一种荧光分子探针及其在硫化氢检测中的应用转让专利
申请号 : CN201410071543.2
文献号 : CN103865522B
文献日 : 2015-12-02
发明人 : 蔡云波 , 秦安军 , 唐本忠 , 孙景志
申请人 : 浙江大学
摘要 :
本发明公开了一种荧光分子探针及其在硫化氢检测中的应用，该荧光分子探针的结构为R1-N3，其中，R1为具有聚集诱导发光性能的基团。原理为该含叠氮官能团的分子由于叠氮的猝灭作用在溶液中或者聚集态均不发光，而利用硫化氢对叠氮官能团的还原后生成的含氨基的分子则呈现AIE的特性，从而实现聚集态下对硫化氢浓度的检测。原理为由于聚集态下残留的叠氮基团会导致整个聚集体的荧光猝灭，所以探针分子的发光只能在叠氮基团大部分被还原后才能被“打开”，从而实现了通过调控探针分子的浓度得以调控检测限和有效检测范围。
权利要求 :
1 1
1.一种荧光分子探针，其特征在于，结构为R -N3，其中，R选自式(Ⅰ)～式(Ⅳ)中的一种；
式(Ⅰ)中，R2～R4独立地选自芳基、烷基、烷氧基或者H；
式(II)中，R5和R6选自C1～C5烷基或者芳基；
“～～～～”代表取代位置。
2.根据权利要求1所述的荧光分子探针，其特征在于，所述的R1的结构如式(Ⅰ-1)所示：式(Ⅰ-1)中，“～～～～”代表取代位置。
3.一种硫化氢浓度的检测方法，其特征在于，将含硫化氢或者HS-的待测液与权利要求1～2任一项所述的不同浓度的荧光分子探针混合后测定其荧光强度，若混合后发射荧光，则根据荧光探针分子的浓度确定硫化氢或者HS-的浓度；
所述的荧光分子探针为聚集态。
4.根据权利要求3所述的硫化氢浓度的检测方法，其特征在于，将所述的荧光分子探针的二甲基亚砜溶液滴加到pH为6.5-8.0的缓冲溶液中即可得到聚集态的荧光分子探针；
所述的二甲基亚砜溶液与缓冲溶液的体积比为1～3：9～7。
5.根据权利要求4所述的硫化氢浓度的检测方法，其特征在于，所述的缓冲溶液为pH为7.4的HEPES缓冲液；
所述的二甲基亚砜溶液与HEPES缓冲液的体积比为2:8。
6.根据权利要求4所述的硫化氢浓度的检测方法，其特征在于，所述的硫化氢的检测限通过荧光分子探针在聚集态中的浓度进行调节；
所述的硫化氢的检测限为0-100μM。
7.根据权利要求6所述的硫化氢浓度的检测方法，其特征在于，所述的硫化氢的检测限在10～50μM范围内调整。
说明书 :
一种荧光分子探针及其在硫化氢检测中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及化学检测和生物检测领域，具体涉及一种新型的荧光分子探针及其在硫化氢检测中的应用。
背景技术
[0002] 硫化氢（H2S）作为一种内源性的气体信号分子，参与了生物体内的众多生理过程，与众多疾病相关。硫化氢参与了众多生理过程，包括血管扩张、血管生成、氧传感、细胞凋亡、组织炎症、神经调节过程以及外伤和缺血保护等。同时，人体内硫化氢水平高低，可能暗示着人体内一些疾病的存在，包括阿尔茨海默病、唐氏综合症、糖尿病以及肝硬化。但是硫化氢在生物体内的作用、作用机理尚无定论，对硫化氢的检测和浓度的确定显得尤为重要。生物体内硫化氢的浓度在怎样的范围内才能让其发挥应有的作用？反过来，在确定生物体内正常的硫化氢含量后，也有助于研究硫化氢参与的各个生理过程的具体机理。
[0003] 近期，有文献报道使用单壁纳米碳管和量子点作为荧光探针在非生物体系中检测硫化氢，检测限分别到了3ppb（具体参见：Anal.Chem.2010,82,250-257）和0.15μM（具体参见：J.Fluoresc.2010,20,243-250）。这两种方法对硫化氢检测都具有非常好的灵敏度和选择性，但是无法引入细胞内部。根据同样思路，有人开发了基于荧光分子的硫化氢检测手段。通过探针分子与硫化氢反应，产生荧光增强或猝灭，再通过检测荧光强度的变化，来定性或定量测定体系中的硫化氢，是这种检测手段的基本思路。Xian等人设计了一个含二硫键的无荧光分子作为探针（具体参见：Angew Chem.Int.Ed.2011,50,10327-10329），与硫化氢作用后产生能发射很强荧光的分子，通过检测荧光的强度的变化，可以确定硫化氢含量。根据类似原理，Wang等人设计了一个新型的、稳定的无荧光分子——丹酰基叠氮（具体参见：Angew Chem.Int.Ed.2011,50,9672-9675），在被硫化氢还原后可以发射强烈的荧光。硫化氢的荧光检测法具有操作简单，响应迅速等优点。
