR4C(O)
NR2R3,NR4C(O)NR2R3,NR4C(NH)NR2R3,SH,S(O)kCH3,NR4S(O)kCH3,S(O)kNR2R3和NR4S(O)kNR2R3;
并且

[0122] R1,R2,R3和R4各自独立地选自氢,(C1-C6)烷基,(C2-C6)烯基,(C2-C6)炔基,(C3-C8)环烷基,(C6-C10)芳基,(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基,(C3-C10)杂芳基,和(C3-C10)杂芳基(C1-C6)
烷基。

[0123] 在另一个实施方案中，本发明提供具有式I的化合物,其中R独立地选自CH3,CH2CH3,CH2CH2CH3,CH(CH3)2,CH2CH2CH2CH3,CH(CH3)CH2CH3,CH2CH(CH3)2,C6H5,CH2C6H5,CH2C6H4(对-OH),CH2C6H5,CH2OH,CH2CH(OH)CH3,CH2C(O)NH2,(CH2)2C(O)NH2,(CH2)4NH2,(CH2)3NHC
(NH)NH2,CH2(C3H2N2),CH2(C8H6N),CH2SH和CH2SCH3。

[0124] 在另一个实施方案中，本发明提供具有式I的化合物,其中所述式I的化合物选自：

[0125]

[0126] 在另一个实施方案中，本发明提供药物组合物，所述药物组合物包含式I的化合物,和药用载体。

[0127] 在另一个实施方案中，本发明提供治疗组合物，其用于防治通过微生物的感染，所述治疗组合物包含治疗有效量的式I的化合物和药用载体。

[0128] 在另一个实施方案中，本发明提供治疗组合物，其用于防治通过微生物的感染，所述治疗组合物包含治疗有效量的式I的化合物和药用载体,其中所述微生物选自细菌,真
菌,病毒,和原生动物。

[0129] 在另一个实施方案中，本发明提供用于防治微生物的方法，其通过施用治疗有效量的组合物,其中所述组合物包含式I的化合物和可接受的载体。

[0130] 在另一个实施方案中，本发明提供用于防治微生物的方法，其通过施用治疗有效量的组合物,其中所述组合物包含式I的化合物和可接受的载体,其中所述微生物选自革兰
氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌。

[0131] 在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗有需要的受试者或预防由微生物引起的受试者的感染的方法，其通过向患有所述感染的受试者施用治疗有效量的式I的化合物
的药物组合物。

[0132] 在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗有需要的受试者或预防由微生物引起的受试者的感染的方法，其通过向患有所述感染的受试者施用治疗有效量的式I的化合物
的药物组合物,其中所述微生物选自革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。

[0133] 在另一个实施方案中，本发明提供用于对物品的表面消毒的方法，其通过向所述表面施加有效量的组合物，其中所述组合物包含式I的化合物。

[0134] 在另一个实施方案中，本发明提供消毒液，所述消毒液包含式I的化合物，和任选的可接受的载体。

[0135] 在另一个实施方案中，本发明提供用于制备式I的化合物、或其药用盐的方法，其通过:

[0136] a)使式II的化合物与式III的化合物反应以提供式IV的化合物;和

[0137] b)使所述式IV的化合物去保护从而提供式I的化合物:

[0138]

[0139] 其中:

[0140] 各个PG是保护基;

[0141] 各个R独立地选自氢,取代或未取代的烷基,取代或未取代的烯基,取代或未取代的炔基,取代或未取代的环烷基,取代或未取代的芳基,取代或未取代的芳烷基,取代或未
取代的杂芳基,取代或未取代的杂芳烷基,(CH2)jOR1,(CH2)jC(O)R1,(CH2)jC(O)OR1,(CH2)jOC
(O)R1,(CH2)jNR2R3,(CH2)jC(O)NR2R3,(CH2)jOC(O)NR2R3,(CH2)jC(NR4)NR2R3,(CH2)jNR4C(O)
1 4 1 4 2 3 4 2 3 4 2 3
R ,(CH2)jNRC(O)OR ,(CH2)jNRC(O)NR R ,(CH2)jNRC(O)NR R ,(CH2)jNRC(NH)NRR ,(CH2)
jSH,(CH2)jS(O)kCH3,(CH2)jNR4S(O)kCH3,(CH2)jS(O)kNR2R3和(CH2)jNR4S(O)kNR2R3,其中j是独
立选自0至6的整数,k是独立选自0至2的整数,并且其中各个R基团任选独立地被1-3个取代
基取代,各个取代基独立地选自烷基,烯基,炔基,环烷基,全氟烷基,氨基,氰基,卤素,羟
基,硝基,芳基,芳烷基,杂环,杂芳基,和杂芳烷基;

[0142] R1,R2,R3和R4各自独立地选自氢,取代或未取代的烷基,取代或未取代的烯基,取代或未取代的炔基,取代或未取代的环烷基,取代或未取代的芳基,取代或未取代的芳烷
基,取代或未取代的杂芳基,取代或未取代的杂芳烷基,其中各个R1,R2,R3和R4基团任选独
立地被1-3个取代基取代,各个取代基独立地选自烷基,烯基,炔基,环烷基,全氟烷基,氨
基,氰基,卤素,羟基,硝基,芳基,芳烷基,杂环,杂芳基,和杂芳烷基;

[0143] m是独立地选自1至100,000的整数;

