一种食品中百草枯残留量的测定方法

摘要

本发明公开了一种食品中百草枯残留量的测定方法，本发明的样品前处理是用甲醇水溶液提取食品样品中的百草枯，然后选择C18和PSA分散固相萃取剂对提取液进行净化，最后结合高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱，通过化合物离子的精确质量数实现食品中残留百草枯的定性和定量测定。本发明能有效降低食品中百草枯残留检测的基质干扰，平均回收率80.6%～96.8%，相对标准偏差为3.9%～7.1%，定量限为10μg/kg，其操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点，是对已有QuEChERS方法的补充和改进，完全能满足我国和欧盟、美国、日本对相应产品安全检测的技术要求，将为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

权利要求

1.一种食品中百草枯残留量的测定方法,其特征在于包括如下步骤：(1)提取

称取均质化的食品样品于具塞塑料离心管中，加甲醇水溶液涡旋振荡，离心；

(2)净化

移取上述步骤(1)获得的上清液于塑料离心管中，加入基质分散固相萃取剂，涡旋振荡，离心，吸取上清液过0.22μm滤膜，所得样品液待测定；

(3)配制基质标准工作溶液

将空白样品按上述步骤(1)、(2)处理，用该空白样品基质溶液在10～1000μg/L范围内配制百草枯系列浓度标准工作液；

(4)液相色谱--四极杆飞行时间串联质谱(LC-Q TOF)测定a)定量测定：将步骤(3)中的各浓度基质标准工作液进行LC-Q TOF测定，以各浓度基质标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤(2)得到的样品液注入LC-Q TOF进行测定，测得样品液中百草枯的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中百草枯含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中百草枯残留量；

b)定性测定：检测步骤(2)得到的样品液中目标化合物，若其准分子离子色谱峰保留时间与基质标准工作溶液一致；且其准确质量数与浓度相当基质标准溶液中目标化合物的准确质量数的相对标准偏差不超过限定值时，则判断该样品中存在百草枯；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含百草枯；

上述步骤(2)中基质分散固相萃取剂由C18和PSA组成，每毫升提取液中C18和PSA加入量分别为50mg；

上述步骤(1)中甲醇水溶液的体积浓度为20％；

上述步骤(4)中液相色谱的流动相为A：甲醇和流动相B：含0.1％甲酸-5mmol/L甲酸铵水溶液，采用A：B体积比20:80等度洗脱，流速：0.2mL/min；

上述步骤(4)中液相色谱的色谱柱为亲水色谱柱；

上述步骤(4)中质谱检测使用电喷雾源(ESI)正离子模式，毛细管电压为+4000V，雾化气压力为275.8kPa，干燥气为氮气，干燥气温度为350℃，干燥气流速为10.0L/min，参比离子m/z121.050873与m/z922.009798，扫描范围50-1100m/z。

2.如权利要求1所述的食品中百草枯残留量的测定方法，其特征是上述步骤(4)中质谱检测使用一级全扫描模式，百草枯准分子离子的准确分子量是186.1159。

3.如权利要求1所述的食品中百草枯残留量的测定方法，其特征是上述步骤(1)和(2)中的涡旋振荡时间是1min。

4.如权利要求1所述的食品中百草枯残留量的测定方法，其特征是上述步骤(1)和(2)中的离心5000r/min，离心时间3-5min。

5.如权利要求1所述的食品中百草枯残留量的测定方法，其特征是上述步骤(1)～(4)中样品接触到的包括离心管在内的容器均应为塑料材质制成。

说明书

一种食品中百草枯残留量的测定方法

技术领域

[0001] 本发明属于农药残留量的测定技术领域，具体地说涉及一种食品中百草枯残留量的测定方法。

背景技术

[0002] 在水果、蔬菜、粮谷等农作物种植过程中，农田杂草对农作物产量和品质产生重要影响。除草剂在农业生产中的使用，不仅节省了大量繁重的除草体力劳动和机械除草作业，更重要的是减少了因草害造成的农产品产量和品质的损失，得到可观的经济效益。但是随着人们对食品安全问题的关注，除草剂残留对人类健康的危害也倍受关注。

[0003] 百草枯（paraquat）化学名1，1，-二甲基-4，4，-联吡啶阳离子，属于有机杂环类季铵盐除草剂。作为广谱性除草剂应用广泛，2011年百草枯销售额在全球除草剂销售中排名第2。百草枯对人畜具有较强的毒性作用，摄入后对生物体的还原-氧化活性影响很大，对肺、心、肝、肾等都有害，目前百草枯中毒尚无有效治疗方法。我国、国际食品法典委员会（CAC）、美国、欧盟和日本等国家对百草枯均制定了残留限量标准，在水果、蔬菜、鱼、肉等多种食品中的最大残留限量0.01～3.5mg/kg。显然随着百草枯的推广和使用，建立食品中百草枯残留量的检测方法具有很重要的意义。

