亚麻酸酰基乙醇胺的联合医用和保健用药物

摘要

本发明提供了天然芸苔素内酯类似物和亚麻酸酰基乙醇胺在制备用于预防或治疗哺乳动物（尤其是雄性哺乳动物）疾病的药物中的应用，或者在制备用于保健哺乳动物的保健品中的应用。另外，本发明还提供了相应的药物或保健品组合物及其制备方法。

权利要求

1.天然芸苔素内酯类似物和亚麻酸酰基乙醇胺联合在制备用于预防或治疗雄性哺乳动物前列腺增生疾病的药物中的应用，其中所述天然芸苔素内酯类似物是BR6、BR1、BR2、BR3、BR4和/或BR5或它们之任意几种的混合物，其中，BR1的结构式为：

BR2的结构式为：

BR3的结构式为：

BR4的结构式为：

BR5的结构式为：

BR6的结构式为：

2.权利要求1所述的应用，其中所述药物是口服制剂。

3.权利要求2所述的应用，其中所述药物是口服液体制剂。

4.权利要求1所述的应用，其中，所述药物中的亚麻酸酰基乙醇胺无法单独预防或治疗雄性哺乳动物前列腺增生疾病。

5.天然芸苔素内酯类似物和亚麻酸酰基乙醇胺联合在制备用于改善雄性哺乳动物前列腺增生状况的保健品中的应用，其中所述天然芸苔素内酯类似物是BR6、BR1、BR2、BR3、BR4和/或BR5或它们之任意几种的混合物，其中，BR1的结构式为：

BR2的结构式为：

BR3的结构式为：

BR4的结构式为：

BR5的结构式为：

BR6的结构式为：

6.权利要求5所述的应用，其中所述保健品是口服制剂。

7.权利要求6所述的应用，其中所述保健品是口服液体制剂。

8.权利要求5所述的应用，其中，所述保健品中的亚麻酸酰基乙醇胺无法单独改善雄性哺乳动物前列腺增生状况。

9.制备包含天然芸苔素内酯类似物和亚麻酸酰基乙醇胺的哺乳动物用药物或保健品的方法，其包括，（1）用80~100%V/V乙醇水溶液提取破碎的油菜花粉，固液分离后保留滤液，获得醇溶性提取液；

（2）将醇溶性提取液与0~60%V/V乙醇水溶液混合，然后加入乙酸乙酯萃取，保留乙酸乙酯层并加入酯酶进行不完全反应，所述不完全反应是在35~42℃反应0.5~2小时，然后干燥，获得酯溶性提取物；

（3）酯溶性提取物上样于硅胶色谱柱，用甲醇和乙酸乙酯的混合液洗脱，所述混合液中甲醇：乙酸乙酯的体积比为3~8：0.5~1.5，收集含有天然芸苔素内酯类似物的洗脱液，干燥并溶解于甲醇中，获得硅胶柱纯化液；

（4）将硅胶柱纯化液上样于C18反相色谱柱，用乙腈和水的混合液洗脱，所述混合液中乙腈：水的体积比为60~90：10~40，分别收集含有BR6、BR1、BR2、BR3、BR4和/或BR5的洗脱液；

和

（5）将洗脱液干燥后，与亚麻酸酰基乙醇胺混合，以及与药物上可接受的载体或保健品上可接受的载体混合，其中，BR1的结构式为：

BR2的结构式为：

BR3的结构式为：

BR4的结构式为：

BR5的结构式为：

BR6的结构式为：

10.权利要求9所述的方法，其中步骤（1）是：用80~100%V/V乙醇水溶液提取破碎的油菜花粉，固液分离后保留滤液，滤液进一步浓缩，获得醇溶性提取液。

11.权利要求9所述的方法，其中在步骤（2）中，所述不完全反应是在37~41℃反应0.75~

1.5小时。

12.权利要求11所述的方法，其中在步骤（2）中，所述不完全反应是在40℃反应1小时。

13.权利要求9所述的方法，其中在步骤（3）中，所述混合液中甲醇：乙酸乙酯的体积比为4~7：0.8~1.3。

14.权利要求13所述的方法，其中在步骤（3）中，所述混合液中甲醇：乙酸乙酯的体积比为5:1。

15.权利要求9所述的方法，其中在步骤（4）中，所述混合液中乙腈：水的体积比为70~

80：20~30。

16.权利要求15所述的方法，其中在步骤（4）中，所述混合液中乙腈：水的体积比为75:

25。

说明书

亚麻酸酰基乙醇胺的联合医用和保健用药物

技术领域

[0001] 本发明是中国专利第201310086548.8号的继续申请，属于用于哺乳动物（如，人）的医药技术领域，具体而言，本发明涉及天然芸苔素内酯类似物和亚麻酸酰基乙醇胺的联用及其哺乳动物用药物组合物，用于制备治疗或预防哺乳动物疾病的药物中。

背景技术

[0002] 芸苔素内酯被称为世界第六大类植物激素，是用于植物的生长调节剂。其中，化学合成的芸苔素内酯，如中国专利申请CN1217337A、CN1217338A等所述的，虽然产品较为均一，但是种类少，主要是28-表高芸苔素内酯。

[0003] 从植物（如，花粉）或其他天然来源（如，蜂蜡）中提取的芸苔素内酯，其通常是含有多种芸苔素内酯结构类似物的混合物，容易产生产品质量不稳定的情况，即使对于用于植物的生长调节剂这样对稳定性较为宽容的项目来说，也比较难获得稳定的效果，更无法用于要求更高的项目（如用于哺乳动物身体）；如果进一步提纯，则制备成本上升较大，不利于产业化实施，因而阻碍了人们进一步大量纯化，并阻碍了人们去研究其中各芸苔素内酯类似物是否具有芸苔素内酯的活性，更无法想象出对哺乳动物的药物应用。

[0004] 本发明人通过长期而艰苦的努力，摸索出了从植物中提取（纯化）芸苔素内酯类似物的稳定流程，精心研究了其中的各种提取溶剂，尽管其中需要一定的提纯过程，但是只需要一次提取过程，最终可以收集到多种分离的高纯度的天然芸苔素内酯类似物，因而摊薄了提纯的成本，有利于产业化推广实施；这些分离的天然芸苔素内酯类似物可以单独使用，也可以配比混和使用，因而产品质量稳定而容易控制。令人意想不到的是，在获得了大量分离的高纯度的天然芸苔素内酯类似物的基础上，本发明人偶然发现，这些天然芸苔素内酯类似物中的一些，能够用于作为哺乳动物用药物或保健品，例如用于预防或治疗雄性哺乳动物前列腺增生疾病，或用于改善雄性哺乳动物前列腺增生状况。

[0005] 更令人意想不到的是，本发明人从浩如烟海的现有化合物中，偶然发现，天然芸苔素内酯能够与亚麻酸酰基乙醇胺协同起效，从而能够更好地用于预防或治疗雄性哺乳动物前列腺增生疾病，或用于改善雄性哺乳动物前列腺增生状况。

发明内容

[0006] 本发明要解决的技术问题在于提供了新的药物或保健品的应用，能用于哺乳动物（如，人）的治疗、预防或改善。另外，本发明还提供了配比稳定的药物组合物或保健品，以及制备它们的方法。

[0007] 具体而言，在第一方面，本发明提供了天然芸苔素内酯类似物和亚麻酸酰基乙醇胺联合在制备用于预防或治疗哺乳动物疾病的药物中的应用；另外，本发明也提供了天然芸苔素内酯类似物和亚麻酸酰基乙醇胺联合在制备用于改善哺乳动物状况的保健品中的应用。

[0008] 在本文中，亚麻酸酰基乙醇胺（Linolenoyl Ethanolamide；N-9,12,15-Octadecatrienoylethanolamine）具有如图14所示结构，其CAS登记号为57086-93-8，是花生四烯酰基乙醇酰胺的类似物，具有抗菌、止喘、止吐、抗偏头痛和镇痛以及治疗青光眼和缓解硬化症状等作用（参见中国专利申请CN1097735A）。到目前为止，没有报道认为亚麻酸酰基乙醇胺，尤其是低浓度的亚麻酸酰基乙醇胺，能与本发明的天然芸苔素内酯类似物协同起效，用于预防或治疗雄性哺乳动物前列腺增生疾病，或用于改善雄性哺乳动物前列腺增生状况。本发明的亚麻酸酰基乙醇胺可以是化学合成的，也可以是从植物中提取的。

