一种具有凝乳酶活性的发酵液提取物的制备方法及其产物

摘要

本发明公开了一种具有凝乳酶活性的发酵液提取物的制备方法，包括以下步骤：利用小麦麸皮培养基培养类芽孢杆菌CGMCC No.8333，15℃～40℃，震荡培养18～120小时得到发酵液，将所得发酵液离心后取上清液即得。所得提取物的凝乳酶活力最高达到6469.72±280.65SU/mL，而且其蛋白酶水解活力仅为10.54±0.65U/mL，两者之比高达613.82。利用该发酵液提取物可使液态奶在短时间内发生凝乳，而且对酪蛋白的非特异水解低。本发明公开的具有凝乳酶活性的发酵液提取物制备干酪的得率很高，该发酵液提取物在原制干酪生产加工产业中具有广阔应用前景。

权利要求

1.一种具有凝乳酶活性的发酵液提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：利用小麦麸皮培养基培养保藏编号为CGMCC No.8333的类芽孢杆菌Paenibacillus damxungensis sp.nov.，15℃～40℃，震荡培养18～120小时得到发酵液，将所得发酵液离心后取上清液即得。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述小麦麸皮培养基的组分包括小麦麸皮和水，其中小麦麸皮的含量为1％～14％，所述百分比为质量百分比。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述小麦麸皮培养基中小麦麸皮的质量百分比含量为1％～10％，所述震荡培养的震荡速度为140r/min～300r/min，震荡培养的时间为20小时～48小时。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述离心的温度为0℃～4℃，离心速度为9000r/min～14000r/min。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括菌种活化步骤，所述菌种活化步骤为：将所述保藏编号为CGMCC No.8333的类芽孢杆菌接种在TYC培养基中，

25℃～35℃活化培养18～48小时作为种子使用；将活化好的菌种按体积百分比1～9％的接种量，接种于包含质量百分比为1％～14％小麦麸皮的小麦麸皮培养基中震荡培养。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，活化培养的时间为18小时～48小时，所述震荡培养的震荡速度为140～300r/min，震荡培养的温度为25℃～35℃；震荡培养的时间为18小时～120小时。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将所得上清液经过精制干燥的步骤，所述精制干燥步骤为真空冷冻干燥，真空冷冻干燥的温度为-44℃～-40℃。

8.如权利要求1～7任一项所述制备方法所得的具有凝乳酶活性的发酵液提取物。

9.如权利要求8所述的具有凝乳酶活性的发酵液提取物在制备凝乳酶中的应用。

10.如权利要求8所述的具有凝乳酶活性的发酵液提取物在制备发酵乳制品中的应用，其中所述发酵乳制品为干酪。

说明书

一种具有凝乳酶活性的发酵液提取物的制备方法及其产物

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有凝乳酶活性的发酵液提取物的制备方法及其产物和应用。

背景技术

[0002] 凝乳是生产原制干酪的关键步骤，凝乳酶在此过程中发挥至关重要的作用，并直接关系到干酪的品质和得率。传统干酪加工中所使用的凝乳酶（rennet）来源于未断奶小牛的第四胃（皱胃），主要由凝乳酶（chymosin）和胃蛋白酶（pepsin）组成。商业化的小牛皱胃凝乳酶其凝乳酶所占比重在50～95%。凝乳酶介导凝乳反应涉及两个步骤：（1）酶解酪蛋白：凝乳酶（Chymosin,E.C.3.4.23.4）对κ-CN具有高度特异性，主要水解κ-CN中的Phe105-Met106的肽键，生成由106-109残基氨基酸组成的κ-酪蛋白巨肽（κ-casein macropeptide）和由1-105残基氨基酸组成的副κ-酪蛋白（para-κ-casein），凝乳酶也能够水解αs1-CN、αs2-CN、β-CN；（2）当足够的κ-CN被水解时，副κ-酪蛋白发生聚集形2+
成三维网状凝胶，Ca 促发酪蛋白胶束聚集，进而引起酪蛋白胶束失稳并形成干酪凝块。

[0003] 干酪加工中使用的凝乳酶的早在50多年前凝乳酶的需求已超过其产量，与此同时自1961年以来，世界干酪产量大约增加了3.5倍，小牛皱胃凝乳酶供应量确呈下降趋势，目前，世界小牛皱胃凝乳酶的仅能满足世界干酪产量所需凝乳酶的20～30%。小牛皱胃凝乳酶的供需矛盾和价格高昂、宗教（伊斯兰教和犹太教）、饮食（素食主义）以及食品法规等因素，使得寻求其替代物成为乳品领域科学研究的热点之一，寻求小牛皱胃凝乳酶替代物的研究主要动物、植物、基因重组以及微生物四个方面开展。动物和植物来源的凝乳酶主要用于特定种类的干酪，其来源和产量同样受到限制；利用基因重组技术制备的凝乳酶具有成分单一等优点，但是，一些国家如法国、德国和荷兰禁止使用重组凝乳酶。