[0004] 已有QuEChERS方法作为新发展起来的样品前处理技术，是代表快速、简单、价廉、高效、稳定和安全（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）的样品前处理方法。具有回收率高，分析农药范围广，处理速度快，溶剂使用量少，操作简便等优点。目前国际广泛认可使用的QuEChERS方法有欧盟制定的EN15662和美国官方分析化学师协会的AOAC2007.01标准方法。上述2个方法都包括提取、净化2个步骤：其中1用乙腈或含1％乙酸的乙腈提取样品，通过加入缓冲盐混合物进行盐析萃取实现乙腈和样品所在水相的液-液分离；2用分散固相萃取剂和无水硫酸镁对提取溶液净化，分散固相萃取剂依据样品基质和待测化合物的性质，可选择PSA、GCB、C18EC等。但都必须加入无水硫酸镁除以去中乙腈中残留的水分。

[0005] 百草枯属于强极性季铵盐类化合物，极易溶于用水，难以用乙腈萃取，因此无法采用原有QuEChERS方法进行样品前处理。通常百草枯前处理采用固相萃取柱净化，但是方法较复杂，回收率低，对操作人员要求较高；或不经净化直接检测，基质干扰大，对仪器污染严重。因此寻求和建立适应百草枯残留检测的QuEChERS方法是非常必要的。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种食品中百草枯残留量的测定方法，以弥补现有技术的不足。

[0007] 本发明的另一目的是提供一种样品前处理方法，以弥补现有国际广泛认可使用的QuEChERS方法无法用于百草枯残留检测的不足。

[0008] 本发明的样品前处理是对已有QuEChERS方法的补充和改进，由于百草枯极易溶于水的特性，致使现有QuEChERS方法用乙腈或含1％乙酸的乙腈从水相中盐析萃取的提取百草枯的方法无法实用，本发明选用甲醇水溶液为提取溶剂从样品中直接提取，保证了百草枯的提取效率。在净化步骤，因为提取溶剂主要是水，所以现有方法加入无水硫酸镁以去除提取液中残余水分的方法并不可行，因此本发明仅使用分散固相萃取剂对提取液进行净化，而不加入无水硫酸镁，且分散固相萃取剂只能选择C18和PSA。

[0009] 因此，本发明的百草枯检测，其前处理是首先用甲醇水溶液提取食品样品中的百草枯，再选择C18和PSA分散固相萃取剂对提取液进行净化，最后结合高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱，通过化合物离子的精确质量数实现食品中残留百草枯的定性和定量测定。

[0010] 本发明的测定方法包括如下步骤：

[0011] （1）提取

[0012] 称取均质化的食品样品于具塞塑料离心管中，加甲醇水溶液均质提取1min，振荡，离心；

[0013] （2）净化

[0014] 移取上述步骤（1）获得的上清液于塑料离心管中，加入基质分散固相萃取剂，涡旋振荡，离心，吸取上清液过0.22μm滤膜，所得样品液待测定；

[0015] （3）配制基质标准工作溶液

[0016] 将空白样品按上述步骤（1）、（2）处理，用该空白样品基质溶液在10～1000μg/L范围内配制百草枯系列浓度标准工作液；

[0017] （4）液相色谱--四极杆飞行时间串联质谱（LC-Q TOF）测定

[0018] a)定量测定：将步骤（3）中的各浓度基质标准工作液进行LC-Q TOF测定，以各浓度基质标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤（2）得到的样品液注入LC-Q TOF进行测定，测得样品液中百草枯的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中百草枯含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中百草枯残留量。

[0019] b)定性测定：检测步骤（2）得到的样品液中目标化合物，若其准分子离子色谱峰保留时间与基质标准工作溶液一致；且其准确质量数与浓度相当基质标准溶液中目标化合物的准确质量数的相对标准偏差不超过5ppm时，则判断该样品中存在百草枯；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含百草枯。

[0020] 上述步骤（2）中甲醇水溶液的体积浓度为20%。

[0021] 上述步骤（2）中基质分散固相萃取剂由C18和PSA组成，每毫升提取液中C18和PSA加入量分别为50mg。

[0022] 上述步骤（4）中液相色谱的流动相为A：甲醇和流动相B：含0.1%甲酸-5mmol/L甲酸铵水溶液，采用A：B体积比20:80等度洗脱，流速：0.2mL/min。

[0023] 上述步骤（4）中液相色谱的色谱柱为亲水色谱柱（HILIC）。

[0024] 上述步骤（4）中质谱检测使用电喷雾源（ESI）正离子模式，毛细管电压为+4000V，雾化气压力为275.8kPa，干燥气为氮气，干燥气温度为350℃，干燥气流速为10.0L/min，参比离子m/z121.050873与m/z922.009798，扫描范围50-1100m/z。

[0025] 上述步骤（4）中质谱检测使用一级全扫描模式，百草枯准分子离子的准确分子量186.1159。

[0026] 上述步骤（1）和（2）中的涡旋振荡时间是1min。

[0027] 上述步骤（1）和（2）中的离心5000r/min，离心时间3～5min。

[0028] 上述步骤（1）～（4）中样品接触到的包括离心管在内的容器均应为塑料材质制成。

[0029] 本发明的有益效果在于：

[0030] 本发明能有效降低食品中百草枯残留检测中的基质干扰，将此前处理方法结合HPLC-QTOF应用于食品中百草枯定性确证和定量检测，平均回收率80.6%～96.8%，相对标准偏差（RSD）为3.9%～7.1%，定量限为10μg/kg。本发明具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点，是对已有QuEChERS方法的补充和改进。完全能满足我国和欧盟、美国、日本对相应产品安全检测的技术要求，将为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

