一种用于鉴定云南元江普通野生稻细胞质雄性不育系的恢复系的分子标记及专用引物

摘要

本发明公开了一种用于鉴定云南元江普通野生稻细胞质雄性不育系的恢复系的分子标记及专用引物。本发明的用于辅助鉴别云南元江普通野生稻细胞质雄性不育系的恢复系的引物对，一个引物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，另一个引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示。本发明的方法及专用引物和分子标记可用于云南元江普通野生稻胞质不育系的恢复系的选育，缩短含云南元江普通野生稻优质种质资源的三系杂交水稻的育种周期，加快育种速度，降低育种成本，具有操作简单，成本低廉，周期短的优点，适于推广应用，为选育具有云南元江普通野生稻遗传背景的恢复系提供了一种快捷的选择方法。

权利要求

1.一种用于辅助鉴别云南元江普通野生稻细胞质雄性不育系的恢复系的引物对，一个引物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，另一个引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

2.一种用于辅助鉴别云南元江普通野生稻细胞质雄性不育系的恢复系的分子标记，是用权利要求1所述引物对PCR扩增云南元江普通野生稻得到的PCR产物。

3.一种辅助鉴别云南元江普通野生稻细胞质雄性不育系的恢复系的方法，包括如下步骤：分别以云南元江普通野生稻和待测水稻品种的基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，若所述待测水稻品种的PCR扩增产物大小与所述云南元江普通野生稻的PCR扩增产物大小一致，则所述待测水稻品种候选为云南元江普通野生稻细胞质雄性不育系的恢复系。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增产物大小是通过琼脂糖凝胶电泳检测确定的。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增产物大小为100bp。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增产物大小为100bp。

7.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于：所述云南元江普通野生稻细胞质雄性不育系是以栽培稻93-11为遗传背景、以云南元江普通野生稻为供体、高代回交得到的。

8.根据权利要求2所述的分子标记，其特征在于：所述云南元江普通野生稻细胞质雄性不育系是以栽培稻93-11为遗传背景、以云南元江普通野生稻为供体、高代回交得到的。

9.根据权利要求3-6任一项所述的方法，其特征在于：所述云南元江普通野生稻细胞质雄性不育系是以栽培稻93-11为遗传背景、以云南元江普通野生稻为供体、高代回交得到的。

说明书

一种用于鉴定云南元江普通野生稻细胞质雄性不育系的恢

复系的分子标记及专用引物

技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于鉴定云南元江普通野生稻细胞质雄性不育系的恢复系的分子标记及专用引物。

背景技术

[0002] 水稻是世界上最主要的粮食作物之一，提高水稻单产是保障世界粮食安全的有力措施之一。在作物长期的进化过程中，由于育种家根据需要选择目标性状并对其进行定向培育及亲本的重复使用，使得品种遗传基础狭窄。目前，约占水稻种植面积的一半以上的杂交水稻，所使用的杂交组合95%以上是由野败型或与野败型相类似的细胞质雄性不育系组配而成的,长期使用单一来源细胞质,可能出现遗传脆弱性的危险。

[0003] 野生稻既是研究稻作起源、分类、演化的重要实物依据，又是栽培稻育种的宝贵种质资源。野生稻也是天然的基因库，保存有栽培稻没有或已消失了的遗传基因，并具有特殊优良农艺性状，如雄性不育性、高产、优质、抗逆性等。由于所处生态环境的复杂性在其漫长的进化过程中，形成了极其丰富的遗传多样性。Sun et al（2001）研究发现在检测的44个RFLP位点中，栽培稻的等位基因数约为野生稻的60%，并提出：野生稻在演化成栽培稻的过程中，等位基因减少，基因多样性下降，一些基因已在栽培稻中丢失（Sun C Q，Wang X K，LiZ C，Yoshimura A.Comparison of the genetic diversity of common wild rice(Oryza rufipogon Griff.)and cultivated rice (O.sativaL.)using RFLP markers.Theor Appl Genet，2001，102:157-162）。因此，研究如何从野生稻中挖掘优异基因，并把它们应用于栽培稻育种生产，具有十分重要的理论意义和实践价值。