[0009] 由于亚麻酸酰基乙醇胺，尤其是低浓度的亚麻酸酰基乙醇胺，尽管单独给药几乎没有针对前列腺增生的作用，但是仍旧保留了增强天然芸苔素内酯类似物的功效的作用，所以优选在本发明的第一方面的的应用中，所述药物中的亚麻酸酰基乙醇胺无法单独预防或治疗哺乳动物（尤其是雄性哺乳动物）疾病；或者，所述保健品中的亚麻酸酰基乙醇胺无法单独改善哺乳动物（尤其是雄性哺乳动物）状况。无法单独起效可以是亚麻酸酰基乙醇胺的浓度或含量低至无法单独起效。

[0010] 在本文中，药物或保健品，指的是针对哺乳动物（尤其是人）施用的药物或保健品，而不是针对植物施用的组合物。显然，针对哺乳动物（尤其是人）施用的药物或保健品的要求比针对植物施用的组合物的要求高得多，前者需要配比稳定，而后者可以较不稳定；前者需要无菌，而后者可以有些菌；前者杂质含量低，而后者可以含有较多杂质，所以，即使前者与后者的主要组分相同，但是两者是不同的，或者前者只是后者范畴中不会按后者要求而选择却精选出的一部分。

[0011] 另外，药物和保健品的差异是本领域技术人员所熟悉的，主要是行政审批标准的差异，药物的要求比保健品更高。

[0012] 在本发明的第一方面的应用中，哺乳动物可以是人、家畜、宠物等，优选是人。优选其中，哺乳动物是雄性哺乳动物，如男人。

[0013] 在本文中，“天然”指的是从所限定的物质是从天然来源（如花粉、蜂蜡等）中提取的。在本发明的具体实施方式中，所提供的芸苔素内酯类似物是从油菜花粉中。当然，由于已经解析了这些天然芸苔素内酯类似物，因此它们不限于从天然来源（如花粉、蜂蜡等）中提取，也可以是化学合成的。

[0014] 在本发明的第一方面的应用中，天然芸苔素内酯类似物优选是分离的天然芸苔素内酯类似物。在本文中，“分离的”指的是天然芸苔素内酯类似物脱离了或者曾经脱离了天然存在的环境而以高于50%的纯度存在或者存在过。尽管天然芸苔素内酯类似物可以重新混合入混合物中从而降低了它本身的纯度，但是曾经的高纯度，便于使得各批次产品稳定，这对于制备药物或保健品等涉及人身安全的领域来说，是尤为重要而且比要的优点。因此，在本发明的第一方面的应用中，天然芸苔素内酯类似物优选是配比稳定的天然芸苔素内酯类似物。在本文中，“配比稳定”指的是不同批次产品中天然芸苔素内酯类似物的组成和含量是相同的。由于本发明第一方面的提取方法能够将天然芸苔素内酯类似物分离，因此可以单独使用或者重新配比使用，完全能够做到配比稳定。

[0015] 优选在本发明的第一方面的应用中，所述疾病是前列腺疾病，更优选是前列腺增生疾病。这一疾病尤其困扰中老年男性。相应地，也优选在本发明的第一方面的应用中，所述状况是前列腺状况，优选是前列腺增生状况。

[0016] 经本发明人深入研究，发现有许多天然芸苔素内酯类似物能够用于哺乳动物用药物或保健品，尤其在与亚麻酸酰基乙醇胺联合给药时，能够增强效果，从而能够实际药用或保健使用。优选在本发明的第一方面的应用中，所述天然芸苔素内酯类似物是BR6、BR1、BR2、BR3、BR4和/或BR5，或它们之任意几种的混合物。在本文中，BR1的结构式如图8所示，BR2的结构式如图9所示，BR3的结构式如图10所示，BR4的结构式如图11所示，BR5的结构式如图12所示，BR6的结构式如图13所示。

[0017] BR3单独用药效果已经能够达到极限，尽管联用时未显示出协同效应，但是预计与亚麻酸酰基乙醇胺联用，能在不影响极限药效的情况下可以降低它们的用量，所以BR3也是优选的。另外优选在本发明的第一方面的应用中，所述天然芸苔素内酯类似物是BR6、BR1、BR2、BR4和/或BR5，或它们之任意几种的混合物。

