利用自组装实现荧光增强的荧光聚合物的制备方法

摘要

本发明属于功能材料技术领域，具体公开了一类利用自组装实现荧光增强的荧光聚合物的制备方法，包括(1)加入溴活化烷氧醚树形分子、绿色荧光蛋白生色团、碘化钾和碳酸钾，于丙酮中溶解，经回流搅拌、水洗、过洗脱柱，得到生色团修饰的烷氧醚树形分子；(2)将所述生色团修饰的烷氧醚树形分子进行聚合反应，得到所述利用自组装实现荧光增强的荧光聚合物。本发明合成的聚合物安全低毒，生物相容性好，经自组装形成组装体后荧光增强明显。

权利要求

1.一种利用自组装实现荧光增强的荧光聚合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)加入溴活化烷氧醚树形分子、绿色荧光蛋白生色团、碘化钾和碳酸钾，于丙酮中溶解，经回流搅拌、水洗、过洗脱柱，得到生色团修饰的烷氧醚树形分子；

(2)将所述生色团修饰的烷氧醚树形分子进行聚合反应，得到所述利用自组装实现荧光增强的荧光聚合物；

其中，所述溴活化烷氧醚树形分子的结构式如以下式(1)所示

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚合反应是将所述生色团修饰的烷氧醚树形分子溶于有机溶剂中，加入疏水性单体，升温至100～120℃，反应24h，开环聚合得到两亲性荧光聚合物。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将所述生色团修饰的烷氧醚树形分子与2-氯丙酸在二环己基碳二亚胺/4-二甲氨基吡啶催化下反应，过滤、过洗脱柱，得到所述氯代生色团烷氧醚树形分子；将氯代生色团烷氧醚树形分子作为引发剂，通过原子转移自由基聚合法，引发异丙基丙烯酰胺单体聚合，得到温敏型荧光聚合物。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂包括甲苯、二甲亚砜、二甲基甲酰胺；所述疏水性单体为己内酯或丙交酯。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述开环聚合反应中以辛酸亚锡或三乙基铝为引发剂，在氮气氛围下聚合反应。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述原子转移自由基聚合反应中以氯代生色团烷氧醚树形分子为引发剂，以异丙醇或者二氧六环作为溶剂，采用氯化亚铜和三(2-二甲氨基乙基)胺为催化体系，加入异丙基丙烯酰胺单体，氮气保护下于45℃下反应

24h。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述绿色荧光蛋白生色团为羟苯亚甲基咪唑啉酮荧光生色团。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述回流温度为55～

65℃，搅拌30h。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述过洗脱柱中洗脱剂为二氯甲烷与甲醇，且二氯甲烷和甲醇体积比例为20:1。

说明书

利用自组装实现荧光增强的荧光聚合物的制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于功能材料技术领域，具体涉及一种利用自组装实现荧光增强的荧光聚合物及其制备方法。

背景技术

[0002] 荧光检测技术具有高度的灵敏性、快速响应性、无破坏性和极宽的动态响应范围，已广泛应用分子和细胞生物学、分析化学和生物检测等个个方面。在实际应用中，小分子荧光化合物有其使用的局限性：第一，当小分子溶于待测溶液中，形成稳定均相体系后，容易产生污染；第二，在待检测体系中加入小分子荧光化合物后，提取分离困难，一般很难重复使用；第三，部分小分子荧光化合物水溶性差，有较强的毒副作用，使其在生物医药领域的使用受到限制；第四，小分子荧光化合物不易与仪器结合使用，使其检测灵敏度不高。

[0003] 荧光聚合物是把小分子荧光化合物通过一系列方式引入到聚合物中，如引入到聚合物侧链、链端或者直接通过荧光功能单体聚合制备。对荧光聚合物的研究主要集中在医学、化学、材料科学等学科。在医学和生命学科中主要研究一些具有良好水溶性的荧光聚合物，荧光聚合物在使用中不仅可以克服小分子荧光化合物在使用上的局限，还能展现出自身的优势。而模拟绿色荧光蛋白生物发光过程的荧光聚合物，更具实际意义。

