可检测感染弓形虫的标识性mmu-miR-511-5p

摘要

本发明公开了可检测感染弓形虫的标识性mmu-miR-511-5p，在弓形虫感染的小鼠模型中，通过提取血浆总RNA，反转录获得其cDNA，采用Q-PCR技术筛选了高表达的mmu-miR-511-5p，与弓形虫感染具有明显的相关性,可作为弓形虫病诊断的标识性miRNA。并以其作为标志物建立了弓形虫感染的Q-PCR检测方法，具有较高的敏感性和特异性，为弓形虫病的临床诊断提供一种可靠的检测依据和快速检测方法，具有重要的临床应用价值。

权利要求

1.针 对 碱 基 序 列 为augccuuuugcucugcacuca 的mmu-miR-511-5p 所 设 计 的引物在制备检测感染弓形虫的Q-PCR试剂盒中的应用，所述的引物其碱基序列atgccttttgctctgcactca；所述的弓形虫为弓形虫RH株或ME49株。

说明书

可检测感染弓形虫的标识性mmu-miR-511-5p

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体地说是可检测感染弓形虫的标识性mmu-miR-511-5p。

背景技术

[0002] 刚地弓形虫是一种专性细胞内寄生虫。人类首例报告为1908年，与动物弓形虫病同时发现，全世界约有5～10亿人感染弓形虫病，人类与这种疾病的斗争已进行了一个多世纪，但至今疾病仍在全球肆虐。我国每年约有8～9万名由于弓形虫引起损害的新生儿出生，感染弓形虫的妇女其异常生产率是正常孕妇的3倍，造成畸胎，死胎。WHO和美国CDC已将弓形虫病作为艾滋病的指征性疾病。

[0003] 目前认为，从动物和人体所分离出的弓形虫均属于同一个种，由于实际中弓形虫不同分离株的毒力存在差异，一般根据弓形虫感染小鼠后的毒性可将其分为鼠毒力株和鼠无／低毒力株，或根据基因连锁图谱分为三个型(Type I、Type II、TypeIII)。Type I为强毒株，代表虫株RH株为国际标准强毒株，TypeII，TypeIII为弱毒株，基因型变异要大得多。人类感染的弓形虫虫株大多数属于Type II基因型，比较常见的有ME49株等。因此，目前对于弓形虫的检测和防治主要针对I型RH株和II型ME49株。

[0004] 弓形虫病的早期诊断仍是亟待解决的重要问题，该病诊断方法大致可分为病原学检查、免疫学方法、分子生物学技术等3类。传统的病原学检查方法如镜检、虫体分离法等费时、费力，且特异性和敏感性不高，不能适应当前弓形虫病诊断及防治的需要。免疫学诊断方法，即检测弓形虫抗体，但弓形虫病患者常伴有免疫功能低下，往往会出现抗体水平的下降，难以做出正确的诊断。分子生物学诊断方法简便快捷，灵敏性好，特异性高，包括普通PCR、巢式PCR、荧光定量PCR、原位PCR等，所应用的诊断基因标靶包括B1、ITS-1、P30基因等，但由于这些诊断基因在弓形虫基因组中的拷贝数并不高(1-30拷贝)，影响该病的诊断。因此，选择高特异性及敏感性的临床生物标志物，并建立快速、准确的实验方法，对于弓形虫的检测、诊断和疾病的治疗具有重要的临床价值。

[0005] 近年来，发现microRNAs(miRNAs)与各种疾病的发生和发展有着极为密切的关系。miRNAs表达具有较高的组织特异性、在血液中具有较高稳定性，推测miRNAs可能是一个理想的生物检测标志物，并已经应用于急性心肌损伤，糖尿病，肝癌，肺癌等临床研究。疾病的早期诊断，也成为miRNAs研究的热点。因其具有取材方便、创伤小、可连续体 外检测及择时检测的优点，并且血浆中miRNAs的高度稳定性对于疾病的临床诊断具有可靠性强，准确率高的特点。因此，筛选弓形虫感染的特异性miRNA作为检测标志物，建立基于该标志物的检测方法意义重大。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供可检测感染弓形虫的标识性mmu-miR-511-5p。

