肺靶向纳米脂质体组合物及其制备方法和应用

摘要

本发明属于医药领域，特别是涉及靶向免疫脂质体领域，更为具体的说是涉及肺靶向纳米脂质体及其制备方法和应用。针对目前中药组方在脂质体领域的空白，创造性地公开了一种肺靶向纳米脂质体组合物，所述肺靶向纳米脂质体包括特异性肺组织靶向剂，中药提取组合物，以及纳米脂质体；所述特异性肺组织靶向剂为肺表面活性蛋白A，所述纳米脂质体是由磷脂、胆固醇以及抗氧化剂组成；所述中药提取组合物是以下组方药材的水提物。获得大小基本均一，形态为球形的肺靶向纳米脂质体组合物，其平均粒径在100~150nm，包封率在84%左右，克服了中药组方难于制成脂质体剂型的难题，为中药组方的应用开拓了更为广阔的前景。

权利要求

1.肺靶向纳米脂质体组合物，其特征是，所述肺靶向纳米脂质体包括特异性肺组织靶向剂，中药提取组合物，以及纳米脂质体；所述特异性肺组织靶向剂为肺表面活性蛋白A多抗，所述纳米脂质体是由磷脂、胆固醇以及抗氧化剂组成；所述中药提取组合物是以下重量份药材的水提物，生黄芪30份、生白术12份、北沙参12份、白花蛇舌草30份、蝉衣15份、山豆根15份、天冬12份、生南星30份、生牡蛎30份、瓜蒌皮15份、石见穿30份、石上柏30份；

所述磷脂与胆固醇的重量比为1:1~1:6；所述抗氧化剂在纳米脂质体中的质量百分数为0.5%~1%。

2.根据权利要求1所述的肺靶向纳米脂质体组合物，其特征是，所述抗氧化剂为维生素E。

3.根据权利要求1所述的肺靶向纳米脂质体组合物，其特征是，所述肺表面活性蛋白A多抗与磷脂比例为1~10μg：1μmol。

4.根据权利要求1所述的肺靶向纳米脂质体组合物，其特征是，所述磷脂选自蛋黄卵磷脂或二棕榈酰磷脂酰胆碱。

5.一种如权利要求1~4中任意一项所述肺靶向纳米脂质体组合物的制备方法，其特征是，包括以下步骤：（1）中药提取组合物的获得，

将生黄芪30份、生白术12份、北沙参12份、白花蛇舌草30份、蝉衣15份、山豆根15份、天冬12份、生南星30份、生牡蛎30份、瓜蒌皮15份、石见穿30份、石上柏30份用水煎煮三次，合并煎煮液，真空旋转蒸发去除水液，获得中药组方水提液浸膏；

真空恒温干燥箱放置过夜，获得中药提取组合物；

（2）将磷脂、胆固醇以及抗氧化剂溶于有机溶剂中，真空旋转蒸发去除有机溶剂，真空恒温干燥箱中挥干参与有机溶剂，制备得到空白脂质体；

（3）将步骤（1）中得到的中药提取组合物溶解于pH2~4的酸性缓冲盐溶液中，过滤，分别收集滤液和固体，所述滤液为酸性缓冲盐溶液溶解液；

（4）将步骤（3）中得到的固体溶解于pH8~10的碱性缓冲盐溶液中，过滤，分别收集滤液和固体，所述滤液为碱性缓冲盐溶液溶解液；

（5）重复步骤（3）、（4），分别合并多次得到酸性缓冲盐溶液溶解液、以及碱性缓冲盐溶液溶解液；

（6）将步骤（2）得到的空白脂质体30~50℃的条件下分别加入至酸性缓冲盐溶液溶解液、碱性缓冲盐溶液溶解液；120r/min旋转2小时，至水化完全后，用乳匀机降低粒径至

100~150nm，得到来源于酸性缓冲盐溶液溶解液的A部分脂质体，以及来源于碱性缓冲盐溶液溶解液的B部分脂质体；

（7）将肺表面活性蛋白A多抗巯基化，通过二硫苏糖醇使衍生化抗体还原，超滤去除游离二硫苏糖醇，移取抗体溶液分别与A部分脂质体、B部分脂质体混合，室温条件下搅拌放置过夜，制得肺表面活性蛋白A多抗偶联A部分脂质体、肺表面活性蛋白A多抗偶联B部分脂质体；