[0004] 植物的胞质雄性不育现象，在生产上作为一种遗传育种工具，在农作物杂种优势利用过程中省去人工去雄的麻烦，确保了杂交种子的纯度，具有巨大的生产价值。在天然的植物中，普遍存在细胞质雄性不育，这是植物系统进化趋势的必然产物，而且在自然条件下，恢复基因总是与细胞质雄性不育相伴随，这是不育细胞质在群体中保存和传递的前提，这种核质互作的恢保关系具有专一性，这也是细胞质雄性不育分类及发现新的细胞质雄性不育类型的主要依据。我国杂交稻生产中应用的雄性不育细胞质主要来源于普通野生稻，可以推测野生稻中也必然存在相应的恢复基因（李绍清等，2005），但用于生产上的恢复基因来源于野生稻的却很少。本研究利用可育的元江普通野生稻与93-11构建的高代回交群体，发现元江野生稻的细胞质中存在不育基因，细胞核存在恢复基因，该不育细胞质及其恢复基因的发现与定位，对丰富三系杂交稻不育细胞质和恢复基因的遗传多样性具有重要的理论意义和实用价值。

发明内容

[0005] 本发明的一个目的是提供一种用于辅助鉴别云南元江普通野生稻细胞质雄性不育系的恢复系的方法及其专用分子标记和专用引物。

[0006] 本发明所提供的用于辅助鉴别云南元江普通野生稻细胞质雄性不育系的恢复系的引物对，一个引物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，另一个引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

[0007] 本发明所提供的用于辅助鉴别云南元江普通野生稻细胞质雄性不育系的恢复系的分子标记，是用上述引物对PCR扩增云南元江普通野生稻得到的PCR产物。

[0008] 本发明所提供的辅助鉴别云南元江普通野生稻细胞质雄性不育系的恢复系的方法，包括如下步骤：分别以云南元江普通野生稻和待测水稻品种的基因组DNA为模板，用上述引物对进行PCR扩增，若所述待测水稻品种的PCR扩增产物大小与所述云南元江普通野生稻的PCR扩增产物大小一致，则所述待测水稻品种候选为云南元江普通野生稻细胞质雄性不育系的恢复系。

[0009] 上述方法中，所述PCR扩增产物大小可以通过琼脂糖凝胶电泳检测确定。

[0010] 上述方法中，通过琼脂糖凝胶电泳检测确定的PCR扩增产物大小为100bp。

[0011] 上述引物对、上述分子标记、上述方法中，所述云南元江普通野生稻细胞质雄性不育系是以栽培稻93-11为遗传背景、以云南元江普通野生稻为供体、高代回交得到的。

[0012] 具体的，上述云南元江普通野生稻细胞质雄性不育系是指“水稻的一个野栽渗入系的名称命名为元9A”。

[0013] 本发明的方法及专用引物和分子标记可用于云南元江普通野生稻胞质不育系的恢复系的选育，缩短含云南元江普通野生稻优质种质资源的三系杂交水稻的育种周期，加快育种速度，降低育种成本，具有操作简单，成本低廉，周期短的优点，适于推广应用，为选育具有云南元江普通野生稻遗传背景的恢复系提供了一种快捷的选择方法。

附图说明

[0014] 图1为元江野生稻，渗入系9YJ06，9311和元中9A的基因组DNA为模板，分别在引物489-5ac引导下的PCR扩增产物（分子标记）的带型（所用Marker为北京拓英坊科技有限公司的50bp DNA Ladder）。

[0015] 图2为以20个水稻品种的基因组DNA为模板，在引物489-5ac引导下的PCR扩增产物（所用Marker为北京拓英坊科技有限公司的50bp DNA Ladder）。