[0004] 微生物能够产生许多种酶类，其中绝大部分分泌量很小并涉及细胞代谢过程，胞外酶能够消化不溶的纤维素、淀粉和蛋白质大分子物质，并转移至胞内作为细胞生长的营养物质。许多微生物，尤其是霉菌和细菌来源的胞外蛋白酶具有凝乳酶相似的性质，与植物和动物来源凝乳酶（MCEs）相比较，微生物来源的凝乳酶（MCEs）具有生产成本低、具有更加广泛的生化多样性以及基因改造方法简便等优点。微生物来源凝乳酶可分为两类：（a）来源于曲霉（Aspergillus spp.）和根霉菌（Rhizopus spp.）的类胃蛋白酶（pepsin-like）；（b）来源于毛霉菌（Mucorspp.）、根霉菌（Rhizomucor spp.）和板栗疫病菌（Endothiaparasitica）的类凝乳酶（rennin-like）。目前，米黑根毛霉（Rhizomucormiehei）、微小根毛霉（Rhizomucorpusillus）和板栗疫病菌（Endotiaparasitica）三种来源的凝乳酶已用于大规模商业化生产中，已占到了全球蛋白酶市场的33%。然而，近年来微生物凝乳酶研究主要集中在芽胞杆菌属（Bacillus），所得蛋白酶通常具有较高的蛋白酶水解活力，并具有耐热性较强、不易灭活，导致蛋白质降解并转化为乳清，因此，对干酪得率具有负面作用，只有部分适合于干酪生产。因此尽管部分微生物凝乳酶已产业化，筛选新型产凝乳酶的微生物菌种仍是该领域的重要研究工作。

发明内容

[0005] 因此，本发明要解决的技术问题就是针对目前存在的凝乳酶来源和产量严重不足的技术问题，提供了一种具有凝乳酶活性的发酵液提取物的制备方法及其产物和应用。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是：一种具有凝乳酶活性的发酵液提取物的制备方法，其所述制备方法包括以下步骤：利用小麦麸皮培养基培养类芽孢杆菌（Paenibacillus damxungensis sp.nov.）CGMCC No.8333，15℃～40℃，震荡培养18～120小时得到发酵液，将所得发酵液离心后取上清液即得。

[0007] 本发明所述小麦麸皮培养基包括小麦麸皮和水。其中所述的小麦麸皮为本领域常规的小麦麸皮，所述小麦麸皮的来源较佳地包括：山东、河南和江苏，优选的来源为山东。

[0008] 本发明所述小麦麸皮培养基中小麦麸皮的含量较佳地为1%～14%，更佳地为1%～10%，最佳地为3%，所述百分比为质量百分比。本发明所述菌株类芽孢杆菌CGMCC No.8333的接种量较佳地为1～9%，更佳地为3%～7%，最佳地为5%，所述百分比为体积百分比。其中所述培养温度较佳地为20℃～40℃，更佳地为25℃～35℃，最佳地为30℃；所述震荡速度较佳地为140～300r/min，更佳地为200～300r/min，最佳地为300r/min，所述培养的时间较佳地为18～120小时，更佳地为20～48小时，最佳地为20小时，其中所述离心的速度较佳地为9000～14000r/min。

[0009] 本发明所述小麦麸皮培养基包含的营养成分较佳地为：蛋白质：18.6%，脂肪：6.20%，总碳水化合物：63.9%，水分：7.89%，灰分：3.38%，所述百分比为质量百分比。

[0010] 本发明所述具有凝乳酶活性的发酵液提取物的制备方法较佳地还包括菌种活化的步骤。所述菌种活化步骤包括：将本发明所述类芽孢杆菌CGMCCNo.8333接种在TYC培养基中，25℃～35℃培养18～48小时作为种子；将活化好的菌种按1～9%的接种量接种于盛有1%～14%的小麦麸皮培养基的250mL锥形瓶中震荡培养，250mL锥形瓶装液量为20mL～100mL，摇床转速为140～300r/min，培养温度为20℃～40℃，培养时间为18～120小时，其中所述百分比为质量百分比。

[0011] 其中所述菌株类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种量更佳地为1～5%，最佳地为3%，所述百分比为体积百分比；小麦麸皮培养基中的小麦麸皮含量较佳地为1%～14%，更佳地为1%～10%，最佳地为3%，所述百分比为质量百分比；250mL锥形瓶中装液量较佳地为20mL～
100mL，更佳地为25mL～75mL，最佳地为30mL；震荡培养的震荡速度较佳地为140～300r/min，最佳地为300r/min；培养温度较佳地为25℃～35℃，最佳地为30℃；活化时间较佳地为18～48小时，更佳地为18～24小时，最佳地为18小时。

[0012] 本发明所述具有凝乳酶活性的发酵液提取物的制备方法较佳地还包括将所得上清液经过精制干燥的步骤，所述精制干燥步骤为本领域常规的真空冷冻干燥步骤，所述真空冷冻干燥的温度较佳地为-44℃～-40℃，优选地为-40℃。

[0013] 本发明所述TYC培养基为本领域常规的TYC培养基，所述TYC培养基的配方及制备方法较佳地为：酪蛋白胨或胰蛋白胨15g，蔗糖50g，酵母膏5.0g，L-胱氨酸0.2g，乙酸钠20g，Na2SO40.1g，NaCl1g，Na2HPO4·12H2O2g，NaHCO32g，琼脂15-20g，加水至1L，pH7.3，121℃灭菌15分钟即得，上述原料的制备方法均为本领域常规制备方法，或者通过市售可得。

[0014] 为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二是：如本发明所述制备方法所得的具有凝乳酶活性的发酵液提取物。本发明制备所得具有凝乳酶活性的发酵液提取物的凝乳酶活力比普通的微生物来源发酵液提取物的凝乳酶活力更高。

[0015] 为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三为：本发明所述具有凝乳酶活性的发酵液提取物在制备凝乳酶中的应用。

[0016] 本发明所述凝乳酶的制备方法为本领域常规的制备方法，只要以本发明所得具有凝乳酶活性的发酵液提取物为原料进行制备即得。

[0017] 为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之四为：本发明所述具有凝乳酶活性的发酵液提取物在制备发酵乳制品中的应用。

