本发明为一种促进兰花生长和防病的方法，涉及一种在防治病害的同时，还能促进兰花发枝、延长花期的方法。本发明在兰花分株移植时，按哈茨木霉T216制备的孢子浓度为1×107-1×108个孢子/g的固态培养物与培养基质1:50的质量比，将二者混匀装盆，再栽入兰花植株，在兰花生长期间，该固态培养物可诱导兰花植株对白绢病、立枯病、炭疽病等真菌性病害及欧氏杆菌引起的细菌性软腐病的抗性，减少植株发病率，降低病情指数；并促进兰花提早发枝，增加兰花的叶片数。此外，本发明研究发现在兰花初现花苞时，将哈茨木霉T216的液态培养物调节成1×105-1×107个孢子/mL的浓度，对兰花植株进行喷雾处理，可增加兰花的花枝数及延长兰花的花期。
1.一种促进兰花生长和防病的方法，其特征在于，应用木霉菌的固态培养物与兰花培养基质混匀，应用木霉菌的液态发酵培养物对兰花植株进行喷雾，促进兰花的发枝，延长花期，减少病害的发生；具体是在兰花以球茎分株移栽时，应用木霉菌的固态培养物与兰花培养基质混匀，在兰花现苞时，应用木霉菌的液态发酵培养物对兰花植株进行喷雾；所述的木霉菌是保藏编号为CCTCC NO：M207141的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)T216。
2.根据权利要求1所述的促进兰花生长和防病的方法，其特征在于，所述的木霉菌的固态培养物的培养过程为：配制稻麸粉固体培养基，用水拌湿，分装，灭菌冷却；在无菌条件下，接入木霉菌的种子菌，24-26℃培养，经常摇动瓶体，待木霉菌丝长满培养基并产生大量绿色分生孢子后，倒
出，摊开粉碎阴干，过40目筛，此时孢子浓度为1×10-1×10个孢子/g，加珍珠岩将孢子
浓度调节为1×10-1×10个孢子/g，得到固态培养物。
3.根据权利要求2所述的促进兰花生长和防病的方法，其特征在于，兰花移植时，按固态培养物与栽培基质1:50的质量比，将二者混匀，再栽入兰花植株即可。
4.根据权利要求2所述的促进兰花生长和防病的方法，其特征在于，所述的稻麸粉固体培养基是每1000g培养基中含麦麸500g，米糠450g，玉米粉30g，(NH4)2SO410g，葡萄糖
5.根据权利要求2所述的促进兰花生长和防病的方法，其特征在于，种子菌的培养：培养基配方：可溶性淀粉30g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCO3
0.25g，(NH4)2SO4 2g，水1000mL，pH6.9，分装于500mL三角瓶中，装液量为200mL，经115℃灭菌20分钟；在无菌条件下，将培养于PDA试管斜面培养基上的哈茨木霉T216菌株接入三角瓶中，于27±1℃的培养温度，150转/分的转速条件下，培养60小时，获到制备的种子菌。
6.根据权利要求1所述的促进兰花生长和防病的方法，其特征在于，木霉菌液态发酵培养物按如下方法获得：发酵罐发酵：按体积比10％的接种量将种子菌接入发酵罐培养基中，进行发酵，发酵控制参数为：温度控制，分为两个阶段，发酵第一阶段：0-72小时，
26-28℃，发酵第二阶段：72-200小时，23-25℃；通气量(V/V)：0-20小时：1:0.6；20-40小时：1:0.8；40-80小时：1:1.2；80小时以后：1:0.6；搅拌速度：250-300rpm；整个发酵过程pH值控制为6.5-6.8；发酵完成后将发酵液用氢氧化钠溶液调至pH为7.5，闷罐过夜，过滤，即可。
7.根据权利要求6所述的促进兰花生长和防病的方法，其特征在于，发酵罐培养基：
1.5-2.0％麦麸汁液，0.5-1.0％葡萄糖，2.0-3.0％玉米粉，1.0-2.0％酵母膏，0.1-0.5％CaCO3,0.01-0.03％MgSO4·7H2O，0.5-0.8％KH2PO4和K2HPO4，pH值为6.5-6.8，余量为水，所述百分比均为重量百分比；通入蒸汽达121℃灭菌30分钟；其中麦麸汁液为每200g麦麸加水1000mL的浸渍液。
8.根据权利要求6所述的促进兰花生长和防病的方法，其特征在于，种子菌的培养：培养基配方：可溶性淀粉30g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCO3
0.25g，(NH4)2SO4 2g，水1000mL，pH6.9，分装于500mL三角瓶中，装液量为200mL，经115℃灭菌20分钟；在无菌条件下，将培养于PDA试管斜面培养基上的哈茨木霉T216菌株接入三角瓶中，于27±1℃的培养温度，150转/分的转速条件下，培养60小时，获到制备的种子菌。