[0144] n是独立地选自1至100,000的整数;并且

[0145] x是独立地选自1至5,000的整数。

[0146] 在另一个实施方案中，本发明提供用于制备式I的化合物的方法,其中:

[0147] PG是三苯基甲基保护基;

[0148] R独立地选自取代或未取代的(C1-C6)烷基,取代或未取代的(C2-C6)烯基,取代或未取代的(C2-C6)炔基,取代或未取代的(C3-C8)环烷基,取代或未取代的(C6-C10)芳基,取代
或未取代的(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基,取代或未取代的(C3-C10)杂芳基,取代或未取代的
1 1 1 1
(C3-C10)杂芳基(C1-C6)烷基,(CH2)OR ,(CH2)C(O)R ,(CH2)C(O)OR ,(CH2)OC(O)R ,(CH2)
NR2R3,(CH2)C(O)NR2R3,(CH2)OC(O)NR2R3,(CH2)C(NR4)NR2R3,(CH2)NR4C(O)R1,(CH2)NR4C(O)
OR1,(CH2)NR4C(O)NR2R3,(CH2)NR4C(O)NR2R3,(CH2)NR4C(NH)NR2R3,(CH2)SH,(CH2)S(O)kCH3,
(CH2)NR4S(O)kCH3,(CH2)S(O)kNR2R3和(CH2)NR4S(O)kNR2R3;并且

[0149] R1,R2,R3和R4各自独立地选自氢,取代或未取代的(C1-C6)烷基,取代或未取代的(C2-C6)烯基,取代或未取代的(C2-C6)炔基,取代或未取代的(C3-C8)环烷基,取代或未取代
的(C6-C10)芳基,取代或未取代的(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基,取代或未取代的(C3-C10)杂芳
基,和取代或未取代的(C3-C10)杂芳基(C1-C6)烷基。

[0150] 在另一个实施方案中，本发明提供用于制备式I的化合物的方法,其中:

[0151] R独立地选自(C1-C6)烷基,(C2-C6)烯基,(C2-C6)炔基,(C3-C8)环烷基,(C6-C10)芳基,(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基,杂(C3-C10)芳基,杂(C3-C10)芳基(C1-C6)烷基,OR1,C(O)R1,C
(O)OR1,OC(O)R1,NR2R3,C(O)NR2R3,OC(O)NR2R3,C(NR4)NR2R3,NR4C(O)R1,NR4C(O)OR1,NR4C(O)
NR2R3,NR4C(O)NR2R3,NR4C(NH)NR2R3,SH,S(O)kCH3,NR4S(O)kCH3,S(O)kNR2R3和NR4S(O)kNR2R3;
并且

[0152] R1,R2,R3和R4各自独立地选自氢,(C1-C6)烷基,(C2-C6)烯基,(C2-C6)炔基,(C3-C8)环烷基,(C6-C10)芳基,(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基,(C3-C10)杂芳基,和(C3-C10)杂芳基(C1-C6)
烷基。

[0153] 在另一个实施方案中，本发明提供用于制备式I的化合物的方法,其中R独立地选自CH3,CH2CH3,CH2CH2CH3,CH(CH3)2,CH2CH2CH2CH3,CH(CH3)CH2CH3,CH2CH(CH3)2,C6H5,CH2C6H5,
CH2C6H4(对-OH),CH2C6H5,CH2OH,CH2CH(OH)CH3,CH2C(O)NH2,(CH2)2C(O)NH2,(CH2)4NH2,(CH2)
3NHC(NH)NH2,CH2(C3H2N2),CH2(C8H6N),CH2SH和CH2SCH3。

[0154] 在另一个实施方案中，本发明提供用于制备式I的化合物的方法,其中式I的化合物选自：

[0155]

[0156] 在另一个实施方案中，本发明提供式I的化合物,其通过本文公开的方法制备。

[0157] 在另一个实施方案中，任何以下剂量可以用于所公开的方法：在任何药用载体中，通常为约0.001mg/kg至约100mg/kg;或约0.001mg/kg至约1mg/kg终浓度，每天施用至成人。

[0158] 在另一个实施方案中，所公开的抗微生物肽可以用作食物防腐剂或用于处理食品以防治、减少或消除潜在的病原体或污染物。本发明的肽可以用作消毒剂、用于必须保持无
微生物或在一定容许量范围内的任何产品或与该产品一起使用。在一种实施方案中，用肽
的处理提供感染或污染的至少部分调控。

[0159] 在另一个实施方案中，还可能将抗微生物肽结合或分布到其中微生物生长或存活存在是不期望的材料中、装置上或物体上(例如在可接近的表面上)，作为通过向所述装置
或物体施用杀微生物或抑微生物有效量的肽的微生物生长的杀微生物或抑微生物抑制的
方法。在一个实施方案中，这样的装置或物体包括但不限于亚麻物品,布,塑料,乳胶织物,
天然橡胶,可植入装置,表面或储存容器。

[0160] 在另一个实施方案中，本发明提供用于对物品的表面消毒的方法，所述方法包括向所述表面施加有效量的包含本发明的至少一种杀微生物肽的组合物的步骤。在一个实施
方案中，本发明提供一种消毒液，所述消毒液包含本发明的至少一种杀微生物肽和任选的
可接受的载体。