[0018] 本发明所述发酵乳制品为本领域常规发酵乳制品，较佳地包括发酵乳，乳酸菌饮料，酸乳粉，发酵乳酪，更佳地为发酵乳酪，优选地为干酪。

[0019] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

[0020] 本发明所用试剂和原料均市售可得。

[0021] 本发明的积极进步效果在于：本发明所得具有凝乳酶活性的发酵液提取物的凝乳酶活力高达6469.72±280.65SU/mL，并且所得发酵液提取物的蛋白酶水解活力仅为10.54±0.65U/mL，二者之比高达613.82。本发明提供的具有凝乳酶活性的发酵液提取物能够使液态奶在短时间内发生凝乳，并且所得发酵液提取物对酪蛋白的非特异水解活性极低，因此所述具有凝乳酶活性的发酵液提取物在原制干酪生产加工方面具有广阔的应用前景。

[0022] 生物材料保藏信息

[0023] 本发明的类芽孢杆菌BD3526，已于2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。该菌株的保藏编号为：CGMCC No.8333。该菌株的分类命名是类芽孢杆菌Paenibacillus sp.，培养物名称为BD3526。

附图说明

[0024] 以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

[0025] 图1为本发明所述类芽孢杆菌CGMCC No.8333在TYC平板上的菌落图。

[0026] 图2显示本发明类芽孢杆菌CGMCC No.8333的16S rRNA系统发育进化树。

[0027] 图3为本发明所述类芽孢杆菌CGMCC No.8333麸皮发酵上清凝乳形态图。

具体实施方式

[0028] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明中所述的室温是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。

[0029] Paenibacillus hunanensis FeL05T（ACCC10718T=CGMCC No.1.8907T）与T TPaenibacillus polymyxa ATCC842（CGMCC No.1.4261）购买自自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)。

[0030] 实施例1菌株BD3526的初筛

[0031] 从西藏自治区当雄县采集牦牛奶，以无菌方式取1ml，用无菌生理盐水系列稀释，通过涂布的方式将稀释液均匀涂布于固体TYC培养基上（所述TYC培养基的组分为：酪蛋白胨或胰蛋白胨15g，蔗糖50g，酵母膏5.0g，L-胱氨酸0.2g，乙酸钠20g，Na2SO40.1g，NaCl1g，Na2HPO4·12H2O2g，NaHCO32g，琼脂15-20g，加水至1L，pH7.3，将上述组分溶解在蒸馏水中，121℃灭菌15分钟即得），30℃培养24-48小时。选取粘鼻涕状、具有良好拉丝性的单菌落多个，分别转接到新的固体TYC培养基上，得到纯化的菌落。

[0032] 实施例2菌株BD3526的获得及其特征

[0033] Biolog微生物自动检测仪（生产厂商：Biolog公司）鉴定实验：

[0034] Biolog微生物自动检测仪（生产厂商：Biolog公司）鉴定实验，是Biolog公司独创的碳源利用方法，利用微生物对不同碳源进行呼吸代谢的差异，筛选95种不同碳源或其他化学物质，配合显色物质，固定于96孔板上（A1孔为阴性对照）。接种菌悬液培养一定时间，通过检测微生物细胞利用不同碳源进行呼吸代谢过程中产生的化学还原物质欲显色物质发生反应导致的吸光度以及由于微生物生长造成的浊度，生成特征指纹图谱，与标准菌株图谱数据库进行比对，即可得到最终鉴定结果。

[0035] 1）取如上所述实施例1中的单菌落多个，分别接种到液体TYC中，30℃培养24h。

[0036] 2）在10000r/min下离心20min，弃去上清液，加1mL生理盐水，在振荡器上振动5min使之混匀；再于10000r/min下离心20min，重复2次，除去其中的碳源；弃去上清液，加
1mL生理盐水，在振荡器上振动5min使之混匀，于2000r/min下离心1min。

[0037] 3）取上清液倒入装有20mL已灭菌生理盐水（NaC1，0.85％）的试管中，并使其OD590维持在0.13±0.02。

[0038] 4）将如上所述稀释液加入Biolog ECO微平板中(150μL／孔)，然后在20℃下培养，每隔12h用Biolog细菌自动读数仪读取数据，连续测定2d。结果如表1所示。

[0039] 表1菌株BD3526的Biolog鉴定结果

[0040]

[0041] 对结果进行鉴定需要考虑3个参数，可能性（Probability，PROB）、相似性（Similarity，SIM）、位距（Distance，DIS）。SIM和DIS值是2个重要的参数，表示测试结果与数据库相应的数据的匹配程度。当DIS<5.0，SIM>0.75为良好的匹配。结果显示，其中的菌株BD3526鉴定的SIM值0.535<0.75，说明与数据库中数据匹配度低，表示与数据库中的菌种在代谢特征上存在较大差异，可能是一个新的微生物种类。

[0042] 所得菌株BD3526于2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。该菌株的保藏编号为：CGMCC No.8333。该菌株的分类命名是Paenibacillus sp.，该菌株的名称是BD3526。

[0043] 实施例3菌株BD3526的特征

[0044] 1、菌落特征：

[0045] 取菌株BD3526的单菌落，转接到TYC固体培养基（琼脂）上，于30℃恒温培养箱中培养24h、36h和48h，分别观察其菌落的大小、颜色、边缘、凸起、光滑度、粘性、透明度等特点。结果如图1所示。结果显示，菌株BD3526在TYC固体培养基上形成边缘整齐，光滑，粘稠，表面光泽，不透明的菌落，直径约3～5mm。