[0007] 可检测感染弓形虫的标识性mmu-miR-511-5p，它的碱基序列为augccuuuugcucugcacuca。

[0008] 检测感染弓形虫的Q-PCR试剂盒，包括针对碱基序列为augccuuuugcucugcacuca的mmu-miR-511-5p，所设计的引物；

[0009] 所述的引物包括碱基序列atgccttttgctctgcactca；

[0010] 所述的弓形虫为弓形虫RH株或ME49株。

[0011] 本发明提供了可检测感染弓形虫的标识性mmu-miR-511-5p，在弓形虫感染的小鼠模型中，通过提取血浆总RNA，反转录获得其cDNA，采用Q-PCR技术筛选了高表达的mmu-miR-511-5p，与弓形虫感染具有明显的相关性，可作为弓形虫病诊断的标识性miRNA。并以其作为标志物建立了弓形虫感染的Q-PCR检测方法，具有较高的敏感性和特异性，为弓形虫病的临床诊断提供一种可靠的检测依据和快速检测方法，具有重要的临床应用价值。

附图说明

[0012] 图1.感染RH株和ME49株小鼠血浆中mmu-miR-511-5p的差异表达情况；

[0013] 图2.感染RH株和ME49株小鼠血浆中mmu-miR-511-5p的定量分析；

[0014] 图3.ROC曲线分析血浆mmu-miR-511-5p对不同虫株引起弓形虫病的鉴别效能；

[0015] 图4.血浆mmu-miR-511-5p及cel-miR-39的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析。

具体实施方式

[0016] 实施例1BALB／c攻虫实验

[0017] 60只6-8周龄的BALB／c小鼠被随机分成3组，每组20只，其中两组分别腹腔注6
射RH株和ME49株速殖子10个／只，第3组为健康对照组，采用吉姆萨染色法和血片DNA法确定虫体感染。

[0018] 实施例2血浆总RNA提取

[0019] 感染后72小时通过眼球取血的方式获得所有小鼠的抗凝血。将抗凝血室温1200g／min离心10分钟，取上清后再4°C12000g／min离心10分钟，取上清即为处理好的血浆样本。

[0020] 血浆总RNA的提取使用mirVanaTM miRNA Isolation Kit(Ambion，USA)试剂盒，合成 的cel-miR-39作为外参添加于血浆中，具体步骤如下：

[0021] 1.每600μL血浆中加入600μL2×Denaturing Solution，混匀，冰上孵育5分钟。

[0022] 2.加入1200μL酚氯仿，漩涡震荡1分钟，10000g／min离心5分钟。

[0023] 3.取上清加入1.25倍体积的乙醇，将混合液用柱子滤过，10000g／min离心30秒，弃滤过的液体。

[0024] 4.加入700μL miRNA Wash Solution1于柱子中，10000g／min离心30秒，弃滤过的液体。

[0025] 5.加入500μL miRNA Wash Solution2／3于柱子中，10000g／min离心30秒，弃滤过的液体，重复此步骤。

[0026] 6.空离1分钟，将柱子移到新管中，加入100μL无RNAse的水，10000g／min离心30秒，获得的总RNA溶于水中。

[0027] 实施例3反转录及Q-PCR体系的建立

[0028] 1、反转录

[0029] 50ng的总RNA用miScript II Reverse Transcription kit(Qiagen，Germany)试剂盒进行反转录，反应体系见表1，混匀液体，37℃孵育1小时后，95C水浴5分钟，在-20℃中长期保持。

[0030] 表1反转录反应体系

[0031]