所述肺表面活性蛋白A多抗与磷脂比例为1~10μg：1μmol；

（8）真空冷冻干燥得到含有药物脂质体冻干粉；

（9）用pH2~4的酸性缓冲盐溶液复溶肺表面活性蛋白A多抗偶联B部分脂质体冻干粉，孵育得到肺表面活性蛋白A多抗偶联B部分脂质体；用pH8~10的碱性缓冲盐溶液复溶肺表面活性蛋白A多抗偶联A部分脂质体冻干粉，孵育得到肺表面活性蛋白A多抗偶联A部分脂质体；即得中药提取物的肺靶向纳米脂质体组合物。

6.根据权利要求5所述的肺靶向纳米脂质体组合物的制备方法，其特征是，所述肺表面活性蛋白A巯基化过程为，向肺表面活性蛋白A多抗溶液中加入N-琥珀酰亚胺-吡啶基-联巯基-丙酸酯乙醇溶液。

7.根据权利要求5所述的肺靶向纳米脂质体组合物的制备方法，其特征是，所述抗氧化剂为VE。

8.根据权利要求5所述的肺靶向纳米脂质体组合物的制备方法，其特征是，所述溶剂为等体积比的氯仿-甲醇混合溶液。

9.权利要求1所述肺靶向纳米脂质体组合物在制备抗肺癌药物中的应用。

说明书

肺靶向纳米脂质体组合物及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药领域，特别是涉及靶向免疫脂质体领域，更为具体的说是涉及肺靶向纳米脂质体及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 靶向纳米脂质体，特别是主动靶向纳米脂质体也可以叫做免疫脂质体，或者叫做机体修饰脂质体，其作用机理是：将单克隆抗体（也成为单抗或者配体）与特定脂质体偶联，构建形成免疫脂质体，该脂质体经单抗与靶细胞抗原-抗体特异性结合，可将脂质体靶向到特定细胞和器官。

[0003] 将脂质体本身做成纳米脂质体，由于纳米技术的介入，所以本身也具有了纳米技术带来增加药物溶解度，提高生物利用度，增加药物靶向作用的有益效果。

[0004] 纳米靶向载体正成为纳米技术与药物控释技术研究的热点。

[0005] 将生物靶向和纳米脂质体进行结合，也就是利用抗体、细胞膜表面受体或者特定基因片段的专业性作用，将配位子结合在纳米载体上，与目标细胞表面的抗原性识别器发生特异性结合，从而对病变组织细胞有的放矢，增加药效，避免对正常细胞的伤害。

[0006] 肺表面活性物质蛋白（ＳＰ）是由Ⅱ型肺泡细胞分泌的，是ＰＳ特异性结合蛋白。ＳＰ有两大类型，一类为分子较小的疏水性蛋白，一类为大分子的亲水性蛋白。其主要包括大分子亲水性的SP-A、SP-D和小分子疏水性的SP-B、SP-C，其中SP-A含量最为丰富，约占SP总量的50%。人类SP-A基因全长4.5kb，含有7个外显子，定位于10号染色体长臂q21-24，现已确定SP-A基因有3个，2个具有高度同源性的功能基因(SP-A1、SP-A2)和1个假基因。目前已发现SP-A1和SP-A2具有多个等位基因。SP-A结构上包括胶原样区和C型植物凝集素样区，胶原样区为多聚化三联螺旋体结构，位于肽链N端；植物凝集素样区为大的球状结构，位于肽链C端，此区域具有钙依赖性糖识别位点。

[0007] SP-A主要在肺泡Ⅱ型上皮细胞中合成，单体由248个氨基酸组成，分子量为26000～38000。2个SP-A1和1个SP-A2通过分子间二硫键形成3聚体，6个3聚体亚单位再通过胶原样区折叠而构成18聚体，结构类似于补体C1q，分子量约为700000。表面活性物质中SP-A全部以多聚体的形式出现。