[0018] 另外也优选在本发明的第一方面的应用中，所述药物或保健品是本发明的第二方面的组合物。

[0019] 在第二方面，本发明提供了用于预防或治疗哺乳动物（尤其是雄性哺乳动物）疾病的药物组合物，其包括天然芸苔素内酯类似物和亚麻酸酰基乙醇胺，以及药物上可接受的载体；另外，本发明也提供了用于改善哺乳动物（尤其是雄性哺乳动物）状况的保健品组合物，其包括天然芸苔素内酯类似物和亚麻酸酰基乙醇胺，以及保健品上可接受的载体。

[0020] 在本文中，药物上可接受的载体和保健品上可接受的载体分别具有医药和保健品领域技术人员所熟知的含义，分别指不影响（甚至能增强）活性成分发挥功效的、对人或其他哺乳动物安全无毒的药物辅料或保健品辅料。药物上可接受的载体和保健品上可接受的载体往往可以通用，包括赋形剂、增溶剂、填充剂、pH调节剂和/或矫味剂。它们比常规施用于植物的辅料的杂质含量低得多，均一性更好。

[0021] 在本发明的第二方面的组合物中，天然芸苔素内酯类似物优选是分离的天然芸苔素内酯类似物。另外，在本发明的第二方面的组合物中，天然芸苔素内酯类似物优选是配比稳定的天然芸苔素内酯类似物。

[0022] 优选在本发明的第二方面的组合物中，所述疾病是前列腺疾病，更优选是前列腺增生疾病。相应地，也优选在本发明的第二方面的组合物中，所述状况是前列腺状况，优选是前列腺增生状况。

[0023] 优选在本发明的第二方面的组合物中，所述天然芸苔素内酯类似物和亚麻酸酰基乙醇胺的重量比为0.2~20：0.1~10，更优选为0.6~6：0.3~3，更加优选为1~4：0.5~2，如1.5~2.5：0.8~1.3，最优选为2：1。

[0024] 本发明第二方面的组合物可以是各种制剂（剂型），优选为固体制剂和液体制剂。本发明的制剂可以为单位剂量形式，如片剂、丸剂、胶囊(包括持续释放或延迟释释放形式)、粉剂、混悬剂、颗粒剂、酊剂、糖浆剂、乳液剂、悬浮液、针剂、等剂型以及各种缓释剂型，从而适合各种给药方式，例如口服、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内或经过皮肤等的给药形式。优选本发明的第二方面的组合物是口服制剂，更优选是口服液体制剂，如水溶液或含醇的水溶液。

[0025] 根据本发明人的深入的研究，优选在本发明的第二方面的组合物中，所述天然芸苔素内酯类似物是BR6、BR1、BR2、BR3、BR4和/或BR5，或它们之任意几种的混合物。

[0026] 另外也优选本发明的第二方面的组合物是通过本发明的第三方面的方法制备的。

[0027] 在第三方面，本发明提供了制备包含天然芸苔素内酯类似物和亚麻酸酰基乙醇胺的哺乳动物用药物或保健品的方法，其包括，

[0028] （1）用80~100%（V/V）乙醇水溶液提取破碎的油菜花粉，固液分离后保留滤液（任选其中滤液进一步浓缩），获得醇溶性提取液；

[0029] （2）将醇溶性提取液与0~60%（V/V）乙醇水溶液混合，然后加入乙酸乙酯萃取，保留乙酸乙酯层并加入酯酶进行不完全反应，然后干燥，获得酯溶性提取物；

[0030] （3）酯溶性提取物上样于硅胶色谱柱，用甲醇和乙酸乙酯的混和液洗脱，收集含有天然芸苔素内酯类似物的洗脱液，干燥并溶解于甲醇中，获得硅胶柱纯化液；

[0031] （4）和将硅胶柱纯化液上样于C18反相色谱柱，用乙腈和水的混和液洗脱，分别收集含有BR6、BR1、BR2、BR3、BR4和/或BR5的洗脱液；和

[0032] （5）将洗脱液干燥后，与亚麻酸酰基乙醇胺混合，以及与药物上可接受的载体或保健品上可接受的载体混合。

[0033] BR6、BR1、BR2、BR3、BR4和/或BR5等天然芸苔素内酯类似物可以通过本发明的具体实施方式所述的提取方法依次洗脱，其鉴定图谱分别如图2~7所示。