[0046] 2、形态学观察及生理生化特征：

[0047] 挑取在TYC固体培养基（琼脂）上培养24h的新鲜培养物，进行生理生化测试。结果显示，BD3526为革兰氏阳性杆菌，芽孢端生，为椭圆形，不膨大。BD3526其理化反应参数如表2。

[0048] 表2菌株BD3526的理化实验结果

[0049]

[0050] 3、API50CHB鉴定特征

[0051] 利用API50CHB鉴定系统（生产厂商：bioMe′rieux）测定菌株BD3526发酵碳水化合物的产酸情况。API50CHB的试剂条中，不同的序列号对应不同的碳源，同时，其中含有指示剂，这样，如果其对应的碳源被利用，则培养液pH下降，指示剂便会改变颜色，利于观察记录。

[0052] 1)API50CHB基础培养基成分：胰蛋白胨1g，酵母膏0.5g，硫酸铵2g，酚红0.18g，无机盐基础（Cohen-Bazire）10ml，磷酸盐缓冲液（pH7.8）1000ml。

[0053] 2)在平板上培养菌株，挑取有多个大小相近，单菌落分离的平板。挑取大小相近的单菌落若干个，加入1)中的培养基中，制成OD600=0.4～0.6的菌悬液。

[0054] 3)将接过种的API50CHB培养基加入到含有实验条的小管中，上面覆盖一层已灭菌的石蜡油。

[0055] 4)在30°C的恒温培养箱中培养，分别在24小时和48小时记录实验现象。

[0056] 菌株BD3526利用碳水化合物发酵产酸的结果如表3和表4所示。

[0057] 表3菌株BD3526的API50CHB鉴定结果

[0058]

[0059] “+”表示利用糖产酸，“-”表示不产酸。

[0060] 表4菌株BD3526与其相近类芽孢杆菌的利用碳水化合物水解产酸的对比表[0061]

[0062] 注：菌株1为BD3526，菌株2为Paenibacillus hunanensis FeL05（ACCC10718T T）；

[0063] W是指“weak”，弱阳性。

[0064] 如 表 4 所 示，菌 株 BD3526 与 菌 株 2Paenibacillus hunanensis FeL05TT（ACCC10718）利用碳水化合物水解产酸方面有明显差异，属于不同种。

[0065] 实施例4菌株BD3526的生长特性

[0066] 1.生长曲线：

[0067] 1)各取30mL TYC液体培养基于100mL锥形瓶中，用多层(8-12层)纱布封口后，121℃高温蒸汽灭菌15分钟；

[0068] 2)挑取在TYC固体培养基（琼脂）上培养24h的新鲜培养物，接种到上述TYC液体培养基，30℃摇床培养20～24h，作为种子。

[0069] 3)将2）中所培养的BD3526种子按2%(v/v)接种量转接新鲜的无菌接种TYC液体培中，混匀。取150μl混合液加入costar96孔灭菌微孔板中，3份平行，并以不接种的TYC液体培养基做空白。波长600nm下测量OD值，间隔30min。

[0070] 2.生长温度：

[0071] 将2）中所培养的BD3526种子按2%(v/v)接种量转接新鲜的无菌接种TYC液体培中，混匀。分别置于4℃、15℃、30℃、37℃、40℃、60℃的水浴培养，每个温度梯度做三个平行，分别在24h和48h时测定其生长情况。得到菌株BD3526生长温度范围为15～40℃，较佳地为30℃。

[0072] 3.生长NaCl耐受性

[0073] 将2）中所培养的BD3526种子按2%(v/v)接种量转接氯化钠浓度分别为0.0%、2.0%、5.0%、7.0%和10.0%的TYC培养基，30℃培养，分别于24h和48h的生长状态做记录。
结果显示菌株BD3526的NaCl耐受性为10%。

[0074] 4.生长pH范围

[0075] 用无菌的HCL和NaOH将灭好菌的TYC培养基调至pH值分别为3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、8.5、9.0、10.0，将2）中所培养的BD3526种子按2%接种量接入，30℃培养，分别于24h和48h的生长状态做记录。得到菌株BD3526生长的pH范围为5.5～8.5，较佳地为6.0。

[0076] 实施例5菌株BD3526的16S系统发育学特征

[0077] 利用天跟细菌基因组提取试剂盒（TIANAMP Bacteria DNA Kit），按照革兰氏阳性菌操作步骤获得菌株BD3526的基因组DNA。分别测定其230nm、260nm、280nm的吸光度，其A260：A280：A230为1：0.510：0.445。纯度符合要求。

[0078] 利用27F，1492R引物扩增菌株BD3526的16S rDNA片段。纯化，然后与pMD19-T Simple Vector的TA克隆载体连接，放于16℃的水浴中反应过夜，转化到大肠杆菌DH5α的感受态细胞中，于氨苄青霉素的LB琼脂培养基平板上涂布，在37℃培养16-20小时后，挑取阳性转化子。将上述阳性转化子送上海杰李生物公司测序。将测序结果放到NCBI及TEzTaxon数据库中，比对得到与最相近的菌株（Paenibacillus hunanensis FeL05）相似性为96.6%。

[0079] 如上所述的引物对序列为，1492R：TACCTTGTTACGACTT（SEQ ID NO.2所示），27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG（SEQ ID NO.3所示）。