[0004] 一般的荧光聚合物通常含有大的共轭体系使其不溶于水，为了获得水溶性，普遍的方式是通过化学修饰把这类聚合物制备成聚电解质。而聚电解质会与生物大分子作用，影响检测结果。近年来发展了无机量子点作为荧光探针，使用镉、碲、砷等元素，生物毒性大，必须经过大量修饰工作，方能使用，而且其在体内降解机理目前尚不清楚。通过对自然规律的学习研究，充分利用荧光基团，开发出生物相容性好、生物毒性低，而检测灵敏度高、水溶性好的荧光聚合物，具有十分重要的研究和应用价值。

[0005] 绿色荧光蛋白以其独特和优异的光学性能，使其被发现便广泛应用于分子和细胞生物学。从化学角度来说，其实际是一个高分子化合物，由氨基酸脱水制得；而其由低级结构转变成筒状高级结构可以看作是聚合物组装的过程。在低级结构下，生色团可以自由旋转，绿色荧光蛋白荧光十分微弱；而在筒状高级结构下，产生荧光的生色团自由旋转受阻，绿色荧光蛋白可以发出优异的荧光。中国专利CN102675556采用聚乙二醇修饰的羟苯亚甲基咪唑啉酮荧光生色团，制备得到的聚合物组装后展现出了较好的荧光，但是发射波长和细胞背景荧光(395～479nm)重合，表现效果不佳。

发明内容

[0006] 针对现有的荧光聚合物及其制备方法的不足，本发明基于天然荧光蛋白发光的原理，提出一类利用自组装实现荧光增强的荧光聚合物。本发明中，以生色团修饰的烷氧醚分子及其衍生物为引发剂，引发聚合反应，制备得到的荧光聚合物进一步自组装，形成紧密组装体，从而限制生色团自由旋转，达到荧光增强的目的。

[0007] 根据本发明的第一个方面，本发明所制备的两亲性聚合物，在水中自组装后会形成结构紧密的纳米粒子，从而达到限制生色团的自由旋转，增强荧光。

[0008] 根据本发明的另一个方面，本发明所制备的温敏型聚合物，在低温下溶于水，高于一定温度后在水中自组装，亦会形成结构紧密的纳米粒子，达到荧光显著增强的效果。

[0009] 为实现上述目的，本发明所提出的技术方案是：一种利用自组装实现荧光增强的荧光聚合物制备方法，包括以下步骤：

[0010] (1)在烧瓶中加入溴活化烷氧醚树形分子、绿色荧光蛋白生色团、碘化钾和碳酸钾，于适量丙酮中使其溶解，回流搅拌、水洗、过洗脱柱，得到生色团修饰的烷氧醚树形分子；

[0011] (2)将该生色团修饰的烷氧醚树形分子进行聚合反应，得到所述利用自组装实现荧光增强的荧光聚合物，其能模拟绿色荧光蛋白发光。

[0012] 本发明制备方法中，所述的溴活化烷氧醚树形分子的结构式如以下式(1)所示：

[0013]

[0014] 本发明制备方法中，步骤(2)中的聚合反应过程为：将生色团修饰的烷氧醚树形分子溶于有机溶剂中，加入疏水性单体，升温至100～120℃，反应24h，开环聚合制得两亲性荧光聚合物。其中，有机溶剂包括甲苯、二甲亚砜、二甲基甲酰胺；所述疏水性单体为己内酯或丙交酯。所述开环聚合反应中以辛酸亚锡或三乙基铝为引发剂，在氮气氛围下聚合反应。

[0015] 或者，本发明制备方法中，步骤(2)中的聚合反应过程为：将氯代生色团烷氧醚树形分子作为引发剂，引发异丙基丙烯酰胺单体的原子转移自由基聚合，得到温敏型荧光聚合物。

[0016] 其中，氯代生色团烷氧醚树形分子是生色团修饰的烷氧醚分子衍生物。氯代生色团烷氧醚树形分子通过以下方式制备：将生色团修饰的烷氧醚树形分子与2-氯丙酸在二环己基碳二亚胺／4-二甲氨基吡啶催化下反应，过滤、过洗脱柱，制得氯代生色团烷氧醚树形分子引发剂。

