大肠杆菌O157:H7的PCR检测引物及检测试剂盒转让专利
申请号 : CN201410130211.7
文献号 : CN103866031B
文献日 : 2016-02-10
发明人 : 张雪寒 , 何孔旺 , 李盟 , 汪伟 , 倪艳秀 , 温立斌 , 李彬
申请人 : 江苏省农业科学院
摘要 :
本发明提供一种大肠杆菌O157:H7的PCR检测引物及检测试剂盒，属于生物技术领域。试剂盒是一种运用特异性引物对检测样品中大肠杆菌O157:H7的快速技术，其步骤为：一，提取待检样品中的核苷酸；二，利用所述PCR试剂盒检测样品中的核苷酸，判断样品中是否含有大肠杆菌O157:H7。本发明的试剂盒针对性强，操作简便。其中引物对包括：由序列为5- atgaataagaatctcatc-3的上游引物SEQ ID NO.1和序列为5- tttcttctcgcagtttcg-3的下游引物SEQ ID NO.2组成的引物对。该套引物序列根据GenBank上大肠杆菌O157:H7独有的保守序列设计，具有很高的特异性和敏感性。
权利要求 :
1.一种大肠杆菌O157:H7的PCR检测引物，其特征在于：由序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2组成，扩增产物为354bp：SEQ ID NO.1：5- atgaataagaatctcatc-3SEQ ID NO.2：5- tttcttctcgcagtttcg-3。
2.含有权利要求1所述引物的检测大肠杆菌O157:H7的试剂盒，其特征是，试剂盒包括PCR预混液和DNA聚合酶，所述PCR预混液包括：每22uL的反应体系包括10×PCR缓冲液2.5uL、2.5mM的dNTPs 2.0uL、25mM的MgCl2
1.5 uL、20pmol/uL碱基序列如SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2所示的引物各0.2 uL、超纯水
15.6uL；
每个检测反应总体积25 uL，含有22uLPCR预混液，DNA聚合酶1 uL、待检DNA模板2uL。
说明书 :
大肠杆菌O157:H7的PCR检测引物及检测试剂盒
[0001] 一、技术领域
[0002] 本发明提供一种大肠杆菌O157:H7的PCR检测引物及检测试剂盒，属于生物技术领域。
[0003] 二、背景技术
[0004] 大肠杆菌（Escherichia coli, E.coli）O157:H7是重要的食源性病原菌，能够在全世界范围内引起动物、家禽和人类爆发感染。中国已将大肠杆菌O157:H7列为21世纪可能对国人健康有重大影响的12种病原微生物之一，对人的致病力强，感染剂量低，感染载体含菌量达l0个/g以上即可引起感染。病菌侵入人体后，可以引起出血性或非出血性腹泻、出血性结肠炎和溶血性尿毒综合症。大肠杆菌O157:H7不仅关乎食品安全，而且与医疗和公共卫生问题密切相关。为了及时有效的监控未来可能的爆发感染，建立敏感、特异和可靠的技术用于快速而选择性的检测大肠杆菌O157:H7是极其必要的。
[0005] 当前，许多报道尝试研制更适合的方法检测大肠杆菌O157:H7。传统的培养鉴定技术使用选择性培养基或者显色平板检测大肠杆菌O157:H7，但是这种方法费时，费力，准确性差。PCR技术已经被广泛应用各检测领域，发挥着不可忽视的作用。但是，运用PCR技术检测大肠杆菌O157:H7最大的障碍是如何选择唯一特异的标签基因建立方法。许多学者选用志贺毒素基因stx1和stx2、uidA、eae、fimA、rfbE和 fliC鉴定大肠杆菌O157:H7，这些基因虽然在一定程度上提供了某些鉴定信息，但是大部分基因不是大肠杆菌O157:H7独有的基因，不能直接判定为大肠杆菌O157:H7。因此，选用更加特异而稳定的基因鉴定大肠杆菌O157:H7，建立快速检测技术，更加有意义和必要性。
[0006] 前期研究工作中，通过对已有大肠杆菌O157:H7全基因组序列生物信息学，比对分析，发现一个新的阅读框唯一的存在于大肠杆菌O157:H7基因组中。我们选用大肠杆菌O157:H7参考菌株EDL933、非大肠杆菌O157菌株和类似肠道菌株沙门氏菌、志贺氏菌等，建立PCR进行检测和区分这些病原菌，结果表明该新的阅读框是大肠杆菌O157:H7特异而稳定的标签性基因。这些研究结果促使我们进一步研制用于检测大肠杆菌O157:H7的新型PCR试剂盒。