[0032] 2、Q-PCR

[0033] 针对mmu-miR-511-5p进行Q-PCR。

[0034] 表2mmu-miR-511-5p的相关基本信息

[0035]

[0036] 以反转录获得的cDNA为模板，利用Qiagen(凯杰生物技术有限公司，上海浦东张江高科 技园区达尔文路88号)合成的包含序列ATGCCTTTTGCTCTGCACTCA的miRNA引物，进行Q-PCR扩增，使用miScript SYBR Green PCR Kit(Qiagen，Germany)，反应体系见表3，Q-PCR反应参数为：95℃15min；94℃15sec；55℃30sec；70℃34sec,40个循环，在ABI7900实时荧光定量PCR系统上进行，PCR产物经4.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

[0037] 表3Q-PCR扩增的反应体系

[0038]

[0039] 数据分析，采用外参基因cel-miR-39标准化，计算每一种被检miRNA的ΔCt值，-ΔΔCt录入Excel数据表，建库。采用相对定量法(2 法)分析不同组别间的miRNAs表达水平的差异，数据组间比较采用Mann-Whitney检验，以p<0.05为显著性检验水准。数据相关性分析采用ROC(receive operating characteristic，ROC)分析及AUC(area under the curve，AUC)计算由MedCalc软件完成。

[0040] 实施例4感染弓形虫的小鼠血浆中差异miRNAs的初步筛选

[0041] 为保证循环miRNAs测定的可行性，选择miRNAs作为疾病候选标志物时，应当选择那些在疾病组中显著高表达而在健康对照或非疾病对照中显著低表达或不表达的miRNAs。因此，以6份血浆样本作为参考样本(分别代表感染RH株小鼠3只和健康对照小鼠3只)进行初筛。血浆总RNA浓度介于11.9到73.7ng／μL之间，先进行单重RT，再以96孔板进行0-PCR反应，对每一个样品检测414个在小鼠中有重要功能的miRNAs以及内参均做三-ΔΔCt
个重复孔，完成Q-PCR array，计算每一种miRNA的2 值，循环miRNAs表达水平的差距极大(以>2倍为临界值)。

[0042] 从初筛结果可知：(1)以Ct<35为界值，6份血浆样本中mmu-miR-511-5p的检出率为100％；(2)感染RH株小鼠血浆中mmu-miR-511-5p表达水平显著高于健康对照组(P<0.05)，基于以上两点，确定mmu-miR-511-5p为检测标志物。

[0043] 实施例5候选mmu-miR-511-5p在大量样本中的验证

[0044] 大量样本包括健康对照20只，感染弓形虫RH株小鼠20只，感染ME49株小鼠20只。应用建立的Q-PCR体系定量分析结果表明，mmu-miR-511-5p的检出率(以三个复孔的平均Ct值<35循环为标准)为100％，感染RH株的小鼠和感染ME49株的小鼠与健康对照组相比 分别升高了8.3和3.3倍，如图1所示。

[0045] 通过Mann-Whitney检验P<0.001，说明差异极其显著，如图2所示。

[0046] 利用ROC曲线分析mmu-miR-511-5p对RH株引起的弓形虫病和健康对照的鉴别效能，结果显示，通过ROC分析得到的最佳cut-off值为2.00，此时得到的曲线下面积(AUC)为0.940(95％CI：0.817-0.990)，敏感性和特异性分别为100％和85％。同时，利用ROC曲线分析mmu-miR-511-5p对ME49株引起的弓形虫病和健康对照的鉴别效能，结果显示，通过ROC分析得到的最佳cut-off值为4.20，此时得到的曲线下面积(AUC)为0.910(95％CI：0.776-0.977)，敏感性和特异性分别为80％和95％，如图3所示。

[0047] 所有样本中mmu-miR-511-5p及cel-miR-39均能获得扩增，琼脂糖凝胶进行电泳分析显示PCR产物均呈现单一扩增条带，未见非特异扩增，位置正确，如图4所示。