细菌耐药基因NDM-1的PCR检测引物及试剂盒转让专利
申请号 : CN201310554556.0
文献号 : CN103882106B
文献日 : 2015-09-16
发明人 : 温肖会 , 翟少伦 , 魏文康 , 吕殿红 , 袁洁 , 黄忠 , 贾春玲 , 周秀蓉 , 曾琦雯
申请人 : 广东省农业科学院动物卫生研究所
摘要 :
本发明公开了一种细菌耐药基因NDM-1的PCR检测引物及包含此引物的检测试剂盒。为了调查养殖场中的耐药细菌是否携带NDM-1基因，设计基因NDM-1的特异性PCR引物，优化PCR反应体系和条件，获得敏感性、特异性、重复性较高的细菌耐药基因NDM-1 的PCR检测方法，该检测方法能检出的最低基因组DNA浓度为9.18×10-7μg/μL。本发明方法可作为畜禽养殖过程中携带耐药基因NDM-1细菌的早期诊断、快速筛查以及流行病学评估等手段，并可在当前兽医临床耐药细菌的监控防控中得到应用。
权利要求 :
1. 一种细菌耐药基因NDM-1的PCR检测引物，其核苷酸序列分别如下所示：NDM-1F: GGTTTGGCGATCTGGTTTTCC；
NDM-1R: TTGTCCTGATGCGCGTGAGTC。
2.一种细菌耐药基因NDM-1的PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含权利要求1所述的检测引物。
说明书 :
细菌耐药基因NDM-1的PCR检测引物及试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，涉及畜禽养殖业的检测方法，具体涉及一种耐药基因NDM-1的PCR检测引物及应用。
背景技术
[0002] 2010年8月11日，英国医学界宣称南亚出现了一种新型细菌，几乎对所有抗生素都有抗药性，被称为“超级细菌”。因首先在印度首都新德里出现又称为新德里金属-β-内酰胺酶（New Delhi metallo-β-lactamase-1，NDM-1）。NDM-1不是一种细菌，而是编码金属-β-内酰胺酶(metallo-β-lacta-mase，MBL)的一种基因。随后，在英国、美国、比利时、法国、日本、澳大利亚等全球大多数国家发生了携带NDM-1基因的肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、柠檬酸杆菌等细菌感染人并导致死亡病例，临床表现超级耐药现象。
[0003] 携带NDM-1基因的细菌会产生一种特殊的β-内酰胺酶，且活性部位为金属离子，属于超广谱β-内酰胺酶的一种，这种酶可分解β-内酰胺环结构，可使任何含β-内酰胺环结构的抗生素失活，因此，携带这种酶的细菌可以抵抗所有含β-内酰胺环结构的抗生素，从而导致临床用药困难。
[0004] 虽然各国学者对NDM-1基因的研究不断有文献报道，但主要集中在对人体的检测，并也只有从人体中检测出携带基因NDM-1的细菌，而在畜牧兽医方面的研究相对较少。NDM-1基因存在于DNA的结构中，被称为质粒。质粒可以在细菌中自由复制和移动，从而使各种菌种均有可能携带该NDM-1基因，具有传播和变异的惊人潜能。尽管我国畜牧业尚未出现携带NDM-1基因的耐药细菌，但携带NDM-1耐药细菌的出现也为我国畜牧业滥用抗生素敲响了警钟。那么，这种导致人类发病的“超级耐药细菌”在畜禽养殖场中到底是否存在？这需要建立相应的检测方法进行检测。
发明内容
[0005] 为了解决上述问题，本发明建立 “超级耐药细菌”NDM-1基因的PCR快速检测方法，调查畜禽养殖场中分离到的耐药细菌是否携带NDM-1基因。
[0006] 本发明的目的在于提供一种细菌耐药基因NDM-1的PCR检测引物。
[0007] 本发明的目的在于提供一种包含上述检测引物的细菌耐药基因NDM-1的PCR检测试剂盒。
[0008] 本发明所采用的技术方案如下：
[0009] 一种细菌耐药基因NDM-1的PCR检测引物，其核苷酸序列分别如下所示：
[0010] NDM-1F: GGTTTGGCGATCTGGTTTTCC（SEQ ID NO:1）；
[0011] NDM-1R: TTGTCCTGATGCGCGTGAGTC（SEQ ID NO:2）。
[0012] 一种细菌耐药基因NDM-1的PCR检测试剂盒，该试剂盒包含上述的检测引物。
[0013] 本发明的有益效果是：
[0014] 1）快速高效：整个检测只需PCR扩增和电泳检测即可完成；
[0015] 2）操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，只需进行常规的PCR即可；
[0016] 3）高特异性：本发明对大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌和铜绿假单胞菌的 DNA均不发生扩增；
[0017] 本发明设计的特异性引物不与其他核酸序列发生错配，特异性高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；
[0018] 4）高灵敏度：本发明的最低检测极限可达到9.18×10-7μg/μL。
附图说明
[0019] 图1为PCR扩增检测细菌耐药基因NDM-1的特异性实验图；
[0020] 图2为PCR扩增检测细菌耐药基因NDM-1的灵敏度实验图，从左到右的电泳泳道-2 -3 -4 -5依 次 为 9.18×10 μg/μL、9.18×10 μg/μL、9.18×10 μg/μL、9.18×10 μg/μL、-6 -7 -8 -9