[0034] 在本发明第三方面的方法中，在步骤（1）中，可以使用100%（V/V）乙醇水溶液（即，纯乙醇），但优选乙醇水溶液的浓度为85~98%（V/V），优选为90~97%（V/V），更优选为93~96%（V/V），最优选为95%（V/V）。

[0035] 在本发明第三方面的方法中，在步骤（1）中，破碎油菜花粉的方式一般是用物理破碎方式，包括超声破碎、碾磨破碎等。

[0036] 在本发明第三方面的方法中，在步骤（1）中，油菜花粉和乙醇水溶液的比例可以优化，比例过低，将使用过量乙醇，需要更高成本的浓缩；比例过高，则提取不充分。经本发明人研究，优选在步骤（1）中，油菜花粉：乙醇水溶液的重量体积比为50~200克：200~500mL，优选为80~150克：250~450mL，更优选为90~120克：280~350mL，最优选为100克：300mL。

[0037] 在步骤（1）中，为了提取完全，可以对提取后的滤渣进一步提取，并如此反复提取滤渣，合并滤液。因此优选在本发明第三方面的方法中，步骤（1）进一步包括，固液分离后得到的滤渣用80~100%（V/V）乙醇水溶液提取，然后进行固液分离，保留滤液并与步骤（1）中获得的滤液合并。该步骤可以步骤（1）的其他提取步骤采用相同的条件，而且该步骤固液分离后得到的滤渣可以进一步采用与该步骤相同的步骤提取0~5次，只要最后将所有滤液合并即可。

[0038] 在步骤（1）中，滤液或者合并的滤液，体积过大，则不利于以后步骤的萃取效率。因此优选在本发明第三方面的方法中，在步骤（1）中，滤液进一步浓缩。浓缩是减压干燥浓缩，优选为以65~80℃和0.08~0.09Mpa的真空度干燥浓缩，最优选为以75℃和0.085Mpa的真空度干燥浓缩。浓缩后，优选醇溶性提取液：步骤（2）中的乙醇水溶液的体积比为0.5~2：1~3，优选为0.8~1.5：1.5~2.5，最优选为1：2。

[0039] 在本发明第三方面的方法中，在步骤（2）中，可以使用0%（V/V）乙醇水溶液（即，纯水），但优选乙醇水溶液的浓度为30~55%（V/V），优选为40~53%（V/V），更优选为45~52%（V/V），最优选为50%（V/V）。

[0040] 在本发明第三方面的方法中，在步骤（2）中，加入的乙酸乙酯的量可以优化。经本发明人研究，优选在步骤（2）中，乙醇水溶液：乙酸乙酯的体积比为1~3：3~8，优选为1.5~2.5：4~6，最优选为2：5。

[0041] 为了萃取完全，可以对萃取后的非乙酸乙酯层（即，分离了乙酸乙酯层后剩余的层）进一步提取，并如此反复萃取非乙酸乙酯层，合并乙酸乙酯层。因此优选在本发明第三方面的方法中，步骤（2）进一步包括，萃取后得到的非乙酸乙酯层加入乙酸乙酯萃取，保留乙酸乙酯层并与步骤（2）中获得的乙酸乙酯层合并。萃取可以进行1~8次，优选为2~5次。

[0042] 优选在本发明第三方面的方法中，在步骤（2）中，酯酶，也称脂肪酶，能水解甘油三酯或脂肪酸脂产生单或双甘油酯和游离脂肪酸。这样的酶本身已经在食品领域广泛应用。脂肪酶优选是提取自细菌的酯酶，如可以是能够从市场购买获取的脂肪酶，也可以是直接从细菌（如，荧光假单胞菌，优选是CGMCC No.1.867（即AS 1.867）菌株）中提取的酯酶（如参见中国专利申请200810046182.0）。

[0043] 优选在本发明第三方面的方法中，在步骤（2）中，糖化酶，也称葡萄糖淀粉酶，能将淀粉链转化为葡萄糖。这样的酶本身已经在酿造领域广泛应用。糖化酶优选是提取自真菌的糖化酶，如可以是能够从市场购买获取的糖化酶，也可以是直接从真菌（如黑曲霉）中提取的糖化酶。