[0008] SP-A在肺外表达量很少，在肺内则为高浓度表达，表现为肺特异性。

[0009] 中药，特别是中药组方对于疾病的治疗有着非常显著的效果。但是，中药组方由于成分复杂，很难制成脂质体。因此目前可见的在中药领域的脂质体应用，大部分集中在中药化学成分，单体提取化合物的脂质体应用中。对于中药当中药效较为显著的组方提取物还没有相关的脂质体报道，更不用说特异性的肺靶向纳米脂质体组合物，极大限制了中药在脂质体领域的发展。

发明内容

[0010] 本发明的目的在于提供一种中药组合物，更为具体的说是一种抗肺癌中药配方水提液的肺靶向纳米脂质体组合物。

[0011] 本发明的另一目的在于提供这种肺靶向纳米脂质体的制备方法和应用。

[0012] 本发明公开了一种肺靶向纳米脂质体组合物，所述肺靶向纳米脂质体包括特异性肺组织靶向剂，中药提取组合物，以及纳米脂质体；所述特异性肺组织靶向剂为肺表面活性蛋白A，所述纳米脂质体是由磷脂、胆固醇以及抗氧化剂组成；所述中药提取组合物是以下重量份药材的水提物，

[0013] 生黄芪30份、生白术12份、北沙参12份、白花蛇舌草30份、蝉衣15份、山豆根15份、天冬12份、生南星30份、生牡蛎30份、瓜蒌皮15份、石见穿30份、石上柏30份；

[0014] 所述磷脂与胆固醇的重量比为1:1～1:6；所述抗氧化剂在纳米脂质体中的质量百分数为0.5%～1%。

[0015] 进一步地，所述抗氧化剂为维生素E。

[0016] 进一步地，所述肺表面活性蛋白A多抗与磷脂比例为1～10μg：1μmol。

[0017] 进一步地，所述磷脂选自蛋黄卵磷脂或二棕榈酰磷脂酰胆碱。

[0018] 同时，本发明还公开了一种肺靶向纳米脂质体组合物的制备方法，包括以下步骤：（1）中药提取组合物的获得，

[0019] 将生黄芪30份、生白术12份、北沙参12份、白花蛇舌草30份、蝉衣15份、山豆根15份、天冬12份、生南星30份、生牡蛎30份、瓜蒌皮15份、石见穿30份、石上柏30份用水煎煮三次，合并煎煮液，真空旋转蒸发去除水液，获得中药组方水提液浸膏；

[0020] 真空恒温干燥箱放置过夜，获得中药提取组合物；

[0021] （2）将磷脂、胆固醇以及抗氧化剂溶于有机溶剂中，真空旋转蒸发去除有机溶剂，真空恒温干燥箱中挥干参与有机溶剂，制备得到空白脂质体；

[0022] （3）将步骤（1）中得到的中药提取组合物溶解于pH2～4的酸性缓冲盐溶液中，过滤，分别收集滤液和固体，所述滤液为酸性缓冲盐溶液溶解液；

[0023] （4）将步骤（3）中得到的固体溶解于pH8～10的碱性缓冲盐溶液中，过滤，分别收集滤液和固体，所述滤液为碱性缓冲盐溶液溶解液；

[0024] （5）重复步骤（3）、（4），分别合并多次得到酸性缓冲盐溶液溶解液、以及碱性缓冲盐溶液溶解液；

[0025] （6）将步骤（2）得到的空白脂质体30～50℃的条件下分别加入至酸性缓冲盐溶液溶解液、碱性缓冲盐溶液溶解液；120r/min旋转2小时，至水化完全后，用乳匀机降低粒径至100～150nm，得到来源于酸性缓冲盐溶液溶解液的A部分脂质体，以及来源于碱性缓冲盐溶液溶解液的B部分脂质体；

[0026] （7）将肺表面活性蛋白A巯基化，通过二硫苏糖醇使衍生化抗体还原，超滤去除游离二硫苏糖醇，移取抗体溶液分别与A部分脂质体、B部分脂质体混合，室温条件下搅拌放置过夜，制得肺表面活性蛋白A多抗偶联A部分脂质体、肺表面活性蛋白A多抗偶联B部分脂质体；