9.根据权利要求6所述的促进兰花生长和防病的方法，其特征在于，在兰花初现花苞
时，将液态发酵培养物用水调节成1×10-1×10个孢子/mL的浓度，对兰花植株进行喷雾处理。
一种促进兰花生长和防病的方法
技术领域
[0001] 本发明属于促进兰花生长和防病的栽培技术领域，涉及一种哈茨木霉T216在防治兰花病害的同时，还能促进兰花发枝、延长花期的方法。
背景技术
[0002] 兰花紫茎绿叶，四季常青，叶姿清雅潇洒，开花清香幽远，更因高洁、典雅的气质名列百花之冠，为世人广为栽培。在人工条件下栽培，选择合适的栽培基质非常重要。国内外用于兰花栽培植料一般由天然矿物、田园土壤、工农业有机无机废弃物的单质或混合(复合体)，它基本具备了水、肥、汽、热等类似于自然土壤可供植物生长的肥力特性。目前，人工配制的栽培基质也越来越多地应用到兰花栽植中，其中常用的基质材料主要有以下几种:兰石，浮石，蛭石，蛇木，陶粒，炉渣，木炭，水苔，树皮，珍珠岩，木屑，花泥，松针，腐叶，稻壳，椰糠，泡沫塑料或泥炭，这些培养基质能提供兰花生长养分供应需要。但兰花在生长过程中常会受到病原真菌、细菌及病毒等微生物的为害，从而引起兰花产生腐烂、发锈、猝倒、枯萎、溃疡、炭疽、痂斑、斑点等症状，严重影响兰花的生长和品质。据统计，仅为害兰花的病原真菌就约有30余属100多种。常见的为：引起炭疽病的刺孢盘属(Collectotrichum)，引起白绢病的小核菌属(Sclerotium)，引起花果枯萎病的葡萄孢属(Botrytis)，引起黑腐病或心腐病的疫霉属(Phytophthora)，引起叶斑病或枯萎病的镰刀菌属(Fusarium)，以及引起锈病的夏孢锈菌属(Uerdo)、鞘锈菌属(Coleosporium)等。而现有的普通培养基质自身还不具有防病杀菌的功效。
[0003] 目前兰花病害多采用化学药剂防治，常引发①农药使用过量，引起兰花药害；②对侵染病原菌判断不准确，不能对症下药；③错过防治适期，防治效果低；④长期单一使用杀菌剂，使病原菌产生抗药性；⑤污染环境等问题。目前也有一些采用物理、生物等方法防治兰花的研究报道，如用一定浓度的食醋防治兰花的黑斑病和白粉病等，这也存在防治适期不易掌握及防治效果偏低的缺点。此外，兰花多采用鳞茎分株的方法进行扩繁种植，若未做好栽植基质和种茎消毒，病害也会很快传播蔓延。因此，探索出一种适合于兰花病害防治，而且 同时又能促进兰花生长的方法是目前兰花栽培技术领域急需解决的问题。
发明内容
[0004] 本发明的目的是针对兰花人工栽培中，常受真菌性及细菌性病原菌侵染为害，但现有防治方法存在诸多缺陷的情况，提供一种在防治病害的同时，还能促进兰花发枝、延长花期的方法。
[0005] 本发明的目的是通过以下方式实现的：
[0006] 一种促进兰花生长和防病的方法，应用木霉菌的固态培养物与兰花培养基质混匀，应用木霉菌的液态发酵培养物对兰花植株进行喷雾，促进兰花的发枝，延长花期，减少病害的发生。
[0007] 上述方法中优选在兰花以球茎分株移栽时，应用木霉菌的固态培养物与兰花培养基质混匀作为移栽栽培基质；在兰花现苞时，应用木霉菌的液态发酵培养物对兰花植株进行喷雾。
[0008] 上述方法中所述的木霉菌是保藏编号为CCTCC NO：M207141的哈茨木霉（Trichoderma harzianum）T216。
[0009] 上述方法中所述的木霉菌的固态培养物的培养过程为：
[0010] 配制稻麸粉固体培养基，用水拌湿，分装，灭菌冷却；在无菌条件下，接入木霉菌的种子菌，24-26℃培养，经常摇动瓶体，待木霉菌丝长满培养基并产生大量绿色分生孢子后，8 9
倒出，摊开粉碎阴干，过40目筛，此时孢子浓度为1×10-1×10个孢子/g，加珍珠岩将孢
7 8
子浓度调节为1×10-1×10个孢子/g，得到固态培养物。
[0011] 上述方法中兰花移植时，按固态培养物与栽培基质1:50的质量比，将二者混匀装盆，再栽入兰花植株即可。
[0012] 上述方法中所述的稻麸粉固体培养基是每1000g培养基中含麦麸500g，米糠450g，玉米粉30g，(NH4)2SO410g，葡萄糖10g。