[0080] 菌株BD3526的16S rRNA基因测序的结果如SEQ ID NO.1所示。

[0081] 如上所述的16S rRNA序列采用软件CLUSTAL_X program(version1.83)进行比对，使用软件MEGA version4.0.2.software绘制进化关系树。采用neighbor-joining计算，并以maximum-parsimony和maximum-likelihood进行验证计算，bootstrap设置为1000个循环，结果如图2所示。从图2可见，通过对16S rRNA基因的系统发育树分析，菌株BD3526可以归入到Paenibacillus hunanensis簇。但是，菌株BD3526与Paenibacillus hunanensis模式菌株相似性为96.6%。而97%则是同一属内不同种类菌株相似性的16SrRNA的阈值，而且很多文献中证明了有些菌16S rRNA基因序列的相似性超过了99%，但是他们仍然属于不同的菌种。故菌株BD3526较有可能为新的微生物物种，有待其他生理生化指标的验证。

[0082] 实施例6菌株BD3526脂肪酸含量特征

[0083] 菌株BD3526的总脂肪酸含量的测定。

[0084] 配置如下溶液：I，45g氢氧化钠溶于150ml甲醇及150ml蒸馏水；II，190ml浓盐酸，275ml甲醇溶于135ml蒸馏水；III，200ml正己烷与200ml乙醚混合均匀；IV，10.8克氢氧化钠溶于900ml蒸馏水；V，饱和氯化钠溶液。

[0085] 1）取适量细菌培养物，置于8ml螺口玻璃管中，加入1ml溶液I，拧紧螺盖，沸水浴5min，取出振荡5～10S，继续沸水浴25min；

[0086] 2）待样品管冷却后，加入2ml溶液II，盖严振荡，随后精确控制80±1℃水浴10min，冰浴冷却；

[0087] 3）向上述溶液中，加入1.25ml溶液III，快速振荡10min左右，弃去下层水相；

[0088] 4）在剩余有机相重加入3ml溶液IV及0.1-0.2ml溶液V，快速振荡5min左右，取三分之二上层有机相置色谱样品瓶中。

[0089] HP6890气相色谱仪，配备分流/不分流进样口，氢化焰离子化检测器（FID）及HP气相色谱化学工作站；色谱柱为Ultra-2柱，长25m，内径0.2mm，液膜厚度0.33μm；炉温为二阶程序升温：起始温度170℃，5℃/min升至260℃，

[0090] 随后40℃/min升至310℃，维持1.5min；进样口温度250℃，载气为氢气，流速0.5ml/min，分流进样模式，分流比为100：1，进样量为2μl；检测温度300℃，氢气流速为
30ml/min，空气流速为216ml/min，补充气（氮气）流速为30ml/min。

[0091] 结果显示，菌株BD3526的主要细胞脂肪酸为反异式饱和脂肪酸C15：0、反异式十七碳饱和脂肪酸、十六碳饱和脂肪酸，百分含量分别为59.02%、11.09%、7.66%。符合类芽孢杆菌属主要的脂肪酸为为反异式饱和脂肪酸C15：0。而且同相似菌株脂肪酸种类与含量上，均有差异，以此判断同相似菌株属于不同种类。

[0092] 实施例7菌株BD3526的G＋C mol％含量特征

[0093] 菌株BD3526基因组DNA的G＋C mol％含量测定。

[0094] 使用熔解温度（Tm）法，以大肠埃希氏（E.coli K12，AS1.365）为参比对照，所用仪器为Perkin/Elmer公司Lambda35UV/VIS Spectrometer;用PTP-1数字温度控制仪控温。步骤如下：

[0095] 1）将待测DNA样品用0.1×SSC稀释至OD260nm值于0.3～0.4之间；

[0096] 2）在波长260nm首先记录25℃的OD值，然后设定升温程序，从65℃开始到95℃，其间每分钟升高1℃；

[0097] 3）OD值上升表示变性开始，记录比色皿温度和OD值，直至OD值不变表示变性完毕；

[0098] 4）根据热变性曲线，得出熔链温度（Tm），计算G＋C mol％含量。

[0099] 在0.1×SSC溶液中计算公式为：

[0100] G＋C mol％＝G＋C mol％AS1.365＋2.08（Tm未知－TmAS1.365）

[0101] 试验测定的E.coli K12，AS1.365的Tm为75.810℃，待测菌株的Tm值和G+C mol%。

[0102] 菌株BD3526的G+C mol%结果见表5。

[0103] 表5菌株BD3526的G+C mol%含量

[0104]

[0105] 菌株BD3526的G＋C mol％为47.48%，Paenibacillus hunanensis FeL05T（ACCT T TC10718=CGMCC1.8907=DSM22170）G＋C mol％为53.3%（两者差异大于5%）。类芽孢杆菌属G＋C含量范围45～54mol％。依据东方秀、蔡秒英主编的《常见细菌系统鉴定手册》，类芽孢杆菌属G＋C含量范围45～54mol％；两株菌G+C mol%差别大于5%，可判断不属于同一个种（在其他性状相似的情况下也可作上述判断）。由此判断，菌株BD3526归为类芽孢T
杆菌属（Paenibacillus sp.），同最相近的菌株Paenibacillus hunanensis FeL05（ACCC1T T T
0718=CGMCC1.8907=DSM22170）属于不同种。

[0106] 实施例8菌株BD3526的杂交试验

[0107] 菌株BD3526同遗传亲缘关系最相似的菌种及类芽孢杆菌属模式菌种的杂交试验。

[0108] 参考16S rRNA的结果，对BD3526与遗传亲缘关系最相似的种Paenibacillus T T T Thunanensis FeL05（ACCC10718=CGMCC1.8907=DSM22170）及Paenibacillus模式菌株T T T T
Paenibacillus polymyxa ATCC842（=CGMCC1.4261=DSM36=KCTC3858）进行DNA-DNA杂交试验。