[0007] 三、发现内容
[0008] 技术问题本发明目的在于提供一种特异性检测大肠杆菌O157:H7引物序列和试剂盒。
[0009] 技术方案本发明的具体实施方案如下：
[0010] 1、引物设计：BLAST比对大肠杆菌O157:H7基因组序列，找到其特有基因，运用DNAStar软件设计引物对，由序列SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2组成。扩增产物为354bp。
[0011] 2、PCR扩增，包括以下步骤：
[0012] （1）大肠杆菌O157:H7细菌培养和模板制备：接种环蘸取-70℃保存菌种，划线接种于山梨醇麦康凯平板，37℃培养20h，单个菌落接种5mL 心脑浸出液培养基（杭州微生物试剂制品公司）中；如待检样品为液体，则直接取1mL加入到9mL心脑浸出液培养基中，培养基中再加入100 uL浓度为50mg/mL新生霉素（Ameresco进口分装）培养20h，次日，取细菌培养液1mL，12000r离心10min，100μL 纯净水重悬菌泥，煮沸10min，12000r离心10min，上清即为待检模板；
[0013] （2）PCR扩增：在0.2mL的PCR反应管中分别加入10×PCR缓冲液2.5uL、2.5mM的dNTPs 2.0uL、25mM的MgCl2 1.5 uL、20pmol/uL碱基序列如SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2所示的引物pZF和pZR各0.2 uL、DNA聚合酶1、DNA模板2uL，补加超纯水15.6 uL至总体积25uL。95℃预变性5min，94℃ 30s，50℃-60℃梯度退火 30s，72℃ 40s，29个循环，72℃再延伸5min，扩增PCR产物，1.2%琼脂糖凝胶电泳观察结果，只有目的条带的最高退火温度，即最佳退火温度为60℃。
[0014] （3）敏感性试验：首先选用大肠杆菌O157:H7细菌纯培养物，而后选用模拟制备的大肠杆菌O157:H7污染样品分析PCR的敏感性。
[0015] （4）特异性试验：选用极易与大肠杆菌O157:H7混淆的细菌进行特异性检测。
[0016] （5）试剂盒组装：PCR预混液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和纯净水。
[0017] 有益效果
[0018] （1）本发明基于前期研究的发现，大肠杆菌O157:H7基因组中具有独有的基因片段，区别于其他大肠杆菌。根据该段基因，设计引物进行扩增，特异性良好。
[0019] （2）由于本发明选定大肠杆菌O157:H7特有基因设计引物，所建立PCR方法对极易混淆的大肠杆菌血清型O55和O26均为阴性扩增，具有非常良好的特异性。
[0020] （3）本发明提供的引物，无二级结构，避免引物自身的非特异性结合，造成假阴性扩增。
[0021] （4）本发明提供的引物检测敏感性高，对大肠杆菌O157:H7细菌培养物最低检测4
限10CFU/mL，对模拟阳性污水样和肉样，增菌后检测限10CFU/mL(g)。
限10CFU/mL，对模拟阳性污水样和肉样，增菌后检测限10CFU/mL(g)。
[0022] 四、附图说明
[0023] 图1：pZF和pZR引物对的PCR敏感性试验图
[0024] 1-6：大肠杆菌O157:H7污染牛肉样品增菌后检测，104CFU/g、 103CFU/g、 102CFU/g 、10CFU/g、1CFU/g和阴性对照。M：DL-2000标准分子量；8-15：大肠杆菌O157:H7污染8 7 6 5 4 3
牛肉样品直接检测，阳性对照、10CFU/g、10CFU/g、10CFU/g 、10CFU/g、10CFU/g、10CFU/
2
g和10CFU/g。
牛肉样品直接检测，阳性对照、10CFU/g、10CFU/g、10CFU/g 、10CFU/g、10CFU/g、10CFU/
2
g和10CFU/g。
[0025] 五、具体实施方式
[0026] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应说明，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆；实验手册（New York:Cold Spring Harber Laboratory Press,1989）中所述的条件，或者按照制造厂商所建议的条件。