[0161] 如以下方案I中所示，合成两个系列的肽多糖以研究分别含有阳离子亲水和疏水氨基酸残基的赖氨酸(K)和苯丙氨酸(F)的作用：(1)脱乙酰壳多糖-接枝-聚赖氨酸系列(表
示为CS-g-Kn)和(2)脱乙酰壳多糖-接枝-聚(赖氨酸-ran-苯丙氨酸)系列(表示为CS-g-
KnFn)。

[0162]

[0163] 方案I

[0164] 方案I显示以下各项的制备：(a)α-氨基NCA单体;和(b)脱乙酰壳多糖-g-NCA共聚物。如以上方案I(a)所示，α-氨基N-羧酸酐单体可以制备自相应的氨基酸和三光气。然后，
如方案1(b)所示，由赖氨酸和苯丙氨酸形成的肽侧链可以通过由游离氨基引发的α-氨基酸
N-羧酸酐开环聚合(NCA ROP)而接枝到脱乙酰壳多糖的主链上。N-羧酸酐开环聚合是一种
容易实现、廉价且易于规模化的合成技术。对于大多数样品，使用的脱乙酰壳多糖主链具有
相对较低的分子量(4.5×104g mol-1,除非另有说明)。对于研究分子量的作用，也可以使用
6 -1
更高分子量(1.1×10g mol )的脱乙酰壳多糖样品。使用保护基例如三苯基甲基等对脱乙
酰壳多糖上的6-CH2OH基团的保护，允许在脱乙酰壳多糖的C-2位的胺基与α-氨基酸N-羧酸
酐单体反应，使得多肽侧链自所述脱乙酰壳多糖主链生长。在酸性条件(HBR/TFA)下对6-
CH2OH基团的去保护提供所需的AMP。

[0165] 这些化合物中的接枝率(每个脱乙酰壳多糖大分子的侧链中的接枝氨基酸单元的摩尔比)可以变化以考察它们对抗微生物活性的影响。脱乙酰壳多糖-接枝-多肽共聚物的
合成通过1H NMR分析确认。接枝率通过多肽和糖1H NMR信号的积分确定。共聚物通过表I中
所示的接枝率命名。表示多肽侧链的平均长度的数均聚合度(DPn)可以利用接枝率除以脱
乙酰壳多糖的脱乙酰度进行计算。通过气相色谱(GPC)确定的分子量和多分散性也概述在
表I中。

[0166] 表I：接枝率

[0167]

[0168] DPn(数均聚合度)=接枝率/脱乙酰度。Mn:数均分子量。Mw:重均分子量。PDI:多分散性指数。

[0169] 因此，在一个实施方案中，本发明提供一类新的基于阳离子肽多糖的抗微生物聚合物，具体地模拟细菌细胞壁肽聚糖的脱乙酰壳多糖和聚赖氨酸的共聚物。

[0170] 图1显示阳离子肽多糖(脱乙酰壳多糖-接枝-多肽)(R=Lys或Phe)和细菌细胞壁肽聚糖(R=Ala,Glu,Lys等)的化学结构。

[0171] 图2示出了提出的这些阳离子肽多糖对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的作用模式。如图2(i)所示，阳离子肽多糖通过与阴离子细菌细胞壁的静电相互作用在细胞壁上聚
集。在图2(ii)中，阳离子肽多糖与细胞壁中的脂多糖(LPS)和肽聚糖的相容性允许所述阳
离子肽多糖穿过外膜和肽聚糖层。最后，在图2(iii)中，阳离子肽多糖在细胞壁的阴离子细
胞质膜中累积，渗透然后分解脂双层，导致微生物破坏的致死阶段。

[0172] 阳离子脱乙酰壳多糖-接枝-聚赖氨酸针对临床上重要的革兰氏阴性(大肠杆菌(Escherichia coli)(ATCC8739),铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC9027))
和革兰氏阳性(金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC6538))细菌以及真菌(白
色念珠菌(Candida albicans)(ATCC10231),腐皮镰刀菌(Fusarium solani)(ATCC36031))
具有优异的广谱抗微生物性能，如由其低的最小抑制浓度(5-20μg ml-1)、相对于人红细胞
它们对于病原体细胞的高选择性(>5-10K)和对哺乳动物细胞的低毒性所证实的。

[0173] 已知模拟天然AMP的合成聚合物的抗微生物活性受两个主要因素的影响，即它们的阳离子电荷和它们的两亲性(amphillic nature)(疏水性)。合成了两个系列的脱乙酰壳
多糖-接枝-多肽并测试了它们的抗微生物和溶血活性。如以下表II所显示的，系列1(#1A-#
1E)脱乙酰壳多糖-接枝-多肽包含聚赖氨酸，接枝率从1变化至25，并因此阳离子电荷变化。
另外，系列2(#2A-#2B)脱乙酰壳多糖-接枝-多肽包含具有等摩尔疏水苯丙氨酸和阳离子赖
氨酸残基的聚(赖氨酸-ran-苯丙氨酸)，接枝率为16(#2A)和25(#2B)的。发现系列1和2二者
在中性pH是水溶性的。

[0174] 表II:抗微生物和溶血活性

[0175]

[0176]

[0177] HC50：50%溶血的浓度;选择性：HC50/MIC(大肠杆菌)