[0013] 上述方法中木霉菌液态发酵培养物按如下方法获得：发酵罐发酵：按体积比10%的接种量将种子菌接入发酵罐培养基中，进行发酵，发酵控制参数为：温度控制，分为两个阶段，发酵第一阶段（菌体培养阶段）：0-72小时，26-28℃，发酵第二阶段（代谢产物产生阶段）：72-200小时，23-25℃；通气量（V/V）：0-20小时：1:0.6；20-40小时：1:0.8；40-80小时：1:1.2；80小时以后：1:0.6；搅拌速度：250-300rpm；整个发酵过程pH值控制为6.5-6.8；
发酵完成后将发酵醪用氢氧化钠溶液调至pH为7.5，闷罐过夜，过滤，即可。
[0014] 上述方法中发酵罐培养基：1.5-2.0%麦麸汁液，0.5-1.0%葡萄糖，2.0-3.0%玉米粉，1.0-2.0%酵母膏，0.1-0.5%CaCO3,0.01-0.03%MgSO4·7H2O，0.5-0.8%KH2PO4和K2HPO4，pH值为6.5-6.8，余量为水，所述百分比均为重量百分比；通入蒸汽达121℃灭菌30分钟；其中麦麸 汁液为每200g麦麸加水1000mL的浸渍液。
[0015] 上述方法中种子菌的培养：培养基配方：可溶性淀粉30g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.5g，CaCO30.25g，(NH4)2SO42g，水1000mL，pH6.9，分装于500mL三角瓶中，装液量为200mL，经115℃灭菌20分钟；在无菌条件下，将培养于PDA试管斜面培养基上的哈茨木霉T216菌株接入三角瓶中，于27±1℃的培养温度，150转/分的转速条件下，培养60小时，获到制备的种子菌。
[0016] 上述方法中在兰花初现花苞时，将液态发酵培养物用水调节成1×105-1×107个6
孢子/mL的浓度，对兰花植株进行喷雾处理，优选1×10个孢子/mL。
[0017] 本发明的有益效果：
[0018] 1、本发明首次提出了一种促进兰花生长和防病的方法，现有技术中多采用化学杀菌剂对兰花进行防病，往往造成环境污染、引起兰花药害、使病原菌产生抗药性等一系列问题；即便偶尔应用物理、生物等防治方法，也会出现防治适期不易掌握及防治效果偏低的缺点，更没有在防病的同时还能促进兰花生长的制剂或者方法出现；可以说目前几乎没有关于达到兰花病害生物防治以及促进兰花生长，延长花期共同效果的研究报道。
[0019] 2、本发明应用木霉菌的固态培养物与兰花培养基质混匀，应用木霉菌的液态发酵培养物对兰花植株进行喷雾，能有效减少病害的发生，促进兰花的发枝，延长花期。
[0020] 3、本发明优选在兰花移栽时，应用木霉菌的固态培养物与兰花培养基质混匀，优选在兰花现苞时，应用木霉菌的液态发酵培养物对兰花植株进行喷雾，通过大量的研究表明，选择在合适的时间，以及合适的处理方式能够进一步体现本发明的效果和优势。
[0021] 4、本发明优选木霉菌是保藏编号为CCTCC NO：M207141的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)T216。该木霉菌有抗化学杀菌剂的优势，在兰花栽培过程中如果使用了其他的化学杀菌剂，则能有效防止其对该木霉的杀灭作用，保证木霉菌的存活和防病、促进生长功能。
[0022] 5、本发明研究发现在兰花分株移植时，在常用的栽培基质中按孢子浓度为7 8
1×10-1×10个孢子/g的固态制剂与培养基质1:50的质量比，将二者混匀装盆，再栽入兰花植株，在兰花生长期间，该固态培养物可诱导兰花植株对白绢病、立枯病、炭疽病等真菌性病害及欧氏杆菌（Erwinia）引起的细菌性软腐病的抗性，减少发病率，降低病情指数；并促进兰花的新叶提早发枝，增加兰花的叶片数。
[0023] 6、本发明研究发现在兰花初现花苞时，将液态培养物调节成1×105-1×107个孢6
子/mL的浓度，优选1×10个孢子/mL的浓度，对兰花植株进行喷雾处理，可增加兰花的花枝数及延长的花期。
[0024] 本发明涉及的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)T216
[0025] 保藏日期：2007年9月7日
[0026] 保藏单位名称:中国典型培养物保藏中心
[0027] 保藏单位简称：CCTCC
[0028] 保藏号为：CCTCC NO.M207141
[0029] 保藏地址：中国.武汉.武汉大学。
具体实施方式