[0027] 实施例1
[0028] 引物设计
[0029] 根据GenBank上发表的大肠杆菌O157:H7 EDL933（登录号：AE005174）独有保守性基因序列设计引物，pZF和pZR引物序列是SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2。扩增保守基因片段为354bp，其序列是SEQ ID NO.3。SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3如下：
[0030] SEQ ID NO.1：5- atgaataagaatctcatc-3
[0031] SEQ ID NO.2：5- tttcttctcgcagtttcg-3
[0032] SEQ ID NO.3：atgaataagaatctcatcctcgcatttgcattattttccttacctgtatttgcagaagaagatctggggccaggcaaata
[0033] tgtttgtgacattaggatttccagcctggataccgctactcaaattctgtcaaaatccgcaacagttctcgataatggaa
[0034] acaatttcatcgttcaaatgccaaatggagatcaattgtactctccagatctggaaaatgttgatgatggtataaaacaa
[0035] aaagcaacaataggtggagtgacatttattcgtcgtccaacttttaacgatcgcttcatcgtggaagatggaaatacagg
[0036] attcttctataagatgcgaaactgcgagaagaaa
[0037] 实施例2
[0038] 试剂盒的敏感性试验，将上述引物检测模拟制备O157:H7阳性样品。
[0039] 下面所有模拟制备O157:H7阳性样品都是经过免疫磁珠富集（Dynabeads anti-E. coli O157免疫磁珠，购自Invitrogen公司），显色培养基细菌分离（方法参照：牛源O157:H7的分离及毒力因子分析，中国兽医学报，2012，32(8):1148-1153。）证实为O157:H7阴性才可以选用。
[0040] 2.1 污水样品制备：从养殖场采集污水，10mL/管，依次加入大肠杆菌O157:H7培6 5 4 3 2
养物，细菌终浓度分别为10 CFU/mL、10 CFU/mL、10 CFU/mL、10 CFU/mL、10 CFU/mL、10 CFU/mL 和1CFU/mL。
养物，细菌终浓度分别为10 CFU/mL、10 CFU/mL、10 CFU/mL、10 CFU/mL、10 CFU/mL、10 CFU/mL 和1CFU/mL。
[0041] 2.2 牛肉样品制备：超市购买牛肉泥200g，每10g加入到90mL磷酸盐缓冲液中，8 7 6 5
再加入大肠杆菌O157:H7培养物，细菌终浓度分别为10 CFU/g、10 CFU/g、10 CFU/g、10
4 3 2
CFU/g、10 CFU/g、10 CFU/g、10 CFU/g、10 CFU/g和1CFU/g。
再加入大肠杆菌O157:H7培养物，细菌终浓度分别为10 CFU/g、10 CFU/g、10 CFU/g、10
4 3 2
CFU/g、10 CFU/g、10 CFU/g、10 CFU/g、10 CFU/g和1CFU/g。
[0042] 2.3待检模板的制备：
[0043] 将上述制备的阳性牛肉泥样品，分别取1mL加入到9mL心脑浸出液培养基（杭州微生物试剂制品公司）中，培养基中再加入100 uL浓度为50mg/mL新生霉素（Ameresco进口分装），37℃继续培养18h，吸取1mL培养物，500 r离心15min，弃沉淀，吸取上清至新离心管，12000r离心10min，弃上清，取沉淀重悬于1/10体积双蒸水中，沸水浴10min，4℃12000转离心10min，吸取上清，即检测用模板DNA。