[0178] MIC：最小抑制浓度

[0179] 在系列1中，对于具有变化的平均长度的聚赖氨酸接枝的CS-g-Kn(#1A至#1E)，抗微生物活性随着聚赖氨酸比率从1增加至9(#1A至#1C)而显著提高，其中对于所有测试的病
原体#1C的MIC为5-20μg ml-1。MIC在n=9、16和25(#1C-1E)之间仅稍微变化，其中CS-g-Kn系
列的最小MIC由CS-g-K16(#1D)表现出。最佳CS-g-K16(#1D)MIC好于已知的高度有效的AMP如
爪蟾抗菌肽和蜂毒肽(#4A,#4B,表1)的那些。CS-g-Kn系列(#1)比相应的通过上述的相同N-
羧酸酐开环聚合(但是在没有脱乙酰壳多糖主链的情况下)制备的阳离子均聚物具有显著
更低的MIC；例如，P(K25)(#5A)不显示显著的抗微生物活性而CS-g-K25(#1E)具有低的MIC。

[0180] 在系列2中，CS-g-K8F8和CS-g-K12.5F12.5(#2A,#2B)具有显著更高的MIC，特别是针-1
对细菌。CS-g-K12.5F12.5(#2B)针对细菌病原体具有的MIC为630μg ml 以上。具有较短聚(赖
氨酸-ran-苯丙氨酸)接枝的脱乙酰壳多糖CS-g-K8F8(#2A)显示更高的MIC，为2500μg ml-1
以上。这两个系列2成员，即CS-g-K8F8和CS-g-K12.5F12.5，显示相对良好的抗真菌活性，尽管
其抗细菌活性差。

[0181] 还比较了CS-g-KnFn(系列2)的MIC与KnFn接枝(#5B)的聚合形式的相应值：相比于对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌二者具有低的MIC(对于大肠杆菌为62μg ml-1,对于金黄色
葡萄球菌为31μg ml-1)的P(K12.5F12.5)(#5B)，CS-g-K12.5F12.5(#2B)的MIC对于三种细菌增加
超过5倍。

[0182] 之前的工作表明，含有疏水和阳离子氨基酸残基二者的KnFn的共肽(copeptide)(例如#5B)由于抗微生物生物大分子中对疏水性和阳离子电荷的要求而比K2n的均肽
(homopeptide)(例如#5A)具有更好的抗微生物活性。对比地，当前的结果是令人惊讶的，因
为尽管缺少疏水苯丙氨酸残基，系列1化合物仍具有优异的抗微生物活性，并且CS-g-K16和
CS-g-K25(#1D,#1E)显示比CS-g-K8F8和CS-g-K12.5F12.5(#2A,#2B)显著更好的抗微生物活性。

[0183] 在所测试的肽多糖共聚物中，CS-g-K16(#1D)具有最佳的抗微生物活性。看起来纯聚赖氨酸的接枝导致比包含赖氨酸和苯丙氨酸的共肽的接枝更好的抗微生物活性。还明显
的是，脱乙酰壳多糖主链显著促进接枝共聚物的抗微生物活性。脱乙酰壳多糖主链的疏水
性和赖氨酸的阳离子电荷被假定有助于增大接枝共聚物的效力。而且，看起来抗微生物活
性在共聚物的高聚赖氨酸加载下饱和：在9至25的接枝率之间存在非常低的MIC的平台，其
中CS-g-K16稍微好于其他两种。

[0184] 合成的抗微生物聚合物的分子量是调节这些聚合物的效力的另一个重要因素。迄4 -
今讨论的2个系列，即CS-g-Kn和CS-g-KnFn(#1A至#1E和#2A-#2B)，使用4.5×10g mol1的相
对低分子量的脱乙酰壳多糖。较高分子量的脱乙酰壳多糖(1.1×106g mol-1，在#1B-HMW中)
也用于研究分子量对抗微生物活性的作用。在多个反应步骤之后，通过气相色谱(GPC)确定
的CS-g-K3和CS-g-K3-HMW(#1B,#1B-HMW,表II)的数均分子量(Mn)分别为1.35×104g mol-1
4 -1
和29.2×10g mol 。

[0185] 在相同的赖氨酸接枝率下，较低分子量的CS-g-K3显示显著更低的针对所有五种病原体的MIC。CS-g-K3-HMW(#1B-HMW)的MIC大到为CS-g-K3(#1B)的MIC的4倍以上，表明较低
分子量的脱乙酰壳多糖导致更有效的抗微生物接枝共聚物。

[0186] 图3显示使用场致发射扫描电子显微镜(FESEM)，用CS-g-K16处理的各种病原体细胞的形态。用阳离子肽多糖(CS-g-K16，在MIC浓度)处理的微生物细胞相比于完整对照表现
出明显的形态学变化。与对照细胞的平滑表面不同，在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念
珠菌细胞上可以看到起皱的细胞壁。一些铜绿假单胞菌细胞膜受损至其细胞内容物漏出的
程度(参见，图3b(ii)中的箭头)，而对于金黄色葡萄球菌和白色念珠菌整个细胞坍塌。腐皮
镰刀菌细胞表面起皱并且在表面上观察到许多泡(白点)。所有这些结果表明CS-g-K16引起
微生物细胞的严重变化。

[0187] 图4显示通过大肠杆菌的存活/死亡染色的细菌生存力研究，完整细菌发绿荧光而阳离子肽多糖(CS-g-K16，在MIC浓度)处理的细菌发红荧光。绿色染料SYTO9进入完整和膜受
损细胞二者中，而红色碘化丙啶染料仅可以进入膜受损细胞中，并且减少绿色SYTO染料。观
察到的荧光行为表明，CS-g-K16使得大肠杆菌细胞膜对碘化丙啶是可渗透的。此外，与完整
大肠杆菌不同，死亡的细胞在用CS-g-K16处理后聚集在一起。

