一种尿液中苯乙醇酸的液相色谱串联质谱测定方法

摘要

一种尿液中苯乙醇酸的液相色谱串联质谱测定方法，其特征在于：包括样品经稀释后直接引入液相色谱-电喷雾电离-串联质谱仪进行测定，可快速、准确检测出尿液中苯乙醇酸的含量水平。本发明为全新的尿液中苯乙醇酸含量的测定方法，采用外表法定量分析物；串联质谱法更好的提高了方法的选择性与准确性。通过色谱柱以及洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间。

权利要求

1.一种尿液中苯乙醇酸的液相色谱串联质谱测定方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：a、收集志愿者尿液；

b、样品前处理：室温下解冻尿液样品，混合均匀后，经过0.22 μm的滤膜过滤，取200 μL的尿液，加入0.80 mL纯水，取2 μL滤液引入LC-MS/MS分离分析；

c、标准工作液的配制：用纯水配制不同浓度的苯乙醇酸标准工作溶液；

d、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度的苯乙醇酸标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，选取了Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱，规格150 mm×2.1 mm，3.5 µm，初始流动相体系选取50% 溶剂A：水溶液和50% 溶剂B：甲醇溶液，等度洗脱，流动相流速为400 μL/min，分析时间为10 min，进样量为2 μL；

串联质谱检测器的条件：电喷雾离子源，多反应监测负离子扫描方式；电喷雾电压：

4500V, 雾化气：50 psi, 气帘气：35 psi, 辅助加热气：30 psi，射入电压：9 V，驻留时间：

100 ms；

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苯乙醇酸的线性回归方程为y=1.35×10x-1.34×10，其中Y代表分析物的峰面积，X表示尿液中目标分析物的浓度，相关系数大于0.999，对样品待测液进行测定，测得分析物的峰面积，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。

2.根据权利要求1所述的尿液中苯乙醇酸的液相色谱串联质谱测定方法，其特征在于：苯乙醇酸标准工作溶液的浓度分别为5，10，20，50和100 ng/mL。

说明书

一种尿液中苯乙醇酸的液相色谱串联质谱测定方法

技术领域

[0001] 本发明属于尿液样本的理化检验技术领域，具体说是一种采用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱仪测定尿液中苯乙醇酸含量的方法。

背景技术

[0002] 苯乙烯是塑料橡胶工业的重要原料，用以制造各种塑料树脂，合成橡胶，含有苯乙烯的塑料橡胶制品广泛用于日常生活和工业生产，如各种包装材料、隔热材料、一次性饭盒、纸杯、管道、容器等。苯乙烯还存在于卷烟烟气中。苯乙烯主要以气体形式通过呼吸道，或通过皮肤接触进入人体，短时间接触高浓度苯乙烯可引起咳嗽、咽痛等呼吸道刺激症状；长时间接触苯乙烯可引起肺组织结构损害，从而使人易患肺炎、肺气肿等疾病。国际癌症研究组织将其列为Group 2A，即对人类为很可能致癌物，对动物则为确定之致癌物。吸入体内的苯乙烯在CYP2B6和CYP2E酶的作用下代谢为苯乙烯7，8-氧化物，苯乙烯7，8-氧化物在环氧化物酶的作用下进一步代谢为苯乙醇酸和苯乙醛酸，苯乙醇酸的结构式如下，目前已经被用作苯乙烯暴露的生物标志物。

[0003]

[0004] 目前，分析尿液中苯乙醇酸的方法主要有：液相色谱法、气相色谱法、气相色谱质谱法和液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）的方法。由于尿液基质比较复杂，采用液相色谱的方法检测往往需要经过复杂的前处理来净化样品，且由于仪器灵敏度不够，对于非职业暴露人群尿液中苯乙醇酸的检测存在挑战；而气相色谱质谱方法需要先进行衍生化；液相色谱串联质谱由于其灵敏度高、检测限低，因此被广泛的用于尿液中生物标志物的研究。

发明内容

[0005] 本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，建立一种简单、快速、选择性好的测定尿液中的苯乙醇酸的LC-MS/MS方法，该方法能快速、准确检测尿液中苯乙醇酸的含量，测定结果准确、测定干扰少。

[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

[0007] 一种尿液中苯乙醇酸的液相色谱串联质谱测定方法，包括以下工艺步骤：

[0008] a、收集志愿者尿液。

[0009] b、样品前处理：室温下解冻尿液样品，混合均匀后，经过0.22 μm的滤膜过滤，取200 μL的尿液，加入0.80 mL纯水，取2 μL滤液引入LC-MS/MS分离分析。