[0044] 在本文中，“不完全反应”指的是使酶反应的底物在全部转化前终止反应，由此保持天然芸苔素内酯类似物的多样性。通常完全反应要进行3小时以上，因此优选在本发明第三方面的方法中，在步骤（2）中，不完全反应是在35~42℃反应0.5~2小时，优选是在37~41℃反应0.75~1.5小时，最优选在40℃反应1小时。

[0045] 优选在本发明第三方面的方法中，在步骤（2）中，干燥是减压干燥，优选为以65~80℃和0.08~0.09Mpa的真空度干燥，最优选为以75℃和0.085Mpa的真空度干燥。

[0046] 本发明人发现，初步的提纯以硅胶色谱柱为宜，只需要根据洗脱速度来设置收集的起始和终止时间即可全面收集多种天然芸苔素内酯类似物，简便易行。优选在本发明第三方面的方法中，在步骤（3）中，硅胶色谱柱中的填料是200~300目硅胶，最优选是300目硅胶。

[0047] 在步骤（3）中，潜在可以选择的洗脱液种类繁多，经本发明人研究，发现用甲醇和乙酸乙酯的混和液洗脱，产物较稳定。优选在本发明第三方面的方法中，在步骤（3）中，混和液中甲醇：乙酸乙酯的体积比为3~8：0.5~1.5，优选为4~7：0.8~1.3，最优选为5:1。

[0048] 优选在本发明第三方面的方法中，在步骤（3）中，干燥是减压干燥，优选为以65~80℃和0.08~0.09Mpa的真空度干燥，最优选为以75℃和0.085Mpa的真空度干燥。

[0049] 在步骤（4）中，潜在可以选择的洗脱液种类繁多，经本发明人研究，发现用乙腈和水的混和液洗脱，可以有效分离各种天然芸苔素内酯类似物。优选在本发明第三方面的方法中，在步骤（4）中，混和液中乙腈：水的体积比为60~90：10~40，优选为70~80：20~30，最优选为75:25。

[0050] 用本发明第三方面的方法中的步骤提取得到的天然芸苔素内酯类似物是高纯度的。优选在本发明第三方面的方法中，在步骤（4）中，如式BR6、BR1、BR2、BR3、BR4和/或BR5所示的天然芸苔素内酯类似物的纯度大于90%，优选大于95%，更优选大于98%，最优选大于99%。

[0051] 本发明取得的优异效果在于，一次提取，最终可以收集到多种分离的高纯度的天然芸苔素内酯类似物，因而摊薄了成本；提取（纯化）流程稳定，多种分离的天然芸苔素内酯类似物可以单独施用，也可以配比混和施用，产品质量稳定而容易控制，达到人用药物或保健品的要求；突破现有技术中芸苔素用于植物的限制，拓宽了其更高附加值的用途，能够用于治疗或预防哺乳动物疾病，尤其是前列腺（增生）疾病，或者能够用于改善哺乳动物状况，尤其是前列腺（增生）状况；天然芸苔素内酯类似物和亚麻酸酰基乙醇胺协同增效，不但提高了效果，可以降低给药量，更可以使得原来不具备成药价值的天然芸苔素内酯类似物（如，BR5）也能具有联合成药的价值。

[0052] 为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。另外，本发明引用了现有技术文献，这些文献也是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本发明进行参考，就好像它们的全文已经在本发明说明书中重复叙述过一样。

附图说明

[0053] 图1显示了天然芸苔素内酯类似物的纯化图谱。

[0054] 图2~7显示了各天然芸苔素内酯类似物的质谱鉴定图谱，其中，BR1的质谱图谱如图2所示，BR2的如图3所示，BR3的如图4所示，BR4的如图5所示，BR5的如图6所示，BR6的如图7所示。

[0055] 图8~13显示了各天然芸苔素内酯类似物的结构式，其中BR1如图8所示，BR2如图9所示，BR3如图10所示，BR4如图11所示，BR5如图12所示，BR6如图13所示。

[0056] 图14显示了亚麻酸酰基乙醇胺的结构式。

具体实施方式

[0057] 实施例1 天然芸苔素内酯类似物的提取和鉴定

[0058] 取油菜花粉100克，加入95%（V/V）乙醇300mL，超声破碎，过滤，保留滤液；滤渣加入95%（V/V）乙醇300mL，超声破碎，过滤，保留滤液。合并滤液，于75℃、0.085Mpa的真空度干燥浓缩至体积为100mL，得花粉醇提液。