[0004] 然而，大多数有机发光材料在聚集态或固态时通常会呈现发光效率降低甚至不发光的现象，即聚集荧光猝灭（ACQ），这就极大的限制了有机发光材料的应用范围。
[0005] 2001年，唐本忠教授领导的研究组观察到了一个与传统的ACQ现象相反的光物理现象：一系列硅杂环戊二烯（silole）分子在溶液中不发光，而在聚集后却发射很强的荧光（具体参见：Chem.Commun.,2001,1740）。唐随即将这一独特现象定义为“聚集诱导发光”（Aggregation-Induced Emission,AIE）。AIE现象具有十分重大的学术意义，人们不再需要刻意的去避免难以避免的聚集现象的发生，因为聚集有益于发光。之后，他们发现了很多具有类似螺旋桨结构的分子具有同样的性质，在越来越多的新型AIE体系被开发出来的同时，AIE分子也作为荧光探针及电致发光材料被广泛的应用于分析检测、生物传感及电致发光器件等多个领域(具体参见：Chem Soc Rev,2011,5361；Chem.Commun.2009,4332)。
[0006] 虽然可以预计AIE分子在硫化氢检测方面将有独特的优势，但目前却尚未见报道。常规的检测硫化氢的荧光探针分子表现为聚集猝灭荧光的行为，所以只能在溶液中实现对硫化氢的检测。矛盾在于，有机探针分子往往不溶于水，而对硫化氢的检测需要在水相中进行，另外，生物体系的介质通常为水。在这些介质中检测将大大降低荧光探针分子的性能。而如果将AIE分子用来检测硫化氢，即使是在水中，探针分子形成了聚集态，由于其AIE性能，也可以发射荧光，实现对硫化氢的高灵敏检测。因此，采用AIE活性的分子作为探针来实现对硫化氢的检测具有重要的科学意义和在非有机溶剂体系的应用价值。
发明内容
[0007] 本发明提供了一种荧光分子探针及其在硫化氢检测中的应用，该荧光分子探针能够在非有机溶剂体系中基于检测限可以调节的原理实现硫化氢浓度的简易检测。
[0008] 一种荧光分子探针，结构为R1-N3，其中，R1为具有聚集诱导发光性能的基团。
[0009] 本发明中，R1-N3聚集体与硫化氢发生反应生成R1-NH2，反应式如下：
[0010]1
[0011] 由于叠氮官能团的荧光猝灭作用导致分子R-N3在溶液中或聚集态下均不发光，而与硫化氢作用后生成的R-NH2分子可在聚集态下发光，从而实现非有机溶剂体系中硫化氢的检测；另外，由于聚集态下残留的叠氮基团可能会导致整个聚集体的荧光猝灭，所以荧光只能在叠氮基团全部反应后才能被“打开”。这样，就实现了硫化氢检测限的调节。1
[0012] 作为优选，所述的R选自式（Ⅰ）～式（Ⅳ）中的一种；
[0013]
[0014] 式（Ⅰ）中，R2～R4独立地选自芳基、烷基、烷氧基或者H；
[0015] 式（II）中，R5和R6选自C1～C5烷基或者芳基；
[0016] “*”代表取代位置。
[0017] 作为进一步的优选，所述的R1的结构如式（Ⅰ-1）所示：
[0018]
[0019] 式（Ⅰ-1）中，“*”代表取代位置。此时，所述的荧光分子探针对硫化氢的检测具有专一性，对除了硫氢根以外的其他阴离子没有响应；并且该荧光分子探针对硫化氢的检测具有抗干扰性，当有其他阴离子存在时，不影响其对硫氢根离子的响应。
[0020] 本发明还提供了一种硫化氢浓度的检测方法，将含硫化氢或者HS-的待测液与所述的不同浓度的荧光分子探针混合后测定其荧光强度，若混合后发射荧光，则确定待测液中硫化氢或者HS-的浓度
[0021] 所述的荧光分子探针为聚集态。
[0022] 作为进一步的优选，将所述的荧光分子探针的二甲基亚砜溶液滴加到pH为6.5-8.0的缓冲溶液中即可得到聚集态的荧光分子探针；