[0010] c、标准工作液的配制：用纯水配制不同浓度的苯乙醇酸标准工作溶液，浓度分别为5，10，20，50和100 ng/mL。

[0011] d、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度的苯乙醇酸标准4 4
工作溶液，注入LC-MS/MS系统，苯乙醇酸的线性回归方程为y=1.35×10x-1.34×10，其中Y代表分析物的峰面积，X表示尿液中目标分析物的浓度。相关系数大于0.999，对样品待测液进行测定，测得分析物的峰面积，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。

[0012] 本发明中选取了Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，3.5 µm），初始流动相体系选取50% 溶剂A（水溶液）和50% 溶剂B（甲醇溶液），等度洗脱，流动相流速为400 μL/min，分析时间为10 min，进样量为2 μL。

[0013] 串联质谱检测器的条件：电喷雾离子源，多反应监测负离子扫描方式；电喷雾电压：4500V, 雾化气：50 psi, 气帘气：35 psi, 辅助加热气：30 psi，射入电压：9 V，驻留时间：100 ms。选取m/z 149/77作为定量离子对，m/z 149/105为定性离子对。

[0014] 本发明方法的线性范围和检出限：

[0015] 用处理过的混合空白尿液配制系列标准曲线，苯乙醇酸的标准曲线的点为5，10，20，50和100 ng/mL，化合物的线性良好，相关系数为0.9990。利用加标稀释得到方法的定量限和检出限，目标峰10倍信噪比对应的浓度为定量限，3倍信噪比对应的浓度为检出限。
方法的检出限和定量限分别为2.24 ng/mL和7.47 ng/mL。

[0016] 本发明方法加标回收率和重复性：

[0017] 采用尿液基质加标准品的方法测定方法的回收率。选取五个尿液样本，混合均匀以后，选取低、中和高三个添加水平加入标准品，每个浓度平行做6个重复，得到方法的回收率和精密度（以相对标准偏差（RSD）计）,见表1，方法的回收率范围是85.0-110.2%，RSD＜5%。

[0018] 表1方法的回收率和精密度（n=6）

[0019]化合物 本底/（ng/mL） 加标量/（ng/mL） 检测/（ng/mL） 平均回收率/% 相对标准偏差/%
20 48.6 85.0 4.30
苯乙醇酸 31.6 50 86.7 110.2 2.36
80 118.3 108.4 1.84

[0020] 本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对尿液样本优化了前处理方法，并对LC-MS/MS的相关检测条件进行了优化，主要优化了离子源条件，色谱柱以及流动相体系。与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：

[0021] ① 与传统的液相色谱-荧光法比较，LC-MS/MS方法灵敏度更高（约100倍），前处理只需要简单的过滤和稀释，需要的样品量少（200 μL）。

[0022] ②本方法具有操作简便、快速、准确、灵敏度及重复性好的优点。

附图说明

[0023] 图 1中：（A）苯乙醇酸标准品水溶液的色谱图；（B）苯乙醇酸稀释5倍的尿液中色谱图。

具体实施方式

[0024] 本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。

[0025] 一种尿液中苯乙醇酸的测定方法，其测试过程是尿液经稀释后直接引入LC-MS/MS系统分析。

[0026] 实例1：

[0027] 1．仪器与试剂：安捷伦1200 液相色谱（美国安捷伦公司），配有G1329A 自动进样器，G1311A 四元混合泵和G1316A 柱温箱；API 4000三重四级杆串联质谱仪（美国应用生物系统公司），配有电喷雾离子源（ESI）和analyst 1.5软件数据处理系统。

[0028] 苯乙醇酸标准品 （纯度: 99.5%, 美国ChemService Inc.）；甲醇（TEDIA company Inc., Ohio, USA），所有的溶剂均为色谱纯，实验中所用水都为去离子水。

[0029] 2．样品处理：尿液样品于室温下解冻，混合均匀后，经过0.22 μm的滤膜过滤，取200 μL的尿液，加入0.80 mL纯水，取2 μL滤液引入LC-MS/MS分离分析。

[0030] 3．测定方法：吸取5，10，20、50和100 ng/mL的标准溶液和稀释过滤后的样品各2 µL，注入LC-MS/MS系统进行分离分析，测得样本中苯乙醇酸的含量。

[0031] 实例2：如实施例1所述，留取10个尿液样本。测得尿液中苯乙醇酸的含量如表2所示。

[0032] 表 2 尿液中苯乙醇酸的含量水平（µg/mL）

[0033]序号 含量 序号 含量
1 0.58 6 0.33
2 0.14 7 0.22
3 0.83 8 0.39
4 0.48 9 0.12
5 0.19 10 0.51