附图说明

[0031] 图1是10ng/mL基质标准百草枯提取离子色谱图。

[0032] 图2是百草枯标准质谱图。

具体实施方式

[0033] 现以以下实施实例来说明本发明，但并不是限制本发明的范围。

[0034] 本发明实施例中使用的仪器与试剂：

[0035] T18Basic均质器（IKA，Germany）；CR21GⅢ型高速冷冻离心机（Hitachi，Japan）；MS3型旋涡混合器（IKA，Germany）；1200高效液相色谱-6520四级杆飞行时间质谱（Agilent，USA）；PSA分散固相萃取剂（Agilent，USA）；C18分散固相萃取剂（Agilent，USA）。

[0036] 试剂：甲醇（HPLC级，Merke，Germany）；甲酸铵（HPLC级，CNW，Germany）；甲酸（HPLC级，CNW，Germany）。

[0037] 百草枯标准物质：纯度为97.5%，购自德国Dr Ehrenstorfer公司。

[0038] 实施例1：苹果中百草枯残留量的检测

[0039] （1）样品前处理

[0040] 称取均质化的苹果样品10.0g于50mL具塞塑料离心管中，加入10mL甲醇水溶液，涡旋1min，5000r/min离心5min。离心后，取2mL上清提取液至装有100mg C18和100mg PSA的离心管中，涡旋1min，5000r/min离心3min。取上清液过0.22μm滤膜后，所得样品液供液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（LC-Q TOF）测定。

[0041] （2）标准工作溶液的配制

[0042] 称取25±0.1mg标准品于25mL塑料容量瓶中，用乙腈溶解，定容得1000.0μg/mL标准储备液；移取1.0mL标准储备液置于100mL塑料容量瓶中，用乙腈定容得到10.0μg/mL标准中间液；

[0043] 用经检测不含百草枯的苹果作为空白样品，通过上述前处理步骤制备空白基质溶液，将标准中间液用空白基质溶液稀释配制成10、20、50、100、200、500、1000ng/mL系列基质标准工作溶液。

[0044] （3）液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（LC-Q TOF）测定

[0045] 定量测定：将步骤（3）中的各浓度基质标准工作液进行LC-Q TOF测定，以各浓度基质标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤（2）得到的样品液注入LC-Q TOF进行测定，测得样品液中百草枯的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中百草枯含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中百草枯残留量。

[0046] 其中色谱条件为：BEH HILIC色谱柱(2.1mm×100mm,1.7μm;美国Waters)；流动相：甲醇和含0.1%甲酸-5mmol/L甲酸铵水，以体积比20:80等度洗脱；流速：0.2mL/min；柱温：30℃；进样量：2μL。

[0047] 其中质谱参数为：电喷雾源（ESI）正离子模式扫描；干燥气温度350℃，干燥气流速10L/min，雾化气压力275.8kPa，毛细管电压4kV，毛细管出口电压190V，扫描方式：一级全扫描，参比离子m/z121.050873与m/z922.009798，扫描范围50-1100m/z。

[0048] 定性鉴定：检测步骤（2）得到的样品液中目标化合物，若其准分子离子色谱峰保留时间与基质标准工作溶液一致；且其准确质量数与浓度相当基质标准溶液中目标化合物的准确质量数的相对标准偏差不超过5ppm时，则判断该样品中存在百草枯；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含百草枯。

[0049] 标准工作曲线和检出限：

[0050] 以基质标准工作溶液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线。以3倍信噪比(S/N)对应的样品中待测物浓度作为检出限(LOD)，10倍信噪比(S/N)对应的样品中待测物浓度作为定量限(LOQ)，获得各待测物的检出限和定量限。结果显示(如表1所示)，相关系数大于0.999，定量限和检出限分别为10μg/kg和5μg/kg。

[0051] 表1百草枯的保留时间、回归方程、相关系数、定量限和检出限

[0052]名称 保留时间（min） 回归方程 相关系数 定量限(μg/kg) 检出限（μg/kg）百草枯 3.65 Y=11019.1307X-44748.6835 0.9990 10 5

[0053] 加标回收率和重复性如下：

[0054] 用经检测不含百草枯的苹果作为空白样品，加入上述低中高不同浓度水平的百草枯标准溶液，添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定，将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表2。

[0055] 表2百草枯的回收率和重复性（n=6）

[0056]

[0057] 由表2可以看出，在3个加标水平上，百草枯的回收率为80.6%～96.8%，相对标准偏差（RSD）为3.9%～7.1%，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。

[0058] 显然，本发明能弥补现有技术中百草枯残留检测无法使用QuEChERS方法前处理的技术缺陷，提高LC-Q TOF检测的灵敏度,实现食品中百草枯残留的准确分析。

[0059] 以上的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求。