[0023] 所述的二甲基亚砜溶液与缓冲溶液的体积比为1～3：9～7。
[0024] 作为更进一步的优选，所述的缓冲溶液为pH为7.4的HEPES缓冲液；
[0025] 所述的二甲基亚砜溶液与HEPES缓冲液的体积比为2:8。
[0026] 作为优选，所述的硫化氢的检测限通过荧光分子探针在聚集态中的浓度进行调节；
[0027] 所述的硫化氢的检测限为0-100μM；在该范围内，检测的专一性好，响应迅速。
[0028] 作为进一步的优选，所述的硫化氢的检测限在10～50μM范围内调整。
[0029] 与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0030] （1）对硫化氢的检测具有专一性、抗干扰性、响应迅速等特点，本发明还具有以下独特性能：
[0031] （2）R1-N3的聚集体与硫化氢作用还原生成的R1-NH2，由于AIE的特性使其发射荧光，所以该检测手段可以应用于水相，解决了传统的探针分子由于其ACQ效应在水相呈聚集态不发光而检测需要在水相进行的矛盾。另外，由于聚集态下残留的叠氮基团可能会导致整个聚集体的荧光猝灭，所以荧光只能在叠氮基团全部反应后才能被“打开”。这样，就实现了通过调整探针分子的浓度可以调控检测限的独特性能。
附图说明
[0032] 图1是实施例1制得的探针分子四苯基乙烯叠氮分子在DMSO-d6中的核磁共振氢谱（图中“*”代表溶剂峰）；
[0033] 图2是实施例1制得的参比物氨基四苯基乙烯分子在CDCl3中的核磁共振氢谱（图中“*”代表溶剂峰）；
[0034] 图3是氨基四苯基乙烯分子的AIE曲线，其中，A为氨基四苯基乙烯在水分含量不同的二甲基亚砜/水的混合溶液中的发光光谱，B为发光的峰值强度随水分含量的变化；
[0035] 图4是四苯基乙烯叠氮分子检测硫化氢的存在；
[0036] 图5是四苯基乙烯叠氮分子与不同阴离子的作用曲线，A为四苯基乙烯叠氮分子与不同阴离子和硫化氢作用后的发光光谱；B为四苯基乙烯叠氮分子与不同阴离子和硫化氢作用后发光的峰值强度增强倍数；
[0037] 图6是四苯基乙烯叠氮分子在不同阴离子的存在下对硫化氢检测的抗干扰性，A为在其他离子存在下，四苯基乙烯叠氮分子与硫化氢作用后的发光光谱；B为在其他离子存在下，四苯基乙烯叠氮分子与硫化氢作用后发光的峰值强度增强倍数；
[0038] 图7是四苯基乙烯叠氮分子浓度为10μM时定量检测硫化氢；
[0039] 图8是四苯基乙烯叠氮分子浓度为20μM时定量检测硫化氢；
[0040] 图9是四苯基乙烯叠氮分子浓度为50μM时定量检测硫化氢。
具体实施方式
[0041] 本发明在聚集态下检测硫化氢的荧光探针分子，合成路线为：
[0042] 四苯基乙烯叠氮分子的合成路线：将二苯甲烷溶解在四氢呋喃中，在氮气保护下与丁基锂反应，得到的溶液滴加进4-溴二苯甲酮的四氢呋喃溶液中，得到第一中间体9；将9溶解于甲苯，加入对甲基苯磺酸作为脱水剂，脱水后得到溴代四苯基乙烯10；将10溶解于四氢呋喃中，在氮气保护下与正丁基锂反应后再滴加对甲基苯磺酰叠氮，得到四苯基乙烯叠氮（1）。
[0043]
[0044] 下面结合实施例对本发明进行具体地描述，但本发明的保护范围不限于以下实施例。
[0045] 实施例1
[0046] （1）AIE活性四苯基乙烯叠氮衍生物的合成：
[0047] 称取二苯甲烷（5.5g,32.8mmol）加入500mL双口圆底烧瓶中，置于液氮丙酮浴中，抽真空通氮气三次，加入100mL新蒸四氢呋喃溶解，缓慢滴入正丁基锂（18.75mL,30mmol），将4-溴二苯甲酮（7.8g,30mmol）溶于适量的新蒸四氢呋喃中，加入到反应体系，体系恢复到室温，过夜。用饱和氯化铵终止反应，萃取后所得中间体9的粗产物用适量甲苯溶解，加入500mg对甲基苯磺酸，回流过夜。旋干溶剂，萃取洗涤后得到的粗产物以硅胶柱色谱分离纯化（石油醚为淋洗剂），得白色固体溴代四苯基乙烯10（9.897g，产率80.2%）。