[0027] 所述肺表面活性蛋白A多抗与磷脂比例为1～10μg：1μmol；

[0028] （8）真空冷冻干燥得到含有药物脂质体冻干粉；

[0029] （9）用pH2～4的酸性缓冲盐溶液复溶肺表面活性蛋白A多抗偶联B部分脂质体冻干粉，孵育得到肺表面活性蛋白A多抗偶联B部分脂质体；用pH8～10的碱性缓冲盐溶液复溶肺表面活性蛋白A多抗偶联A部分脂质体冻干粉，孵育得到肺表面活性蛋白A多抗偶联A部分脂质体；即得中药提取物的肺靶向纳米脂质体组合物。

[0030] 进一步地，所述肺表面活性蛋白A巯基化过程为，向肺表面活性蛋白A多抗溶液中加入N-琥珀酰亚胺-吡啶基-联巯基-丙酸酯乙醇溶液。

[0031] 同时，本发明还进一步公开了所述肺靶向纳米脂质体组合物在制备抗肺癌药物中的应用。

[0032] 通过本发明，可以获得大小基本均一，形态为球形的肺靶向纳米脂质体组合物，其平均粒径在100～150nm，包封率在84%左右，克服了中药组方难于制成脂质体剂型的难题，为中药组方的应用开拓了更为广阔的前景。

附图说明

[0033] 图1为肺靶向纳米脂质体透射电镜下照片。

具体实施方式

[0034] 除非特殊说明，本发明中所使用的试剂和仪器均为市售产品。

[0035] 实施例1

[0036] 将生黄芪30份、生白术12份、北沙参12份、白花蛇舌草30份、蝉衣15份、山豆根15份、天冬12份、生南星30份、生牡蛎30份、瓜蒌皮15份、石见穿30份、石上柏30份用水煎煮三次，合并煎煮液，得到中药组合物水提液。

[0037] 实施例2

[0038] 构建肺癌裸小鼠模型

[0039] 由中国科学院上海实验动物中心购买裸小鼠30只，雌雄各半，体重在16～20g，6～8周龄。

[0040] 在每只裸小鼠右腋部皮下接种细胞浓度为1.5х107/mlLAX-83人肺腺癌细胞（购自中国科学院上海分院药物研究所），使用前按照刘权章，人类染色体方法学（人民卫生出版社，1992:55-61）进行鉴定。

[0041] 将接种后的裸小鼠随机分成3组，每组10只，雌雄各半。

[0042] （1）空白荷瘤对照组，以生理盐水0.2ml灌胃21天。

[0043] （2）中药提取物组，将实施例1中得到的中药组合物水提液真空旋转蒸发浓缩至每毫升含生药3.22g。用生理盐水稀释至0.2ml药液相当于60g/kg的药量，并且以0.2ml为一个单位灌胃21天。

[0044] （3）顺铂组，购买市售的顺铂抗癌产品（本实验中采用齐鲁制药厂生产的注射用顺铂），并参考张素胤、戴志强等于1987年在中药药理学报发表的“人肺腺癌裸小鼠模型的建立及此移植瘤对抗癌药物的敏感性”的用法用量，以1mg/kg，每日腹腔注射一次，注射21天。

[0045] 接种后次日开始用药，用药结束后，即第22天处死裸小鼠，并解剖取出肿瘤，称重得到瘤重，并计算重量抑制率（重量抑制率（%）=（1-治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重）х100%）。实验结果如表1：

[0046] 表1对LAX-83人肺腺癌细胞的抑制作用

[0047]组别 试验终点动物数 瘤重（g） 抑制率（%）
空白荷瘤对照组 9 2.75±0.50 ——
中药提取物组 8 1.45±0.50 47.27%
顺铂组 8 1.52±0.50 44.73%

[0048] 由表1中可以看到，中药提取物组的抑瘤率>30%，说明具有显著的抑瘤作用。统计学分析，中药提取物组与空白荷瘤对照组比较，差异显著（P<0.05），顺铂组与空白荷瘤对照组比较，统计学差异（P<0.05），中药提取物组与顺铂组无显著性差异（P>0.05）。