[0017] 其中，所述原子转移自由基聚合反应中以氯代生色团烷氧醚树形分子为引发剂，以异丙醇或者二氧六环作为溶剂，采用氯化亚铜和三(2-二甲氨基乙基)胺为催化体系，加入异丙基丙烯酰胺单体，氮气保护下于45℃下反应24h。

[0018] 本发明制备方法中，步骤(1)中，所述绿色荧光蛋白生色团为羟苯亚甲基咪唑啉酮荧光生色团。

[0019] 本发明制备方法中，步骤(1)中，所述回流温度为55～65℃，搅拌30h。

[0020] 本发明制备方法中，在步骤(1)中，所述过洗脱柱中洗脱剂为二氯甲烷与甲醇，且二氯甲烷和甲醇体积比例为20∶1。

[0021] 本发明根据绿色荧光蛋白生物大分子自组装的原理，使用羟苯亚甲基咪唑啉酮作为荧光生色团，得到一类利用自组装实现荧光增强的聚合物，其通过聚合物的自组装来模拟绿色荧光蛋白的荧光增强。该类聚合物为荧光生色团一端连接亲水的烷氧醚树形分子，另一端连接疏水的聚酯或温敏聚合物而形成的，具有结构新颖，制备简单，产品纯化简便等优点。

[0022] 其中，聚酯聚合物是指ε-己内酯或丙交酯聚酯，生物相容性好，不溶于水。以ε-己内酯为例，聚合物通式如以下式(2)所示：

[0023]

[0024] 其中，温敏聚合物是指聚(N-异丙基丙烯酰胺)，为温敏型聚合物，聚合物通式如以下式(3)所示：

[0025]

[0026] 本发明制备的利用自组装实现荧光增强的聚合物包括两亲性荧光聚合物、温敏型荧光聚合物，在制备中均为以生色团修饰的烷氧醚分子及其衍生物为引发剂，引发聚合，得到的荧光聚合物在结构上均为一端为烷氧醚树形分子(如以下(式1’)所示)，另一端为聚酯链段(聚己内酯或聚丙交酯聚酯)或温敏链段(聚异丙基丙烯酰胺)。两亲性荧光聚合物、温敏型荧光聚合物均是通过自组装实现荧光增强的效果。

[0027]

[0028] 本发明制备得到的利用自组装实现荧光增强的荧光聚合物安全低毒、生物相容性好，形成组装体后荧光增强明显，荧光发射波长在主峰在430nm左右，500nm左右处有肩峰，可作为载体，应用于生物医药领域。

[0029] 本发明与现有技术相比具有的有益效果包括：

[0030] 本发明所合成的两亲性荧光聚合物，结构独特，生物相容性好，生物毒性低，能够克服无机半导体量子点生物毒性大的缺点。而且该两亲性荧光聚合物自组装后，表现出优异的荧光性能增强，发射波长不与细胞背景荧光(395～479nm)重合。

[0031] 本发明所合成温敏型荧光聚合物，使用的是异丙基丙烯酰胺和烷氧醚树形分子，低温下该聚合物易溶于水，在高于一定温度后会自组装，使聚合物表现较好的荧光性能。而且该聚合物在较高浓度下，在较低温度下也会聚集，表现出荧光性能。

[0032] 本发明制备的荧光聚合物能通过自组装来模拟绿色荧光蛋白发光，表现出了更好的使用范围和更优异的光学性能。本发明根据绿色荧光蛋白生物大分子自组装的原理，使用羟苯亚甲基咪唑啉酮作为荧光生色团，提出一类新的聚合物，其中通过聚合物自组装形成紧密结构的纳米粒子，来限制生色团的自由旋转，实现增强荧光效果。本发明制备荧光聚合物的方法，不限于聚合物本身结构，制备得到的产物均能模拟绿色荧光蛋白的荧光增强。