[0048] 将10（617mg,1.5mmol）加入250mL双口圆底烧瓶中，抽真空换氮气三次，加入50mL四氢呋喃溶解，液氮丙酮浴下滴加正丁基锂（1.125mL,1.8mmol），保持低温1.5小时后，称取对甲基苯磺酰叠氮（345.7mg，1.8mmol），溶解于10mL四氢呋喃中，加入到双口瓶中。缓慢升至室温后反应过夜。加水终止反应，用二氯甲烷萃取，干燥有机相，旋干，所得粗产物用硅胶柱色谱分离纯化（石油醚为淋洗剂），得黄色固体四苯基乙烯叠氮（517mg,产率92.3%）。核磁氢谱谱图见图1。
[0049] 四苯基乙烯叠氮的表征数据为：IR(KBr),v(cm-1)：3083,2124,1498,1287,823,751
5,695.H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(TMS,ppm):7.10-7.14(m,9H),6.96-7.00(m,8H),6.89(
13
d,2H). CNMR(400MHz,DMSO-d6),δ(TMS,ppm):143.5,143.4,141.3,140.5,140.1,137.9,1
32.8,131.1,128.3,127.1.Anal.Calcd for C26H19N3:C,83.62;H,5.13;N,11.25;Found:C,8
3.85;H,5.11;N,10.99.
5,695.H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(TMS,ppm):7.10-7.14(m,9H),6.96-7.00(m,8H),6.89(
13
d,2H). CNMR(400MHz,DMSO-d6),δ(TMS,ppm):143.5,143.4,141.3,140.5,140.1,137.9,1
32.8,131.1,128.3,127.1.Anal.Calcd for C26H19N3:C,83.62;H,5.13;N,11.25;Found:C,8
3.85;H,5.11;N,10.99.
[0050] （2）参比物氨基四苯基乙烯的合成：
[0051] 锌粉（9.6g,144mmol）加入250mL双口圆底烧瓶中，抽真空通氮气三次，加入60mL四氢呋喃，冰浴下滴加TiCl4(7.8mL,72mmol),缓慢回至室温后加热回流2.5小时，再次用冰浴冷却，加入吡啶（6mL,36mmol），搅拌10分钟后称取4-氨基二苯甲酮（2.84g，
14.4mmol）和二苯甲酮（3.15g，17.28mmol）一起溶于适量四氢呋喃后加入反应体系。缓慢恢复至室温后加热回流12小时。反应液冷却过滤。所得粗产物以硅胶柱色谱分离纯化（石油醚/二氯甲烷=5:1混合溶剂做淋洗剂），得到淡黄色固体氨基四苯基乙烯（2.56g,产率
51.2%），得到的氨基四苯基乙烯作为四苯基乙烯叠氮检测硫化氢时的参比物。核磁氢谱图见图2。
14.4mmol）和二苯甲酮（3.15g，17.28mmol）一起溶于适量四氢呋喃后加入反应体系。缓慢恢复至室温后加热回流12小时。反应液冷却过滤。所得粗产物以硅胶柱色谱分离纯化（石油醚/二氯甲烷=5:1混合溶剂做淋洗剂），得到淡黄色固体氨基四苯基乙烯（2.56g,产率
51.2%），得到的氨基四苯基乙烯作为四苯基乙烯叠氮检测硫化氢时的参比物。核磁氢谱图见图2。
[0052] 氨基四苯基乙烯表征数据为：IR(KBr),v(cm-1):3385,3044,1617,1513,1277,820,1
739,698.HNMR(400MHz,DMSO-d6),δ(TMS,ppm):6.97-7.11(m,17H),6.80(d,2H),6.43(d,2
13
H). C NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(TMS,ppm):144.2,144.1,144.0,140.8,139.4,134.5,132.5,131.4,127.5,126.3,126.0,114.6.Anal.Calc d for C26H21N:C,89.88;H,6.09;N,4.03;
Found:C,90.09;H,6.09;N,3.97.