[0188] 通过添加膜电势敏感染料DiSC3(5)，图5示出了由CS-g-K16破坏的微生物膜，膜电势敏感染料DiSC3(5)被吸收到完整膜双层中并且在随后膜破坏后释放。在图5(a)中，第一
个峰指示DiSC3(5)的添加和逐渐结合到革兰氏阴性细菌大肠杆菌膜中。添加100μg ml-1浓
度的CS-g-K16(在约650s)，导致立即的荧光增加，这表明由于细胞膜破坏导致的染料释放。
在约1250s的荧光峰是由于染料通过短杆菌肽D(gramidicin D)的100%泄漏所致。结合
FESEM形态学研究和存活/死亡测定，此结果提供强烈的证据，CS-g-K16起作用破坏和/或使
细菌膜可渗透。图6示出了在用CS-g-K16攻击的革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌上的膜电势
敏感染料DiSC3(5)泄漏的类似结果。

[0189] 天然AMP的抗微生物活性通常归因于其二级结构如α–螺旋或β–片，所述二级结构促进其与细菌膜的相互作用。对α–螺旋或β–片AMP的作用机制已经提出各种理论，如“桶-板
(barrel-stave)”、“地毯(carpet)”和“环型(toroidal)”模型。进行圆二色性(CD)分析以评
估二级结构可能对CS-g-K16的抗微生物活性的贡献程度。图5(b)显示在具有0μM、5μM、500μM
小单层脂质体(POPC/POPG4:1)的磷酸钠缓冲液中的CS-g-K16的CD谱。POPC/POPG脂质囊泡是
阴离子细菌膜的模拟物。无论是否存在脂质体，CS-g-K16给出典型的无规线团谱(random 
coil spectrum)。因此，与大多数天然AMP不同，这些阳离子肽多糖以无规线团构象发挥其
抗微生物活性。二级结构可能对于良好抗微生物活性是不必要的可能性最近也已由他人报
道。

[0190] 细菌细胞壁通常带负电荷，这与其具体结构和组成无关。革兰氏阴性细菌细胞壁具有两个同心脂双层膜：细胞质(内)膜和外膜。革兰氏阴性细菌的外膜的外部小叶主要由
带高度负电的脂多糖(LPS)构成。细胞质膜由阴离子磷脂连同两性离子磷脂组成。革兰氏阳
性细菌典型地具有单一阴离子膜(细胞质膜)，和厚的暴露的肽聚糖层，该肽聚糖层富含阴
离子磷壁酸(teichoic acids)(壁磷壁酸(WTA)和脂磷壁酸(LTA))。当无论是革兰氏阴性还
是革兰氏阳性的细菌与阳离子肽多糖接触时，带负电的细胞壁(由于LPS或磷壁酸所致)和
带正电的肽多糖之间的静电相互作用是不可避免的。

[0191] 尽管不希望受限于理论，但提出所公开的阳离子肽多糖的以下抗菌模型，如图1(b)所示。首先，在非常邻近微生物表面处，阳离子肽多糖被静电吸引与阴离子微生物细胞
壁接触，具体地分别通过革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌中的LPS或磷壁酸。带负电的细菌细
胞壁，其通过二价阳离子稳定，用作有效的渗透屏障以限制分子进入和流出细胞。阳离子肽
多糖与带负电荷的细胞壁组分(如LPS或磷壁酸)的结合可能影响细胞壁中存在的其他阳离
子如Mg2+和Ca2+，改变细菌表面形态并增大膜渗透性和消除其屏障功能。

[0192] 接下来，随着阳离子肽多糖分子被吸引至并聚集在细胞壁上或之中，增加其渗透性，其与LPS和肽聚糖(其也含有多糖)的相容性，使得它们能够通过外膜和肽聚糖层，然后
到达细胞质膜。所公开的阳离子抗微生物聚合物与暴露的微生物细胞壁的结构类似性是之
前没有研究的独特特征。

[0193] 最后，在通过细菌细胞壁屏障后，阳离子肽多糖到达细胞质膜并如同“地毯”一样聚集在细胞质膜上/中，渗透然后当达到阈值浓度时分解双层，导致致死阶段。由于其随机
线团结构，所以可以假定更可能的是，阳离子肽多糖通过不需要特定结构的“地毯模型”机
制发挥其抗微生物活性。

[0194] 形态学和膜去极化结果支持所提出的机制。FESEM图像表现出起皱或溶解的细胞壁的形态变化(图2)。结合到细胞质膜中的DiSC3(5)染料在添加CS-g-K16后释放，这表明阳
离子肽多糖成功地穿过外膜或肽聚糖基质并透过内膜(参见，图5a和图6)。