[0049] 实施例3

[0050] 1、按照如下方法，制备得到肺靶向纳米脂质体组合物

[0051] （1）中药提取组合物的获得，

[0052] 将生黄芪30份、生白术12份、北沙参12份、白花蛇舌草30份、蝉衣15份、山豆根15份、天冬12份、生南星30份、生牡蛎30份、瓜蒌皮15份、石见穿30份、石上柏30份用水煎煮三次，合并煎煮液，真空旋转蒸发去除水液，获得中药组方水提液浸膏；

[0053] 真空恒温干燥箱放置过夜，获得中药提取组合物；

[0054] （2）将磷脂、胆固醇以及抗氧化剂溶于有机溶剂中，真空旋转蒸发去除有机溶剂，真空恒温干燥箱中挥干参与有机溶剂，制备得到空白脂质体；

[0055] （3）将步骤（1）中得到的中药提取组合物溶解于pH2～4的酸性缓冲盐溶液中，过滤，分别收集滤液和固体，所述滤液为酸性缓冲盐溶液溶解液；

[0056] （4）将步骤（3）中得到的固体溶解于pH8～10的碱性缓冲盐溶液中，过滤，分别收集滤液和固体，所述滤液为碱性缓冲盐溶液溶解液；

[0057] （5）重复步骤（3）、（4），分别合并多次得到酸性缓冲盐溶液溶解液、以及碱性缓冲盐溶液溶解液；

[0058] （6）将步骤（2）得到的空白脂质体30～50℃的条件下分别加入至酸性缓冲盐溶液溶解液、碱性缓冲盐溶液溶解液；120r/min旋转2小时，至水化完全后，用乳匀机降低粒径至100～150nm，得到来源于酸性缓冲盐溶液溶解液的A部分脂质体，以及来源于碱性缓冲盐溶液溶解液的B部分脂质体；

[0059] （7）将肺表面活性蛋白A巯基化，通过二硫苏糖醇使衍生化抗体还原，超滤去除游离二硫苏糖醇，移取抗体溶液分别与A部分脂质体、B部分脂质体混合，室温条件下搅拌放置过夜，制得肺表面活性蛋白A多抗偶联A部分脂质体、肺表面活性蛋白A多抗偶联B部分脂质体；

[0060] 所述肺表面活性蛋白A多抗与磷脂比例为1～10μg：1μmol；

[0061] （8）真空冷冻干燥得到含有药物脂质体冻干粉；

[0062] （9）用pH2～4的酸性缓冲盐溶液复溶肺表面活性蛋白A多抗偶联B部分脂质体冻干粉，孵育得到肺表面活性蛋白A多抗偶联B部分脂质体；用pH8～10的碱性缓冲盐溶液复溶肺表面活性蛋白A多抗偶联A部分脂质体冻干粉，孵育得到肺表面活性蛋白A多抗偶联A部分脂质体；即得中药提取物的肺靶向纳米脂质体组合物。

[0063] 其中，抗氧化剂选用维生素E。

[0064] 有机溶剂选用1:1（V：V）的氯仿-甲醇混合溶液。

[0065] 实施例4

[0066] 将实施例3中得到的孵育后的肺表面活性蛋白A多抗偶联B部分脂质体悬液，[0067] 至于截留分子量为10KD的超滤管中，5000～10000r/min离心30min以上，去除游离碱性缓冲盐溶液溶解物。

[0068] 同样将实施例3中得到的孵育后的肺表面活性蛋白A多抗偶联A部分脂质体悬液，至于截留分子量为10KD的超滤管中，5000～10000r/min离心30min以上，去除游离酸性缓冲盐溶液溶解物。