739,698.HNMR(400MHz,DMSO-d6),δ(TMS,ppm):6.97-7.11(m,17H),6.80(d,2H),6.43(d,2
13
H). C NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(TMS,ppm):144.2,144.1,144.0,140.8,139.4,134.5,132.5,131.4,127.5,126.3,126.0,114.6.Anal.Calc d for C26H21N:C,89.88;H,6.09;N,4.03;
Found:C,90.09;H,6.09;N,3.97.
[0053] （3）氨基四苯基乙烯荧光曲线的绘制：
[0054] 氨基四苯基乙烯是理论上探针分子四苯基乙烯叠氮与硫化氢作用后生成的分子，其具有典型的聚集诱导发光性能，氨基四苯基乙烯的AIE荧光曲线如图3所示：当水含量为0时，浓度为10μM的氨基四苯基乙烯的二甲基亚砜溶液完全没有荧光；直到水含量增加到
80%时，氨基四苯基乙烯开始发生聚集，荧光开始明显增强。
80%时，氨基四苯基乙烯开始发生聚集，荧光开始明显增强。
[0055] （4）四苯基乙烯叠氮对硫化氢的检测：
[0056] 硫化氢的定性检测过程如下：配制10-4M的四苯基乙烯叠氮的二甲基亚砜溶液，取1mL加入10mL容量瓶中，再取1mL二甲基亚砜加入容量瓶中，用pH调整到7.4的HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）缓冲溶液定容至10mL，得到10μM的四苯基乙烯叠氮的水相含量为80%的溶液，快速测定其荧光光谱，作为空白参比。
[0057] 配制四苯基乙烯叠氮和NaHS的混合溶液，操作与空白参比的制备基本相同，不同-2之处在定容前加入50μL的10 M的NaHS(一种常用的硫化氢供体)水溶液，得到了四苯基乙烯叠氮浓度为10μM，NaHS浓度为50μM的水相含量为80%的混合溶液，测定其荧光光谱，得到测试曲线。
[0058] 用上述类似操作配制相同浓度的氨基四苯基乙烯溶液，快速测定其荧光光谱，作为比较。可得到如图4所示的检测结果，只有四苯基乙烯叠氮的溶液几乎不发光，而四苯基乙烯叠氮和NaHS的混合溶液与相同浓度的氨基四苯基乙烯的发光光谱几乎相同，即四苯基乙烯叠氮可以在聚集态下检测硫化氢，其机理是四苯基乙烯叠氮与硫化氢作用后得到氨基四苯基乙烯。
[0059] （5）四苯基乙烯叠氮在聚集态下对硫化氢检测的专一性试验：
[0060] 对硫化氢检测的专一性鉴定过程如下：配制10-4M的四苯基乙烯叠氮的二甲基亚砜溶液，取1mL加入10mL容量瓶中，再取1mL二甲基亚砜加入容量瓶中，用pH调整到7.4的HEPES缓冲溶液定容至10mL，得到10μM的四苯基乙烯叠氮的水相含量为80%的溶液，快速测定其荧光光谱，作为空白参比。
[0061] 配制四苯基乙烯叠氮与NaHS以及其他阴离子的混合溶液，操作与空白参比的制-2备基本相同，不同之处在定容前分别加入50μL的10 M的一系列阴离子的水溶液，得到了四苯基乙烯叠氮浓度为10μM，阴离子浓度为50μM的水相含量为80%的一系列混合溶液，测定其荧光光谱，得到测试曲线。可得到如图5所示的检测结果，可以看出，四苯基乙烯叠氮分子只对硫化氢有响应，对其他阴离子均无响应。
[0062] （6）本实施例的四苯基乙烯叠氮在聚集态下对硫化氢的检测具有抗干扰性。
[0063] 对硫化氢检测的抗干扰性鉴定过程如下：配制10-4M的四苯基乙烯叠氮的二甲基亚砜溶液，取1mL加入10mL容量瓶中，再取1mL二甲基亚砜加入容量瓶中，用PH调整到7.4的HEPES缓冲溶液定容至10mL，得到10μM的四苯基乙烯叠氮的水相含量为80%的溶液，快速测定其荧光光谱，作为空白参比。