[0195] 此提出的机制也可以解释MIC数据的许多特征。观察到，在低赖氨酸加载(例如，具有CS-g-K1和CS-g-K3)下，CS-g-Kn系列对革兰氏阴性细菌比对革兰氏阳性细菌更有效，因为
前者细菌细胞壁比革兰氏阳性细菌的细胞壁更阴离子性和亲水。相比于革兰氏阳性细胞
壁，低赖氨酸加载分子更强烈地被静电吸引至革兰氏阴性细胞壁。在高赖氨酸加载下，对于
两种类型的细菌的吸引都强烈，使得差异吸引较不明显并且对于两种类型的细菌的抗微生
物活性饱和，具有类似的低的MIC。而且，在对细胞壁组分具有类似组成亲和性但具有不同
大小的分子中，较高分子量的分子应较不容易通过细胞壁，导致降低的抗微生物效力。精确
地，相比于具有相同长度肽接枝的低MW对应物(#1B)，在用高分子量脱乙酰壳多糖制成的阳
离子肽多糖(#1B-HMW)的消除效力中观察到此作用。

[0196] 所公开的阳离子肽多糖具有与其抗细菌活性相当(在腐皮镰刀菌(F.solani)情况下，更好)的抗真菌活性。真菌细胞质膜是阴离子的并且被多糖(主要是几丁质，脱乙酰壳多
糖的原始来源)保护的细胞壁。与细菌一样，所述阳离子肽多糖由于其对细胞壁组分的结构
亲和性而能够通过多糖真菌细胞壁并破坏阴离子脂质双层，导致细胞死亡。暴露于CS-g-K16
的白色念珠菌细胞的坍塌和腐皮镰刀菌细胞的表面起皱(图2d(ii),e(ii))表明真菌细胞
壁和膜的严重破坏。

[0197] 还发现，系列1表现出极低的溶血活性：此系列中所有试剂的50%溶血浓度(HC50)大于50,000μg ml-1(表II)。对于具有最低MIC的CS-g-K16，即使在100,000μg ml-1的最高测试
浓度，溶血百分比仍低于50%(表II)。对于所有测试的细菌和真菌，CS-g-K16的HC50为其MIC
的几千倍，表明相对于人红细胞的对于微生物的极高度的选择性。相对于人红细胞，CS-g-
K16对于大肠杆菌的选择性超过10,000，这比同样通过NCA ROP合成的相关P(K10F15)多肽的
选择性(表II)显著优越，并且是报道的最高的。

[0198] CS-g-K16的生物相容性也通过MTT细胞生存力测定以及在有或没有阳离子肽多糖下哺乳动物平滑肌细胞(SMC)和病原体的共培养进行测试。图7(a)显示在暴露于不同浓度
的CS-g-K16达1h后通过MTT方法确定的SMC生存力。在500μg ml-1的CS-g-K16以下SMC存活没
有显著降低。补充有100μg ml-1CS-g-K16的培养基中的SMC增殖从1至5天在统计学上类似于
对照的SMC增殖(图7(b),p>0.05,无显著差异)。在SMC和大肠杆菌细菌的共培养中，CS-g-K16
抑制细菌生长但允许SMC生长。图7(c)和7(d)分别显示在没有任何抗生素但具有100μg ml-
1CS-g-K16的培养基中接种1×105个大肠杆菌后培养6h的SMC。细菌的存在明显干扰SMC生长
(图7(c))：SMC脱离培养板并具有圆形。在100μg ml-1CS-g-K16培养体系中，高浓度(10倍
MIC)的CS-g-K16破坏所有的大肠杆菌并且SMC铺展并附着至培养基质并且显示正常的纺锤
形。

[0199] 虽然已经设计了各种合成聚合物，但仅它们中的一些显示有效的抗微生物活性以及非溶血。它们中的大多数模拟典型地分离到不同阳离子和疏水结构域或相中的天然AMP
结构。尽管抗微生物活性可以通过优化阳离子/疏水比被显著改善，但是溶血或细胞毒性通
常也通过此优化增加。已证实各种优化的合成聚合物具有令人印象深刻的MIC但所有都是
相当溶血的(#5D至#6E,表1)。所公开的阳离子肽多糖显示优化的MIC，其中CS-g-K16的浓度
为5-20μg ml-1，这可与报道的最佳的抗微生物聚合物相比(#5D至#6E,表1)。然而，与其他现
有技术的抗微生物聚合物相比，CS-g-K16显示极低的溶血作用-HC50值高3至5个数量级-和
优异的生物相容性。

[0200] 与细菌和真菌细胞不同，哺乳动物细胞膜的外部小叶由两性离子磷脂和胆固醇组成，其使得静电荷为中性。在哺乳动物细胞膜的情况下，阳离子抗微生物分子缺少带负电荷
的靶标使得其疏水性对其破坏和渗透化是决定性的。脱乙酰壳多糖主链通常被认为是疏水
的并且熟知是无毒和低溶血材料。所公开的阳离子肽多糖具有侧部为阳离子侧枝的疏水核
心；在没有吸引分子与膜紧密接触的阴离子膜组分存在下，覆盖脱乙酰壳多糖疏水核心的
亲水分支使其不可能渗透到不带电荷的哺乳动物脂质双层的疏水内部中，而细菌双层中的
阴离子电荷使得这样的渗透更加可能。因此，阳离子肽多糖如CS-g-K16显示优异的非溶血作
用和生物相容性以及有效的抗微生物活性。