[0109] 采 用 液 相 复 性 率 方 法，所 用 仪 器 为 Perkin Elmer Lambda35UV/VIS Spectrophotometer。温度控制用PTP-1Peltier System数字控温系统。步骤如下：

[0110] 1）DNA样品处理：如上所述实施例5中提取的DNA样品，实验前需先置冰浴中用超声波40W打24分钟（设定为：打3秒/停3秒；DNA样品浓度为OD260nm2.0，将DNA样品剪切5
为2-5×10道尔顿的片段。

[0111] 2）将待测DNA样品（A、B）分别用0.1×SSC精确配制成为OD260nm1.8～2.0，且两者OD260nm值一致（精确到0.001）；

[0112] 3）进入UV Winlab程序（生产厂商：Perkin Elmer），出现其方法窗口，在方法窗口中选择时间驱动TD方法，通过Timed.Inst.Sample.设置页来设定合适的测定参数。测定波长为260nm，总测定时间设定为30分钟。按照已经测定的G+C mol%计算最适复性温度（optimal renaturation temperature，TOR），将比色杯的温度稳定在最适复性温度。在2×SSC反应液中，最适复性温度按公式：TOR=0.51×（G+C）mol%+47计算。

[0113] 4）取两株菌种DNA样品各400μl分别装在两个离心管中，再取两株菌种DNA样品各200μl装在同一个离心管中为混合样品；

[0114] 5）单一DNA样品和混合DNA样品测试前分别通过PTP-1控温系统（生产厂商：Perkin Elmer）设置100℃变性15min，然后降温至最适复性温度。记录OD260nm值，待反应进行到30min时，停止读数，全部过程样品的温度都不得低于TOR，最终得到一条随时间延长，光吸收值逐渐减小的直线；

[0115] 6）根据软件UV Winlab，在其中的Algorithm栏中选择Slope，得出复性数率（V），即斜率（通常V表示为每分钟吸光值的减少值）；

[0116] 7）根据公式计算同源杂交率。

[0117]

[0118] DNA-DNA杂交结果如下：

[0119] BD3526/Paenibacillus hunanensis FeL05T(三次重复):

[0120] H%=39.82%(I)；

[0121] H%=41.60%(II)；

[0122] H%=42.10%(III)。

[0123] BD3526/Paenibacillus polymyxa ATCC842T(三次重复)：

[0124] H%=41.62%(I)；

[0125] H%=46.60%(II)；

[0126] H%=48.60%(III)。

[0127] 结果显示，菌株BD3526同Paenibacillus hunanensis FeL05T（ACCC10718T=CGT TMCC1.8907=DSM22170）的DNA同源性为39.82～42.10%，同类芽孢杆菌属的模式菌种T T T T
Paenibacillus polymyxa ATCC842（=CGMCC1.4261=DSM36=KCTC3858）DNA的同源性为
41.62～48.60%。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》，在最适的条件下，DNA同源性在70%以上是属于同一种的，在20%以上是属于同一属的。并结合实施例2，3，4，5，6的数据，由此判断菌株BD3526属于类芽孢杆菌属的一个新种。该菌株的分类地位是Paenibacillus sp.，依照国际细菌系统分类委员会的命名方法，欲将该种命名为Paenibacillus damxungensis sp.nov.，并选菌株BD3526为该种的模式菌株。

[0128] 实施例9菌株BD3526的发酵液提取物的凝乳酶活性检测

[0129] 将实施例1所得类芽孢杆菌新种BD3526（Paenibacillus damxungensis sp.nov.）CGMCC No.8333接种至TYC培养基中35℃、180r/min培养16h作为种子使用，按9%的接种至250mL锥形瓶中装有20mL的1%小麦麸皮培养基中并混匀，于20℃，300r/min的条件下，震荡培养18h。培养结束后，称取5mL培养好的小麦麸皮培养基经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗提物。

[0130] 将制备得到的500μL的粗酶液按照下述方法进行凝乳实验，凝乳酶活力（milk clotting activity，MCA）测定方法包括以下步骤：

[0131] 将脱脂奶粉以10%（w/v）的比例配置成pH6.0含有10mmol/L CaCl2的溶液，在35℃水浴中孵育10min后，将500μL的凝乳酶加入至35℃的10mL脱脂乳溶液中，每15s将样品取出并倾斜45℃观察样品组织状态，以形成不连续颗粒的时间计作凝乳时间。1个凝乳酶单位（Soxhlet unite，SU）定义为35℃条件下，使1mL脱脂乳在40min发生凝乳所需的酶量。

[0132]

[0133] T——凝乳时间，秒

[0134] VS——底物体积，mL

[0135] VE——酶液体积，mL

[0136] D——稀释倍率

[0137] 蛋白酶水解活力（proteolytic activity，PA）的测定方法如下：

[0138] 以酪蛋白为底物，采用Folin-Ciocalteu phenol方法进行蛋白水解活力测定。将5mL用0.05mol/L pH6.0的磷酸盐配置12g/L的酪蛋白溶液加入至1mL发酵上清中，混合均匀并在35℃水浴中孵育10min后，加入0.44mol/LTCA终止反应，并于-4℃、10000r/min离心取上清。取2mL上清加入0.28mol/L的NaOH溶液5mL和按1:2比例稀释的Folin-Ciocalteu phenol试剂，35℃水浴中孵育15min后，测定A660nm。配置100μg/mL的酪氨酸溶液，并按照Folin-Ciocalteu phenol方法分别测定0、20、40、60、80和100μg/mL酪氨酸溶液的A660nm，建立标准曲线。1个蛋白水解活力定义为1min释放1μmol酪氨酸所需的酶量。