[0030] 以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0031] 实施例1制备实施例
[0032] （1）母种的保存：哈茨木霉（Trichoderma harzianum）突变型菌株T216采用试管PDA斜面培养基培养；
[0033] （2）种子菌的培养：培养基配方：可溶性淀粉30g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.5g，CaCO30.25g，(NH4)2SO42g，水1000mL，pH6.9，分装于500mL三角瓶中，装液量为200mL，经115℃灭菌20分钟。在无菌条件下，将培养于PDA试管斜面培养基上的哈茨木霉T216菌株接入三角瓶中，于27±1℃的培养温度，150转/分的转速条件下，培养60小时，获到制备的种子菌。
[0034] （3）T216菌株固态培养物的制备：配制稻麸粉固体培养基：每1000g培养基中含麦麸500g，米糠450g，玉米粉30g，(NH4)2SO410g，葡萄糖10g，加水至培养基含水量为70-80%，分装于罐头瓶中，灭菌冷却；在无菌条件下，接入种子菌，24-26℃培养，经常摇动瓶体，待木霉菌丝长满培养基并产生大量绿色分生孢子后，倒出，摊开粉碎阴干，过40目筛，孢子浓度8 9 7 8
一般为1×10-1×10个孢子/g，再加入珍珠岩将孢子浓度调节为1×10 -1×10个孢子/
g，即为T216菌株固态培养物。
[0035] （4）T216菌株液态培养物的制备：配制发酵罐培养基：1.5-2.0%麦麸汁液，0.5-1.0%葡萄糖，2.0-3.0%玉米粉，1.0-2.0%酵母膏。0.1-0.5%CaCO3,0.01-0.03%MgSO4·7H2O，0.5-0.8%KH2PO4和K2HPO4，pH值为6.5-6.8，余量为水（所述百分比均为重量百分比）；通入蒸汽达121℃在位灭菌30分钟。按10%（V/V）的接种量将三角瓶中培养的种子菌接入发酵罐，进行控制发酵，发酵控制参数为：温度控制，分为两个阶段，发酵第一阶段菌体培养阶段0-72小时，26-28℃，发酵第二阶段代谢产物产生阶段72-200小时，23-25℃；通气量（V/V）：0-20小时：1:0.6；20-40小时：1:0.8；40-80小时：1:1.2；80小时以后：1:0.6；搅拌速度：250-300rpm；发酵全 过程pH值控制在6.5-6.8；发酵醪用氢氧化钠溶液调pH为7.5，闷罐过夜，灭菌纱布真空过滤，密封包装，即成T216菌株液态培养物。
[0036] 实施例2应用实施例①
[0037] 应用按照实施例1方法制备的T216固态培养物（以下称T216固态菌剂，孢子浓度7
为1×10个孢子/g）进行兰花栽培试验，该实验是在长沙市马坡岭湖南省园艺研究所兰花栽培园进行。在兰花（建兰）分株移植时，在常用的栽培基质中按T216固态菌剂与培养基质1:50的质量比，将二者混匀装盆，再移入兰花植株，按常规方法管理，30d、120d后调查每盆兰花所生新苗。120d后调查植株发病情况，每株如有一片及一片以上叶片有明显病害症状，就算为发病株。试验结果如表1所示。
[0038] 表1木霉T216固态制剂对兰花防病促生长的效果
[0039]
[0040] 试验结果表明，在兰花栽植时，在培养基质中加入T216固态菌剂，可诱导兰花植株对白绢病、立枯病、炭疽病等真菌性病害及欧氏杆菌（Erwinia）引起的细菌性软腐病的抗性，减少发病率，降低病情指数；并促进兰花的新叶发枝，增加兰花的叶片数。
[0041] 实施例3应用实施例②
[0042] 在兰花初现花苞时（本试验为7月10日），将按照实施例1方法制备的T216液态培养物（以下称T216液态菌剂）用水调节成1×106个孢子/mL的浓度，对兰花植株进行喷雾处理，7d后再喷雾一次。固定15个花苞，调查花期时间。30d后，调查60丛兰花的花枝数。试验结果见表2。
[0043] 表2木霉T216液态制剂对兰花花期及发枝的效果
[0044]处理 调查总数（丛） 花枝总数（个） 平均花期（天）
本发明喷雾T216液态菌剂 60 21 13.5
无喷雾菌剂（对照） 60 11 10.6
[0045] 试验结果表明，在兰花现花苞时，用T216液态菌剂对植株进行喷雾处理，可增加兰花的花枝数及延长兰花的花期。
[0046] 本发明对于木霉菌T216固态菌剂、液态菌剂的使用浓度、方式等的探索研究对比的部分 过程。