具体实施方式

[0016] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0017] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0018] 云南元江普通野生稻（Yuanjiang common wild rice）在文献（Tan LB,Li XR,Liu FX,Sun XY,Li CG，Zhu ZF,FuYC,Cai HW，Wang XK,Xie DX and Sun CQ.Control ofa key transition from prostrate to erect growth in rice domestication.Nature Genetics,2008,40(11):1360-1364）中公开，公众可以从中国农业大学获得。

[0019] 栽培稻93-11（93-11）在文献（Li XJ,Sun LJ,Tan LB,Liu FX,Zhu ZF,FuYC,Sun XY,Sun XW，Xie DX and Sun CQ.TH1,a DUF640domain-like gene controls lemma and palea development in rice Plant Mol Biol,2012,78:351–359）中公开，公众可以从中国农业大学获得。

[0020] 实施例1、专用引物及分子标记的发现

[0021] 本研究构建一个以栽培稻93-11为遗传背景，以云南元江普通野生稻为供体的高代回交群体BC6F1，并从群体中获得了一个云南元江普通野生稻细胞质的雄性不育系，命名为“元9A”，轮回亲本93-11是其保持系。这表明带有可育细胞质的93-11能保持元9A的育性，而带有不育细胞质的元江野生稻能恢复元9A的育性。将元9A在北京、海南和合肥三地种植，配套的恢复系、保持系和不育系确定元9A是细胞质雄性不育。

[0022] 对元9A的花粉进行I2-KI染色，发现元9A的花粉以典败为主，并能被多个恢复系所恢复。将该不育系与生产上常用的恢复系或保持系测交，发现野败型的恢复系（如IR24、明恢63等）和红莲型的保持系（粤泰B）可以恢复元9A的育性，元9A与恢复系的F2的小穗育性存在分离，而红莲型的恢复系（93-11和特青）却对元9A的育性起保持作用，表明元9A是属于孢子体不育类型，而不是配子体不育类型。同时，还发现元9A与野败恢复系测交的F2群体的小穗育性，可育株和不育株分离比例符合3:1，表明元9A的育性恢复受1对基因控制。

[0023] 根据元江野生稻和93-11的BC3F1群体472株的基因型，结合以花粉育性和套袋自交结实率为指标的表型分析结果，采用QTL定位的方法对恢复基因进行定位，在第10染色体RM171附近检测到1个QTL。利用元9A与中9B转育出野籼型不育系元中9A，并在元江野生稻C-21与9311的渗入系中找到具有恢复能力的渗入系材料9YJ06，通过元中9A和9YJ06构建F2和F3群体用作定位群体。将恢复基因定位在引物6R23与YN37之间。在此区间内依据日本晴序列，在日本晴和93-11间筛选存在基因组差异的区域并设计引物489-5ac，以其为引物，以元江野生稻、元中9A、93-11和9YJ06的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系为：水稻基因组DNA模板20ng，Taq Plus DNA聚合酶0.5U，2.0μl10×PCR2+
缓冲液(100mM Tris·Cl pH9.0，500mM KCl，15mM Mg ，1%Triton X-100)，100μM dNTPs，正向引物0.2μM，反向引物0.2μM，用DEPC水补充反应体系至20μl。PCR反应条件为：
先94℃5min；随后94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，共35个循环；再72℃10min。通过浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物中是否有目的条带。图1中，泳道1、2分别是以元中9A和9311的基因组DNA为模板，489-5ac为引物进行PCR扩增所得产物，产物大小约150bp；泳道3、4分别是以渗入系9YJ06和元江野生稻的基因组DNA为模板，489-5ac为引物进行PCR扩增所得产物，产物大小约100bp。由489-5ac得到的PCR扩增产物（分子标记）位于第10染色体上基因LOC_Os10g35300至LOC_Os10g35310的序列范围内，根据www.tigr.org提供的日本晴序列，此扩增产物大小约为100bp，与元江野生稻和渗入系中9YJ06的PCR产物大小相同，而元中9A中的PCR产物约150bp。检测结果表明上述引物在元江野生稻和元中9A中均有扩增产物，且在两个材料中扩增出的目的片段大小存在差异。