[0139] 测得实验结果表明，类芽孢杆菌菌株BD3526（CGMCC No.8333）的凝乳时间为57.67±2.05秒，根据上述方法测算从该菌株所得具有凝乳酶活性的发酵液提取物的凝乳酶活力为833.43±29.98SU/mL；测得该发酵液提取物的蛋白酶水解活力为1.53±0.18U/mL，MCA/PA比值为544.72，利用所得类芽孢杆菌的菌株BD3526（CGMCC No.8333）提取物制备的凝乳形态如图3所示。

[0140] 实施例10菌株BD3526的发酵液提取物的凝乳酶活性检测

[0141] 将实施例1所得类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种至TYC培养基中25℃，180r/min培养20h作为种子使用，按5%的接种至250mL锥形瓶中装有50mL的3%小麦麸皮培养基中并混匀，于30℃，200r/min的条件下，震荡培养28h。

[0142] 培养结束后，称取5mL培养好的小麦麸皮培养基经0℃，9000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗提物。将制备得到的500μL的粗酶液稀释5倍（D=5）按照实施例2中的方法分别进行MCA和PA的测定。

[0143] 测得的凝乳时间为78.33±1.25秒，计算得到的粗酶液凝乳酶活力为3064.60±48.51SU/mL；测得的蛋白酶水解活力为5.21±0.47U/mL，MCA/PA比值为588.21。

[0144] 实施例11类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵液提取物的凝乳酶活性检测[0145] 将实施例1所得类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种至TYC培养基中30℃、180r/min震荡培养20h作为种子使用，按1%的接种至250mL锥形瓶中装有100mL的14%小麦麸皮培养基中并混匀，于30℃，200r/min的条件下，

[0146] 震荡培养120h。

[0147] 培养结束后，称取5mL培养好的小麦麸皮培养基经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗提物。

[0148] 将制备得到的500μL的粗酶液按照实施例2中的方法分别进行MCA和PA的测定。

[0149] 测得的凝乳时间为67.33±1.63秒，计算得到的粗酶液凝乳酶活力为716.84±17.48SU/mL；测得的蛋白酶水解活力为1.39±0.29U/mL，MCA/PA比值为515.71。

[0150] 实施例12类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵液提取物的凝乳酶活性检测[0151] 将实施例1所得类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种至TYC培养基中30℃、180r/min震荡培养20h作为种子使用，按5%的接种至250mL锥形瓶中装有30mL的3%小麦麸皮培养基中并混匀，于30℃，300r/min的条件下，震荡培养20h。培养结束后，称取5mL培养好的小麦麸皮培养基经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗提物。

[0152] 将制备得到的500μL的粗酶液稀释10倍（D=10）按照实施例2中的方法分别进行MCA和PA的测定。

[0153] 测得的凝乳时间为74.33±3.26秒，计算得到的粗酶液凝乳酶活力为6469.72±280.65SU/mL；测得的蛋白酶水解活力为10.54±0.65U/mL，MCA/PA比值为
613.82。

[0154] 实施例13类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵液提取物的凝乳酶活性检测[0155] 将实施例1所得类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种至TYC培养基中30℃、180r/min震荡培养18h作为种子使用，按3%的接种至250mL锥形瓶中装有20mL的3%小麦麸皮培养基中并混匀，于40℃，300r/min的条件下，震荡培养18h。培养结束后，称取5mL培养好的小麦麸皮培养基经4℃，14000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗提物。

[0156] 将制备得到的500μL的粗酶液按照实施例2中的方法分别进行MCA和PA的测定。

[0157] 测得的凝乳时间为3720±86.41秒，计算得到的粗酶液凝乳酶活力为12.91±0.30SU/mL；测得的蛋白酶水解活力为0.04±0.02U/mL，MCA/PA比值为322.75。

[0158] 实施例14类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵液提取物的凝乳酶活性检测[0159] 将实施例1所得类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种至TYC培养基中35℃、180r/min震荡培养18h作为种子使用，按7%的接种至250mL锥形瓶中装有50mL的10%小麦麸皮培养基中并混匀，于35℃，180r/min的条件下，震荡培养48h。培养结束后，称取5mL培养好的小麦麸皮培养基经4℃，14000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗提物。

[0160] 将制备得到的500μL的粗酶液稀释5倍（D=5）按照实施例2中的方法分别进行MCA和PA的测定。

[0161] 测得的凝乳时间为240.33±2.49秒，计算得到的粗酶液凝乳酶活力为998.72±10.41SU/mL；测得的蛋白酶水解活力为1.67±0.27U/mL，MCA/PA比值为598.03。

[0162] 实施例15类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵液提取物的凝乳酶活性检测[0163] 将实施例1所得类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种至TYC培养基中30℃、140r/min震荡培养18h作为种子使用，按5%的接种至250mL锥形瓶中装有30mL的3%小麦麸皮培养基中并混匀，于25℃，300r/min的条件下，震荡培养20h。培养结束后，称取5mL培养好的小麦麸皮培养基经4℃，14000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗提物。