[0059] 将50%（V/V）乙醇200mL加到花粉醇提液中，混合均匀，然后加入500mL乙酸乙酯萃取，保留上层（乙酸乙酯层）；下层继续加入500mL乙酸乙酯萃取，保留上层（乙酸乙酯层）。合并乙酸乙酯层，加入300mL浓缩酶液（2500U/L；参见中国专利申请200810046182.0）于40℃搅拌（45rpm）处理1小时，然后于75℃、0.085Mpa的真空度干燥，得酯溶性提取物。

[0060] 取酯溶性提取物上样于硅胶色谱柱（2.6cm×40cm，300目硅胶），加流动相（即，甲醇和乙酸乙酯的混和液，甲醇：乙酸乙酯的体积比为5:1）洗脱，控制流速为4ml/分钟，收集第40分钟至第150分钟流出的洗脱液，合并后于75℃、0.085Mpa的真空度干燥完全，溶解于10mL甲醇中，得硅胶柱纯化液。

[0061] 然后，将硅胶柱纯化液上样于C18反相色谱柱（柱参数为50mm×25cm ，5μm），加流动相（即，乙腈和水的混和液，乙腈：水的体积比为75:25）洗脱，控制流速为10ml/min，洗脱图谱如图1所示，其中标明了各天然芸苔素内酯类似物的峰及其洗脱时间，可以在各洗脱时间分别收集相应的天然芸苔素内酯类似物（BR6、BR1、BR2、BR3、BR4、BR5）。上述提取流程的稳定性好，综合效率高，能够一次获得上述6种天然芸苔素内酯类似物。

[0062] 收集天然芸苔素内酯类似物BR1、BR2、BR3、BR4、BR5和BR6，用高分辨率质谱验证（BR1的质谱图谱如图2所示，BR2的如图3所示，BR3的如图4所示，BR4的如图5所示，BR5的如图6所示，BR6的如图7所示）正确，各类似物纯度均高于99%，然后委托四川大学分析测试中心根据标准方法（质谱分析（GB/T 6041-2002）、红外光谱分析（GB/T6040-2002）、超导脉冲傅里叶变换核磁共振谱（JY/T 007-1996）和分子吸收分光光度分析（GB/T 9721-2006））进行测试，解析出各天然芸苔素内酯类似物的化学结构，其中BR1如图8所示，BR2如图9所示，BR3如图10所示，BR4如图11所示，BR5如图12所示，BR6如图13所示。

[0063] 另外将上述提纯的化合物混和成芸苔素类似物（简称为“BR混”或“BR混合物”；其中BR1：BR2：BR3：BR4：BR5和BR6的重量比为0.4：0.4：0.4：0.4：0.4：98）[0064] 实施例2 动物安全性测试

[0065] 分别取实施例1制备的天然芸苔素内酯类似物BR1、BR2、BR3、BR4、BR5和BR6，以及BR混合物，分别用少量的无水乙醇溶解，然后加蒸馏水稀释至药物浓度为：0.005mg/mL，其中无水乙醇体积浓度为：0.0125%；另外取少量无水乙醇用蒸馏水配制成体积浓度为0.0125%的乙醇水溶液作为对照。

[0066] 用购自成都达硕生物科技有限公司的SPF级NIH同日龄断乳小鼠（雌雄各半）和SPF级同日龄SD幼年大鼠（雌雄各半）进行试验。试验过程为：将小鼠或大鼠随机分成8组（其中BR单体6组，BR混合物1组，空白对照1组），每组10只，雌雄各半，BR各组以0.1mg/kg灌胃，空白对照组每日灌胃等体积的上述乙醇水溶液1次，每周3次，共给药4周，期间称量体重并观察动物生理状态。试验期间，动物均自由摄食SPF级大、小鼠通用普通辐照饲料及饮用纯水。

[0067] 表1  小鼠体重变化结果（  ,n=10）

[0068]

[0069] 表2  大鼠体重变化结果（ ,n=10）

[0070]

[0071] 结果如表1和2所示，在各个测量时间点下，各观察组间大、小鼠体重（变化）均无显著差异，另外也没有观察到BR各组的动物相对于空白对照组的有异常生理情况出现，表明BR单体6组和BR混合物对动物使用是安全的。