[0064] 配制其他阴离子存在下的四苯基乙烯叠氮分子和NaHS的混合溶液，操作与空白-2参比的制备基本相同，不同之处在定容前分别加入50μL的10 M的NaHS(一种常用的硫化氢供体)和其他阴离子的混合水溶液，得到了四苯基乙烯叠氮浓度为10μM，其他阴离子浓度为50μM，NaHS浓度也为50μM的水相含量为80%的一系列混合溶液，测定其荧光光谱，得到测试曲线。可得到如图6所示的检测结果，可以看出，四苯基乙烯叠氮分子在其他阴离子存在的条件下，对硫化氢有响应，且不受其他阴离子的影响，说明其具有良好的抗干扰性。
[0065] （7）四苯基乙烯叠氮在聚集态下定量检测硫化氢。
[0066] 硫化氢的定量检测过程如下：配制10-4M的四苯基乙烯叠氮的二甲基亚砜溶液，取1mL加入10mL容量瓶中，再取1mL二甲基亚砜加入容量瓶中，用移液枪吸取不同体积的-210 M的NaHS水溶液加入容量瓶中，用pH调整到7.4的HEPES缓冲溶液定容至10mL，得到了四苯基乙烯叠氮浓度为10μM，NaHS浓度为2-50μM的水相含量为80%的一系列混合溶液，测试其荧光光谱。为了减小误差，上述操作重复三次，得到如图7所示的检测硫化氢的荧光增强曲线。当硫化氢浓度为0时，水含量80%的四苯基乙烯叠氮溶液几乎不发光；当硫化氢浓度小于四苯基乙烯叠氮浓度的时候，荧光没有明显增强；当硫化氢浓度超过四苯基乙烯叠氮浓度后，荧光开始显著增长；当硫化氢浓度超过四苯基乙烯叠氮浓度三倍之后，荧光强度又趋于稳定。即荧光强度在一定范围内随着硫化氢浓度的增长而增长，其有效检测范围及响应的下限由探针分子四苯基乙烯叠氮的浓度决定。
[0067] 实施例2
[0068] （1）四苯基乙烯叠氮和氨基四苯基乙烯的合成同实施例1
[0069] （2）四苯基乙烯叠氮定性检测硫化氢的存在同实施例1
[0070] （3）四苯基乙烯叠氮在聚集态下对硫化氢的检测的专一性和抗干扰性鉴定同实施例1。
[0071] （4）不同四苯基乙烯叠氮浓度在聚集态下定量检测硫化氢。
[0072] 硫化氢的定量检测过程如下：配制2×10-4M的四苯基乙烯叠氮的二甲基亚砜溶液，取1mL加入10mL容量瓶中，再取1mL二甲基亚砜加入容量瓶中，用移液枪吸取不同体积-2的2×10 M的NaHS水溶液加入容量瓶中，用PH调整到7.4的HEPES缓冲溶液定容至10mL，得到得到了四苯基乙烯叠氮浓度为20μM，NaHS浓度为4-100μM的水相含量为80%的一系列混合溶液，测试其荧光光谱。为了减小误差，上述操作重复三次，得到如图8所示的检测硫化氢的荧光增强曲线。荧光增强倍数与硫化氢相对于四苯基乙烯叠氮的当量的关系同实施例1。即荧光强度在一定范围内随着硫化氢浓度的增长而增长，其有效检测范围及响应的下限由探针分子四苯基乙烯叠氮的浓度决定。
[0073] 实施例3
[0074] （1）四苯基乙烯叠氮和氨基四苯基乙烯的合成同实施例1
[0075] （2）四苯基乙烯叠氮定性检测硫化氢的存在同实施例1
[0076] （3）本实施例四苯基乙烯叠氮在聚集态下对硫化氢的检测的专一性和抗干扰性鉴定同实施例1。
[0077] （4）四苯基乙烯叠氮在聚集态下定量检测硫化氢。
[0078] 硫化氢的定量检测过程如下：配制5×10-4M的四苯基乙烯叠氮的二甲基亚砜溶液，取1mL加入10mL容量瓶中，再取1mL二甲基亚砜加入容量瓶中，用移液枪吸取不同体积-2的5×10 M的NaHS水溶液加入容量瓶中，用PH调整到7.4的HEPES缓冲溶液定容至10mL，得到得到了四苯基乙烯叠氮浓度为50μM，NaHS浓度为10-250μM的水相含量为80%的一系列混合溶液，测试其荧光光谱。为了减小误差，上述操作重复三次，得到如9所示的检测硫化氢的荧光增强曲线。荧光增强倍数与硫化氢相对于四苯基乙烯叠氮的当量的关系同实施例1。即荧光强度在一定范围内随着硫化氢浓度的增长而增长，其有效检测范围及响应的下限由探针分子四苯基乙烯叠氮的浓度决定。