[0164] 将制备得到的500μL的粗酶液稀释10倍（D=10）按照实施例2中的方法分别进行MCA和PA的测定。

[0165] 测得的凝乳时间为115.67±2.49秒，计算得到的粗酶液凝乳酶活力为4151.77±88.83SU/mL；测得的蛋白酶水解活力为6.89±0.95U/mL，MCA/PA比值为602.58。

[0166] 对比实施例1不同微生物来源的粗酶液凝乳酶活力检测

[0167] 将500μL其他微生物来源的粗酶液按照实施例2所述方法进行凝乳实验，所得粗酶液的凝乳酶活力数据如表6所示：

[0168] 表6其他微生物来源的粗酶液凝乳酶活力测试结果

[0169]微生物 粗酶液酶活
Mucor rouxii[1] 1.90SU/mL
Penicilliumoxalicum[2] 16.8SU/mg
Nocardiopsis spp.[3] 4.7SU/mL
Bacillus amyloliquefaciens D4[4] 1000SU/mL
Bacillus subtilis(natto)Takahashi[5] 685.7SU/mL
Bacillus subtilis B1[6] 1129.05SU/mL
Bacillus subtilis YB-3[7] 200SU/mL
Bacillus sphaericus NRC24[8] 1212SU/mL

[0170] 其 中 表6所 述 微 生 物 Mucor rouxii请 参 考 文 献[1]：Yu P J,Chou C C.Factors affecting thegrowth and production of milk clotting enzyme by Amylomycesrouxii in rice liquid medium[J].Food Technology and Biotechnology,2005,43(3):283-288.；

[0171] 表6所述微生物Penicilliumoxalicum请参考文献[2]：Hashem MA.Purification and properties of a milk clotting enzyme producedbyPenicilliumoxalicum[J].Bioresource Technology,2000,75(3):219–222.；

[0172] 表6所述微生物Nocardiopsis spp.请参考文献[3]：Cavalcanti MTH,Martinez CR,Furtado VC,Neto BB,Teixeira MF,Lima Filho JL,Porto ALF.Milk-clotting protease production by Nocardiopsis sp.in an inexpensive medium[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2005,21(2):151-154.；

[0173] 表6所述微生物Bacillus amyloliquefaciens D4请参考文献[4]：He X,Zhang W,Ren F,Gan B,Guo H.Screening fermentation parameters of the milk-clotting enzyme produced by newly isolated Bacillus amyloliquefaciens D4from the Tibetan Plateau in China[J].Annals of Microbiology,2012,62(1):357-365.；

[0174] 表6所述微生物Bacillus subtilis(natto)Takahashi请参考文献[5]：Shieh C J,Phan Thi L A,Shih I L.Milk-clotting enzymes produced by culture ofBacillus subtilis natto[J].Biochemical Engineering Journal,2009,43(1):85-91.；

[0175] 表6所述微生物Bacillus subtilis B1请 参考文献[6]：Ding Z Y,Liu S P,Gu Z H,Zhang L,Zhang K C,Shi G Y.Production of milk-clotting enzyme by Bacillus subtilis B1from wheat bran[J].African Journal of Biotechnology,2011,10(46):9370-9378.；

[0176] 表6所述微生物Bacillus subtilis YB-3请参考文献[7]：Li Y,Liang S,Zhi D,Chen P,Su F,Li H.Purification and characterization of Bacillus subtilis milk-clotting enzyme from Tibet Plateau and its potential use in yak dairy industry[J].European Food Research and Technology,2012,234(4):733-741.；

[0177] 表6所述微生物Bacillus sphaericus NRC24请参考文献[8]：El-Bendary M A,Moharam M E,Ali T H.Purification and Characterization of Milk Clotting Enzyme Produced by Bacillus sphaericus[J].Journal of Applied Sciences Research,2007,3(8):695-699.。

[0178] 从上述实验结果中可以看出，利用本发明所述类芽孢杆菌新种BD3526（Paenibacillus damxungensis sp.nov.）CGMCC No.8333制备的凝乳酶的活力比其他微生物来源的凝乳酶的活力高出数倍甚至数百倍之多，填补了凝乳酶制备领域的巨大空白。

[0179] 对比实施例2利用不同培养基制备类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵液提取物[0180] 将实施例1所得类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种至TYC培养基中30℃、180r/min培养18h作为种子使用，将所得菌株种子按3%的接种量，分别接种至250mL锥形瓶中装有50mL的3%小麦麸皮培养基和250mL锥形瓶中装有50mL的LB培养基中并混匀，于30℃，
100r/min的条件下，震荡培养30h。培养结束后，分别称取5mL培养好的小麦麸皮培养基和LB培养基均经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗提物。

[0181] 将制备得到的小麦麸皮培养基500μL的粗酶液稀释5倍（D=5），LB培养基粗酶液不稀释（D=1），分别按照实施例2中的方法分别进行MCA和PA的测定。

[0182] 小麦麸皮培养基粗酶液测得的凝乳时间为77.67±2.52秒，计算得到的粗酶液凝乳酶活力为3092.31±100.88SU/mL；测得的蛋白酶水解活力为5.23±0.51U/mL，MCA/PA比值为591.26。

[0183] LB培养基粗酶液测得的凝乳时间为3630.67±137.48秒，计算得到的粗酶液凝乳酶活力为13.24±0.51SU/mL；测得的蛋白酶水解活力为0.03±0.001U/mL，MCA/PA比值为441.33。

[0184] 由此可见，利用小麦麸皮培养基制备的凝乳酶粗酶液与利用LB培养基制备的粗酶液相比，所得发酵液提取物的凝乳酶活力提高了233.56倍。

[0185] 应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。