[0201] 所公开的脱乙酰壳多糖-接枝-聚赖氨酸，其是一种阳离子肽多糖，其针对临床重要的细菌和真菌显示显著的广谱活性并且相对于哺乳动物红细胞显示对病原体的高选择
性。这些阳离子肽多糖可以通过脱乙酰壳多糖上的α-氨基酸的NCA开环共聚容易地制备。已
发现，CS-g-K16对于革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌二者以及对于真菌特别有效，具有低的
MIC(5-20μg ml-1)但具有>100,000μg ml-1的极高HC50。还证实，CS-g-K16破坏细菌膜，从而引起死亡。令人感兴趣的是，可以在不存在疏水残基(苯丙氨酸)的情况下，利用具有仅含有阳
离子残基(赖氨酸)的接枝的CS-g-Kn系列优化抗微生物活性。所公开的CS-g-Kn系列的高抗
微生物效力和选择性可能是由于与细菌细胞壁肽聚糖类似但分别缺少哺乳动物细胞膜中
的肽聚糖和电荷所致。优异的广谱抗微生物活性和高选择性使得阳离子肽多糖在抗微生物
应用中具有有希望的前景。
实施例

[0202] 提供以下实施例以证实和进一步例示本发明的某些优选实施方案和方面，并且不被解释为限制本发明的范围。

[0203] 材料

[0204] 脱乙酰壳多糖低分子量(4.5×104g mol-1,90%脱乙酰化的)和高分子量(1.1×106g mol-1,80%脱乙酰化的),Nε-苄氧基羰基-L-赖氨酸,L-苯丙氨酸,三光气,四氢呋喃
(THF),邻苯二甲酸酐,三苯基氯甲烷,肼溶液,溴化氢(33%，在乙酸中),N,N-二甲基甲酰胺
(DMF),吡啶,三氟乙酸(TFA),氢氧化钠(NaOH),磷酸氢二钠,磷酸二氢钠,2-巯基乙醇,溴化
3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑 (MTT),二甲亚砜(DMSO),短杆菌肽D
(gramicidin D),戊二醛和四氧化锇购自Sigma-Aldrich Corp.(St Louis,US).Tris缓冲
液购自Vivantis Biochemical Company(Subang Jaya,Malaysia)。存活/死亡(LIVE/DEAD)
BacLight细菌生存力试剂盒L13152购自Invitrogen(Carlsbad,US)。所有细菌和真菌菌株
获自ATCC：大肠杆菌(ATCC8739),铜绿假单胞菌(ATCC9027),金黄色葡萄球菌(ATCC6538),
白色念珠菌(ATCC10231),和腐皮镰刀菌(ATCC36031)。所有肉汤和琼脂购自Becton 
Dickinson Company(Franklin Lakes,US)。

[0205] NCA单体的合成

[0206] NCA单体通过本领域已知的方法合成。简而言之，将10g的氨基酸悬浮在100mL无水THF中，并将该混合物加热至50℃，接着加入三分之一相等量的三光气并搅拌3h。然后过滤
反应混合物并将滤液倒入300mL己烷中并在-20℃储存24h以充分沉淀产物。然后过滤重结
晶的NCA单体，并用己烷清洗，并在50℃真空干燥过夜。

[0207] 6-O-三苯基甲基脱乙酰壳多糖的合成

[0208] 6-O-三苯基甲基脱乙酰壳多糖通过类似于由Yu等报道的方法制备。

[0209] N-邻苯二甲酰脱乙酰壳多糖：将5g脱乙酰壳多糖分散在100ml无水DMF中并在80℃搅拌1h以使其完全溶解。该溶液与13.8g邻苯二甲酸酐(93mmol)在130℃在Ar保护下反应
12h。此反应之后，产物在500ml乙醇中沉淀并过滤。产物用水、乙醇和二乙醚连续清洗，并在
真空干燥。

[0210] N-邻苯二甲酰-6-O-三苯基甲基脱乙酰壳多糖：将5g N-邻苯二甲酰脱乙酰壳多糖溶解在100ml无水吡啶中，然后加入15g(55mmol)三苯基氯甲烷。混合物在90℃在Ar保护下
搅拌24h，之后在真空蒸发溶剂并且产物用乙醇和二乙醚连续清洗。

[0211] 6-O-三苯基甲基脱乙酰壳多糖：将5g N-邻苯二甲酰-6-O-三苯基甲基脱乙酰壳多糖加入到100ml50重量%肼溶液中并在100℃在Ar保护下搅拌18h。然后，过滤该混悬液并且
残留物用水、乙醇和二乙醚连续清洗。

[0212] 脱乙酰壳多糖-g-NCA共聚物的合成

[0213] 脱乙酰壳多糖-g-NCA共聚物通过类似于由Yu等报道的方法制备。将6-O-三苯基甲基脱乙酰壳多糖分散在并且将NCA单体溶解在50ml无水DMF中并在室温搅拌5d，之后产物在
丙酮中沉淀并在真空干燥。为了获得最终共聚物，用HBr对6-O-三苯基甲基脱乙酰壳多糖-
g-NCA共聚物去保护。典型地，将1.0g所述共聚物溶解在15ml TFA中，加入10ml的HBr(33%，
在乙酸中)并将混合物在冰浴中搅拌4h。产物用丙酮沉淀，然后过滤并溶解在蒸馏水中，用
NaOH(1M)将pH调节至7。之后，产物用纤维素膜(Sigma,M.W.10334)透析，然后冷冻干燥。

[0214] 聚合物的表征

[0215] 合成的产物的NMR谱利用Bruker Avance DPX300仪器获得。利用装配有折光率检测器(RID)的Shimadzu LC-20AD仪器，使用PL-水凝胶-OH GPC柱和乙酸钠缓冲液(0.2M,
pH4.05)测量分子量和多分散性。样品在40℃以1.0ml min-1的洗脱液流速进行分析。