9.18×10 μg/μL、9.18×10 μg/μL、9.18×10 μg/μL、9.18×10 μg/μL的阳性标准品的扩增结果；
9.18×10 μg/μL、9.18×10 μg/μL、9.18×10 μg/μL、9.18×10 μg/μL的阳性标准品的扩增结果；
[0021] 图3为PCR扩增检测细菌耐药基因NDM-1的重复性实验。
具体实施方式
[0022] 以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0023] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
[0024] 实施例1：
[0025] 一、特异性引物设计
[0026] 根据 GenBank 已公布的细菌耐药基因NDM-1的序列（登录号：AB614355、FN396876、FR820590），选取保守序列，设计用于检测细菌耐药基因NDM-1的特异性引物，预期扩增产物片段长度为241bp（SEQ ID NO:3），其引物序列分别为：
[0027] 引物：
[0028] NDM-1F: GGTTTGGCGATCTGGTTTTCC（SEQ ID NO:1）；
[0029] NDM-1R: TTGTCCTGATGCGCGTGAGTC（SEQ ID NO:2）。
[0030] 二、 PCR扩增模板与阳性质控品的制备
[0031] 人工合成细菌耐药基因NDM-1序列，利用常规方法将获得的基因NDM-1片断连接到T载体中，即为PCR扩增模板和阳性质控品。
[0032] 三、基因NDM-1 PCR扩增反应条件的优化
[0033] 基因NDM-1的PCR扩增体系：在 PCR 反应管中分别加入灭菌水6 μL，2×PCR Reagent 10 μL， 20pmol/μL NDM-1F 1 μL、20pmol/μL NDM-1R 1 μL，PCR扩增模板 2 μL，共20 µl PCR扩增体系。
[0034] 利用上述PCR扩增体系，运用正交法梯度性地改变变性温度和时间，退火温度和时间、延伸时间以及循环数等条件，确定基因NDM-1特异性引物的最佳循环扩增条件为：首先95 ℃预变性 5 min；然后94 ℃，15 s，65 ℃，30 s，72 ℃，15 s，共进行28个循环；最后72 ℃延伸 5 min；4 ℃保存。
[0035] 四、细菌耐药基因NDM-1 PCR扩增特异性实验
[0036] 为了检测本发明PCR检测方法的特异性，分别对大肠埃希氏菌（ATCC29522）、肺炎克雷伯菌（CMCC(B)46117）、阴沟肠杆菌（CMCC(B) 45301）、铜绿假单胞菌（ATCC9027）等4株标准的菌株和NDM-1基因阳性质控品进行检测，分别提取各细菌的基因组DNA为模板，并以灭菌水为阴性对照，分析本PCR方法对基因NDM-1和其他常见畜禽细菌的基因检测情况。
[0037] 检测方法采有上述“三”中的PCR扩增体系和条件，PCR产物经 1.2% 琼脂糖凝胶电泳显示，发现只有NDM-1基因阳性质控品 PCR 产物在 240 bp左右出现了一条片段，与预期大小相符，而灭菌水对照、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌和铜绿假单胞菌都没有出现条带(如图1所示)。
[0038] 上述结果说明，本发明PCR检测方法能特异性扩增出细菌基因NDM-1的靶序列，而不与其它细菌核酸发生交叉反应。说明本发明方法特异性好，未出现假阳性。
[0039] 五、细菌耐药基因NDM-1 PCR扩增灵敏度试验
[0040] 用核酸测定仪测定阳性质控品基因组DNA的浓度为918μg/mL，并将其-2 -3按 10的倍数进行系列稀释，分别稀释至浓度为9.18×10 μg/μL、9.18×10 μg/-4 -5 -6 -7
μL、9.18×10 μg/μL、9.18×10 μg/μL、9.18×10 μg/μL、9.18×10 μg/μL、-8 -9
9.18×10 μg/μL、9.18×10 μg/μL，采用上述“三”中的PCR扩增体系和条件，分别对稀释后不同浓度的阳性标准品进行扩增检测。
μL、9.18×10 μg/μL、9.18×10 μg/μL、9.18×10 μg/μL、9.18×10 μg/μL、-8 -9
9.18×10 μg/μL、9.18×10 μg/μL，采用上述“三”中的PCR扩增体系和条件，分别对稀释后不同浓度的阳性标准品进行扩增检测。
[0041] 检测结果如图2所示，从左到右的电泳泳道依次为9.18×10-2μg/μL、-3 -4 -5 -69.18×10 μg/μL、9.18×10 μg/μL、9.18×10 μg/μL、9.18×10 μg/μL、-7 -8 -9
9.18×10 μg/μL、9.18×10 μg/μL、9.18×10 μg/μL的阳性标准品的扩增结果，从-7
中可以看出本发明的PCR检测方法的灵敏度可达9.18×10 μg/μL，表明本发明检测方法对细菌耐药基因NDM-1的诊断具有高度的灵敏性。
9.18×10 μg/μL、9.18×10 μg/μL、9.18×10 μg/μL的阳性标准品的扩增结果，从-7
中可以看出本发明的PCR检测方法的灵敏度可达9.18×10 μg/μL，表明本发明检测方法对细菌耐药基因NDM-1的诊断具有高度的灵敏性。
[0042] 六、细菌耐药基因NDM-1 PCR扩增重复性试验
[0043] 将8次独立重复提取含基因NDM-1阳性质控品的基因组DNA分别进行PCR扩增，经 1.2% 琼脂糖凝胶电泳显示，均出现了清晰明亮的目的条带（图3），表明本发明的PCR检测方法具有良好的重复性和稳定性。