[0072] 实施例3 抗前列腺增生实验

[0073] 分别取实施例1制备的天然芸苔素内酯类似物BR1、BR2、BR3、BR4、BR5和BR6，分别用少量的无水乙醇溶解，然后加蒸馏水稀释至药物浓度为：0.005mg/mL，其中无水乙醇体积浓度为：0.0125%；

[0074] 取亚麻酸酰基乙醇胺（可购自北京盛科博源生物科技有限公司，药物原料药），用加蒸馏水稀释至药物浓度为：0.005mg/mL；

[0075] 取少量无水乙醇用蒸馏水配制成体积浓度为0.0125%的乙醇水溶液作为空白对照；

[0076] 用购自成都达硕生物科技有限公司的SPF级NIH雄性小鼠（购入体重18-22g）进行试验，试验期间，动物均自由摄食SPF级小鼠通用普通辐照饲料及饮用纯水。

[0077] 试验过程为：

[0078] 随机选取6只小鼠作为造模对照组，不注射药物，而只以蒸馏水皮下注射（10mL/Kg），1次/天，共计3周；余下动物均进行造模，随机分笼饲养并以丙酸睾酮皮下注射造模（5mg/Kg），1次/天，共计3周。末次造模给药后24小时，于造模的动物中随机选取6只与造模对照组，分别称重后处死，取前列腺称湿重，计算两组的前列腺指数（前列腺指数=前列腺湿重(mg)／小鼠体重(g)）。结果显示，造模的小鼠前列腺指数(mg/g)为0.90±0.29，显著高于造模对照组（其前列腺指数(mg/g)为0.57±0.17）。这表明，造模的动物发生了前列腺增生。

[0079] 然后，将余下的98只成功造模的小鼠随机分成8组（其中BR单体6组，亚麻酸酰基乙醇胺1组，BR和亚麻酸酰基乙醇胺联合给药6组，空白对照1组），联合给药组和亚麻酸酰基乙醇胺组每组4只，其余每组10只，BR各样品组以0.1mg/kg每日灌胃1次，空白对照组每日灌胃等体积作为空白对照的乙醇水溶液1次，亚麻酸酰基乙醇胺组以0.05mg/kg每日灌胃1次，各联合给药组分别每日灌胃给药0.1mg/kg的相应BR和0.05mg/kg亚麻酸酰基乙醇胺，共给药20日。于末次给药24小时后称重并处死小鼠，取前列腺称湿重，计算前列腺指数以及前列腺增生的抑制率。

[0080] 表3  前列腺增生小鼠用药后的前列腺指数 单独给药组 BR1组 BR2组 BR3组 BR4组 BR6组 BR5组 亚麻酸酰基乙醇胺组 空白组 造模对照组小鼠前列腺指数(mg/g) 0.70 0.68 0.56 0.70 0.67 0.82 0.85 0.87 0.57
前列腺增生抑制率（%） 57 63 103 57 67 17 6.7 0 100
与亚麻酸酰基乙醇胺联合给药组 BR1组 BR2组 BR3组 BR4组 BR6组 BR5组      小鼠前列腺指数(mg/g) 0.65 0.65 0.58 0.62 0.58 0.73      
前列腺增生抑制率（%） 73 73 97 83 97 47      

[0081] 结果显示，对于单独给药，前列腺增生造模成功的小鼠经BR1、BR2、BR3、BR4和BR6分别治疗，都能够降低前列腺指数，用于治疗前列腺增生，其中尤其以BR3效果最好，而BR5单独的效果较弱，没有实际药用价值，亚麻酸酰基乙醇胺单独则几乎没有抑制前列腺增生的效果；对于联合亚麻酸酰基乙醇胺给药，BR1、BR2、BR3、BR4、BR5和BR6分别治疗，都能够降低前列腺指数，用于治疗前列腺增生，其中亚麻酸酰基乙醇胺与BR1、BR2、BR4、BR5和BR6联合给药，都能够协同抑制前列腺增生，尤其是BR6和BR5的协同效应最明显，BR3由于单独用药效果已经达到效果极限，所以预计与亚麻酸酰基乙醇胺联用，能在不影响极限药效的情况下可以降低它们的用量。