[0216] 最小抑制浓度(MIC):

[0217] 细菌细胞在MH肉汤中在37℃生长过夜至对数中期并稀释至104至105CFU ml-1。在96-孔微板上制备100μl在MH肉汤(YM肉汤用于真菌白色念珠菌和腐皮镰刀菌两者)中的产
物溶液的两倍稀释系列，接着加入100μl细菌悬浮液(104至105CFU mL-1)。该板在37℃温育
18-24h(对于真菌，28℃,36-48h)，并利用微板读数器(BIO-RAD,US)测量在600nm的吸光度。
阳性对照不具有产物，而阴性对照没有细菌/真菌接种物。MIC被确定为抑制细胞生长达高
于90%的最低浓度。

[0218] 微生物的形态学研究:

[0219] 在用MIC浓度的CS-g-K16处理15min后，利用FE-SEM考察由CS-g-K16诱发的微生物的形态学变化。在温育后，将微生物立即用戊二醛(2.5%,5ml)溶液固定4小时。在分级的乙
醇系列(20%-100%)中脱水并在氮气流下干燥后，样品用铂包被并利用FESEM(JEOL JSM-
6700F)对于微生物形态学变化进行成像。

[0220] 存活/死亡(LIVE/DEAD)测定以考察细菌生存力

[0221] 存活/死亡测定使用CS-g-K16以及大肠杆菌进行。制备在PBS中的大肠杆菌(108CFU ml-1)的悬浮液，接着以MIC浓度加入CS-g-K16；该混合物在37℃温育15min。在温育后，通过
离心收集细胞并在室温用BacLight细菌生存力试剂盒L13152(Invitrogen)染色30min。然
后利用荧光显微镜(Carl Zeiss,Germany)对细胞进行成像。

[0222] 膜去极化:

[0223] 细菌在对数中期收获，用20mM葡萄糖和5mM HEPES的缓冲溶液(pH7.4)清洗三次。将细菌重新悬浮在具有另外的0.1M KCl的清洗缓冲液中，然后与DiSC3(5)(20nM)温育直至
其结合到细胞膜中。以100μg ml-1的浓度添加CS-g-K16，并利用荧光分光计(PerkinElmer 
LS55,U.S.)在λex=620nm和λem=670nm监测荧光。最后，加入0.2nM短杆菌肽D(Gramicidin D)
以获得所述染料的充分释放。

[0224] 圆二色性(CD)

[0225] 使用小型挤出机(Avanti Polar Lipids-Mini Extruder,U.S.)制备POPC:POPG(摩尔比,4:1)小单层脂质体。将50μg ml-1CS-g-K16溶解在20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)中并
且使用圆二色谱仪(ChirascanTM,Applied Photophysics,UK)在室温在添加0、5和500μM脂
质体的情况下测量CD谱。

[0226] 溶血测定

[0227] 新鲜人血(5ml)收集自健康供体(年龄25岁,男性)。红细胞通过以1000rpm离心10min分离，用Tris缓冲液(10mM Tris,150mM NaCl,pH7.2)清洗三次并稀释至终浓度(5%,
v/v)。将混合有50μl红细胞原液的不同浓度的50μl抗微生物溶液加入到96-孔微板中并在
150rpm振荡下在37℃温育1h。该微板以1,000rpm离心10min。然后将上清的80μl等分试样转
移至新的96-孔微板并用另外的80μl Tris缓冲液稀释。溶血利用微板读数器(BIO-RAD,US)
作为在540nm的吸光度测得。完全溶血在Tris缓冲液加上0.1%Triton x-100作为阳性对照
中确定，同时Tris缓冲液用作阴性对照。溶血(H)的百分比使用以下公式计算：溶血=[(Op–
Ob)/(Ot–Ob)]x100%,其中Op是给定抗微生物剂浓度的密度，Ob是缓冲液的密度，并且Ot是
Triton x-100阳性对照的密度。

[0228] 体外生物相容性研究

[0229] 生物相容性研究利用平滑肌细胞(SMC)进行。将SMC在96-孔板中自每个孔1×105个细胞的初始接种物进行培养。制备在培养基中的分级浓度系列的CS-g-K16溶液，将其200μ
l添加到SMC培养物中。将细胞在37℃温育所需时间，然后具有CS-g-K16的培养基用新鲜DMEM
替换并加入20μl的MTT溶液(5mg ml-1，在PBS中)。在另外的4h温育后，除去MTT基质。加入100
μl DMSO并且将所述板以100rpm振荡15min。通过每个孔在490nm的吸光度测量细胞生存力。

[0230] 细菌和哺乳动物细胞的共培养

[0231] 将SMC在96-孔板中自每个孔1×105个细胞的接种物进行培养并在不含任何抗生素的培养基中在37℃温育24h。将1×105个细胞大肠杆菌接种在该SMC培养孔中。然后以100
μg ml-1的浓度将CS-g-K16加入在SMC和大肠杆菌共培养孔中。没有CS-g-K16的孔用作对照。
使用倒置光学显微镜(Carl Zeiss,Germany)对共培养物成像。

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[0276] 尽管本发明已参考以上实施例进行了描述，但是将理解，在本发明的精神和范围内涵盖更改和变形。因此，本发明仅受所附权利要求限制。