[0044] 取上述制备的阳性污水样品，分别取1mL加入到9mL心脑浸出液培养基（杭州微生物试剂制品公司）中，培养基中再加入100 uL浓度为50mg/mL新生霉素（Ameresco进口分装），37℃继续培养18h，吸取1mL培养物，500 r离心15min，弃沉淀，吸取上清至新离心管，12000r离心10min，弃上清，取沉淀重悬于1/10体积双蒸水中，沸水浴10min，4℃12000r离心10min，吸取上清，即检测用模板DNA。
[0045] 2.4PCR扩增条件：在0.2mL的PCR反应管中分别加入21 uL PCR预混液，DNA聚合酶1uL、DNA模板3 uL。
[0046] 2.5将PCR管至于PCR仪中进行扩增；反应条件为：95℃预变性5min，94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 40s，29个循环，72℃再延伸5min。将PCR产物于质量比为1.2%的琼脂糖凝胶上电泳。
[0047] 2.6结果判定：扩增产物如果有354bp的条带，即表示有大肠杆菌O157:H7的存在；扩增产物如果没有354bp的条带，即表示无大肠杆菌O157:H7的存在。PCR直接检测4
大肠杆菌O157:H7纯培养物模板，最低检测限为10CFU/mL。PCR分别检测模拟阳性污水样
6 4
的各个稀释度1 CFU/mL -10CFU/mL，最低检测限10CFU/mL，增菌后最低检测限10CFU/mL；
8 5
PCR分别检测模拟阳性肉样的各个稀释度1 CFU/g -10CFU/g，最低检测限10CFU/g，增菌后最低检测限10CFU/g。图1。
大肠杆菌O157:H7纯培养物模板，最低检测限为10CFU/mL。PCR分别检测模拟阳性污水样
6 4
的各个稀释度1 CFU/mL -10CFU/mL，最低检测限10CFU/mL，增菌后最低检测限10CFU/mL；
8 5
PCR分别检测模拟阳性肉样的各个稀释度1 CFU/g -10CFU/g，最低检测限10CFU/g，增菌后最低检测限10CFU/g。图1。
[0048] 实施例3
[0049] 试剂盒的特异性试验，包括以下步骤：
[0050] 按照实施例2中试剂盒PCR扩增方法检测大肠杆菌O157:H7 EDL933、大肠杆菌O26、大肠杆菌O55和非大肠杆菌病原（链球菌、沙门氏杆菌、巴氏杆菌、痢疾志贺菌、弗氏志贺菌2a）（李丽，等。EHEC O157H7二重PCR的建立及应用。华北农学报，2011，26(6)：61。）结果均未扩增出任何条带，只有大肠杆菌 O157:H7 EDL933扩增出354bp的条带。
[0051] 实施例4
[0052] 上述引物序列和试剂盒检测临床样品，包括以下步骤：
[0053] 4.1样品收集：采集奶牛粪便20份，肉牛粪便20份，25-30g/份；集贸市场购买不同摊位牛肉，各250g，共6个样品；蔬菜和水果批发市场，购买菠菜、豆芽、韭菜、荸荠和生菜，各250g，共30份。所有采集和购买样品储存在样品收集袋（南京助研公司）中，密封冷藏保存。
[0054] 4.2待检模板的制备：从样品收集袋中取出粪便或者食物10克，加入到90mL磷酸盐缓冲液中，37℃震荡2h后，取1mL加入到9mL心脑浸出液培养基（杭州微生物试剂制品公司）中，培养基中再加入100 uL浓度为50mg/mL新生霉素（Ameresco进口分装），37℃继续培养18h，吸取1mL培养物，500 r离心15min，弃沉淀，吸取上清至新离心管，12000r离心10min，弃上清，取沉淀重悬于1/10体积双蒸水中，沸水浴10min，4℃12000r离心10min，吸取上清，即检测用模板DNA。
[0055] 4.3PCR扩增条件：在0.2mL的PCR反应管中分别加入22uL PCR预混液，DNA聚合酶1uL、DNA模板2uL。
[0056] 4.4将PCR管至于PCR仪中进行扩增；反应条件为：95℃预变性5min，94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 40s，29个循环，72℃再延伸5min。
[0057] 4.5将PCR产物于质量比为1.2%的琼脂糖凝胶上电泳。
[0058] 4.6结果判定：扩增产物如果有354bp的条带，即表示有大肠杆菌O157:H7的存在；扩增产物如果没有354bp的条带，即表示无大肠杆菌O157:H7的存在。
[0059] 结果表明，上述所有样品共计76份，大肠杆菌O157:H7阳性12份，其中粪便阳性9份，荸荠阳性1份，菠菜阳性2份。