[0069] 将成功包封的肺靶向纳米脂质体进行透射电镜实验，结果见图1。

[0070] 可以看出所形成的脂质体呈球形，大小基本均一，粒径100～150nm。

[0071] 从而表明通过本发明所公开的方法，成功获得了包裹有中药组方提取物的肺靶向纳米脂质体。为中药组方的进一步临床应用提供了广阔的空间。

[0072] 实施例5

[0073] 实验例

[0074] 将实施例3中得到的孵育后的肺表面活性蛋白A多抗偶联B部分脂质体悬液，[0075] 至于截留分子量为10KD的超滤管中，5000～10000r/min离心30min以上，去除游离碱性缓冲盐溶液溶解物，获得肺表面活性蛋白A多抗偶联B部分脂质体。同样将实施例3中得到的孵育后的肺表面活性蛋白A多抗偶联A部分脂质体悬液，至于截留分子量为10KD的超滤管中，5000～10000r/min离心30min以上，去除游离酸性缓冲盐溶液溶解物，获得肺表面活性蛋白A多抗偶联B部分脂质体。

[0076] 将这两种成功包封的脂质体混合，形成肺表面活性蛋白A多抗偶联中药提取物脂质体。

[0077] 对比例采用常规的薄膜-超声法制备肺表面活性蛋白A多抗偶联中药提取物脂质体

[0078] 按照实施例3中步骤（1）的方式，将生黄芪30份、生白术12份、北沙参12[0079] 份、白花蛇舌草30份、蝉衣15份、山豆根15份、天冬12份、生南星30份、生牡蛎30份、瓜蒌皮15份、石见穿30份、石上柏30份用水煎煮三次，合并煎煮液，真空旋转蒸发去除水液，获得中药组方水提液浸膏；

[0080] 真空恒温干燥箱放置过夜，获得中药提取组合物。

[0081] 将中药提取组合物，磷脂，胆固醇，抗氧化剂置于圆底烧瓶中，用氯仿-甲醇（1:1体积比）的混合溶剂溶解，真空旋转蒸发蒸除溶剂，在瓶体内壁形成均匀的磷脂薄膜。将该圆底烧瓶于40℃真空恒温干燥箱中放置过夜，挥干残余有机溶剂。加入pH7.4的磷酸盐缓冲液漩涡震荡5min，超声2小时，即得脂质体悬浮液。将肺表面活性蛋白A巯基化，通过二硫苏糖醇使衍生化抗体还原，超滤去除游离二硫苏糖醇，移取抗体溶液与薄膜-超声法制备得到的脂质体悬浮液混合，室温条件下搅拌放置过夜，制得肺表面活性蛋白A多抗偶联中药提取物脂质体；考察：将本发明获得的肺表面活性蛋白A多抗偶联中药提取物脂质体与常规方法获得的肺表面活性蛋白A多抗偶联中药提取物脂质体进行包封率测定，测定方法参考现有公开文献中的方法。

[0082] 结果如表2：

[0083] 表2

[0084]

[0085] 结果表明通过本发明获得的肺表面活性蛋白A多抗偶联中药提取物脂质体包封率高，可以用于中药提取物的靶向脂质体制备。

[0086] 实施例6稳定性实验

[0087] 将实施例3中得到的孵育后的肺表面活性蛋白A多抗偶联B部分脂质体悬液，至于截留分子量为10KD的超滤管中，5000～10000r/min离心30min以上，去除游离碱性缓冲盐溶液溶解物，获得肺表面活性蛋白A多抗偶联B部分脂质体。同样将实施例3中得到的孵育后的肺表面活性蛋白A多抗偶联A部分脂质体悬液，至于截留分子量为10KD的超滤管中，5000～10000r/min离心30min以上，去除游离酸性缓冲盐溶液溶解物，获得肺表面活性蛋白A多抗偶联B部分脂质体。

[0088] 将这两种成功包封的脂质体混合，形成肺表面活性蛋白A多抗偶联中药提取物脂质体，制成脂质体混悬液用于考察脂质体稳定性。

[0089] 将脂质体混悬液于4℃防止4周，检测其包封率变化，发现无显著性变化（P>0.05），说明样品放置稳定。稳定性实验数据见表3：

[0090] 表3

[0091]放置时间/周 包封率（%）
0 85.32±3.25
1 83.26±4.23
2 81.05±3.26
3 79.53±4.85
4 78.68±4.59