附图说明

[0033] 图1为实施例1制备的荧光聚合物核磁氢谱；

[0034] 图2为实施例1制备的荧光聚合物荧光图谱：(a)生色团在水中的荧光发射图谱，(b)为荧光聚合物在水中组装后的荧光发射图谱；

[0035] 图3为实施例2制备的荧光聚合物核磁氢谱。

具体实施方式

[0036] 结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

[0037] 实施例1

[0038] 步骤1)：在一个干燥的100mL三口烧瓶中加入0.32g荧光生色团、2.04g溴活化烷氧醚树形分子、1.20g碳酸钾和0.12g碘化钾，然后加入25mL丙酮溶解，60℃下恒温回流30小时。冷却至室温，过滤除去碳酸钾和碘化钾，使用旋转蒸发仪旋干丙酮。再用二氯甲烷溶解，使用饱和食盐水水洗两次，合并有机相，无水硫酸镁干燥。之后过洗脱柱，洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇体积比=20∶1，除去洗脱剂得到生色团修饰的烷氧醚树形分子。

[0039] 步骤2)：向反应试管中加入251mg生色团修饰的烷氧醚树形分子、456mgε-己内酯，再加入1.6mg辛酸亚锡催化剂，氮气保护下，在110℃下反应24小时。停止反应，二氯甲烷溶解，甲醇中沉淀，重复三次，得到两亲性的荧光聚合物产品。其中，本发明在100-120℃温度范围下反应，得到相近结果。

[0040] 本实施例中将所合成的荧光聚合物产品通过一维核磁氢谱、凝胶渗透色谱、傅里叶变换红外光谱、紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱测试其结构和光学性质。其中，图1所示为一维核磁氢谱用于验证其结构，如图2所示为荧光增强效果。采用丙交酯以相同方式进行聚合反应，得到一致的结果。

[0041] 图1为实施例1所制备的荧光聚合物一维核磁氢谱。其中，生色团的特征峰出现在8.10，7.07，6，99和2.41ppm；烷氧醚树状分子特征峰出现在6.67和6.56ppm，且比例为1∶3。聚己内酯的特征峰分别出现在4.06，2.30，1.65和1.40ppm，积分比例为2∶2∶4∶2。根据检测谱图所示结果，确定本实施例制备得到的即是本发明两亲性的荧光聚合物。

[0042] 图2为实施例1的荧光聚合物荧光发色图谱，其中(a)所示为生色团在水中的荧光发射图谱，(b)为荧光聚合物在水中组装后的荧光发射图谱。组装后的聚合物的荧光强度是单独生色团的33倍，而且发射波长范围更宽，不受细胞背景荧光干扰。

[0043] 以上实验结果表明，本发明两亲性荧光聚合物能很好地模拟绿色荧光蛋白的发光过程，相对于现有的荧光聚合物，本方法得到的聚合物具有更进步的荧光效果。

[0044] 实施例2

[0045] 步骤1)：按实施例1的方法制备得到生色团修饰的烷氧醚树形分子。

[0046] 步骤2)：将250mg生色团修饰的烷氧醚树形分子、120mg2-氯丙酸和15mg4-二甲氨基吡啶，溶于5mL二氯甲烷中，冰水浴中滴加227mg二环己基碳二亚胺2mL二氯甲烷溶液，室温反应48小时。停止反应，过洗脱柱，洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇15∶1，得到氯代生色团烷氧醚树形分子引发剂。

[0047] 步骤3)：将0.93g异丙基丙烯酰胺单体溶于1mL异丙醇中，再向该体系中加入0.107g氯化亚铜和36μL三(2-二甲氨基乙基)胺的异丙醇溶液催化体系1.5mL，氮气保护下，在45℃下反应24小时。停止反应，二氯甲烷中溶解，乙醚中沉淀，重复三次，得到温敏型荧光聚合物。

[0048] 本实施例中将所合成的荧光聚合物产品通过一维核磁氢谱、凝胶渗透色谱、傅里叶变换红外光谱、紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱测试其结构和光学性质。其中，图3所示为本实施例制备的温敏型荧光聚合物的一维核磁氢谱。

[0049] 本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。