[0024] 表1.489-5ac引物的序列

[0025]引物名称 正向引物 反向引物
489-5ac AGTCGGTCATCGGAAAACG（序列1） AGTGGCGGAGCCAGTACTG（序列2）

[0026] 实施例2、489-5ac在元江野生稻和9YJ06中的扩增产物（分子标记）与群体的育性相关

[0027] 首先按照实施例1的方法对元中9A和9YJ06构建的F2和F3群体的育性进行表型观察，选取不育性单株组成定位群体，同时提取各不育单株的基因组DNA，以实施例1中引物489-5ac进行PCR扩增（PCR扩增反应和电泳条件同实施例1），以在元中9A和9YJ06中的扩增产物（分子标记）为Marker，检测各单株的带型，分析基因型，用T-Test方法分析基因型与不育性的关系。结果发现：引物489-5ac与育性存在极显著相关性（P≤0.01），如表2所示。

[0028] 表2.489-5ac的PCR产物与不育单株表型的相关性分析

[0029]分子标记 R Square Significance F
489-5ac的PCR产物 0.7259 0.0000

[0030] 实施例3、用引物489-5ac筛选元江野生稻恢复基因的可行性验证

[0031] 水稻品种（除元中9A外下述水稻品种均为来自国家种质资源库）：蜀恢527，明恢63，R6547，R507，绵恢501，辐恢838，桂99，CDR22，多系1号，芒6，中籼2503，地谷，万37B，K18B，K17B，金23B，协青早，珍汕97B，云南元江普通野生稻和元9A。将上述材料与元9A杂交，通过对F1花粉育性的观察和结实率判断材料与元9A的恢保关系，结果恢保关系如下表所示：

[0032] 表3.18个水稻品种与元9A的恢保关系

[0033]品种名称 与元9A的恢保关系
蜀恢527 恢复系
明恢63 恢复系
R6547 恢复系
R507 恢复系
绵恢501 恢复系
辐恢838 恢复系
桂99 恢复系
CDR22 恢复系
多系1号 恢复系
芒6 保持系
中籼2503 保持系
地谷 保持系
万37B 保持系
K18B 保持系
K17B 保持系
金23B 保持系
协青早 保持系
珍汕97B 保持系

[0034] 分别提取上述不同水稻品种的基因组DNA，在引物489-5ac的引导下进行PCR扩增。反应体系如下：水稻基因组DNA模板20ng，Taq Plus DNA聚合酶0.5U，2.0μl10×PCR2+
缓冲液(100mM Tris·Cl pH9.0，500mM KCl，15mM Mg ，1%Triton X-100)，100μM dNTPs，正向引物0.2μM，反向引物0.2μM，用DEPC水补充反应体系至20μl。PCR反应条件为：先
94℃5min；随后94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，共35个循环；再72℃10min。通过浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物中是否有目的条带。

[0035] 检测结果如图2所示（泳道19和20为元中9A和元江野生稻中的电泳结果；泳道1-9分别为在9个元9A的恢复系：蜀恢527，明恢63，R6547，R507，绵恢501，辐恢838，桂
99，CDR22，多系1号中的扩增产物电泳结果；泳道10-18分别为在9个元9A的保持系：芒
6，中籼2503，地谷，万37B，K18B，K17B，金23B，协青早，珍汕97B中的电泳结果）。

[0036] 结果表明，引物489-5ac在9个元9A的恢复系品种中，均扩增出与元江野生稻相同的带型，且条带大小在100bp左右；在9个元9A保持系的品种中，均能扩增出与元中9A相同的带型，且条带大小在150bp左右。可以看出489-5ac与恢复基因存在显著相关性，可用于筛选含有元江野生稻不育细胞质恢复基因的水稻品种。