一种同时测定16种人参皂苷单体HPLC方法转让专利
申请号 : CN201410022314.1
文献号 : CN103884786B
文献日 : 2015-04-29
发明人 : 郜玉钢 , 郭冲 , 张连学 , 臧埔 , 何忠梅 , 赵岩 , 祝洪燕 , 王立岩 , 杨鹤 , 刘双利
申请人 : 吉林农业大学
摘要 :
本发明提供一种同时测定Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、F1、Rd、F2、Rg3、protopanaxatriol、Compound K、Rh2、protopanaxadiol16种人参皂苷单体HPLC方法，测定范围包括含有上述1种以上皂苷单体的人参、西洋参等药用植物及其制剂；与现有技术相比，本专利同时测定的人参皂苷单体种类多达16种，提高了效率；本专利只用乙腈和水作流动相，解决了磷酸盐对色谱柱损耗大,系统清洗麻烦等问题；本专利建立的HPLC方法线性范围广、方法准确、重现性好、快捷简便、稳定可靠。本专利为人参、西洋参等药用植物及其制剂的质量控制提供理论依据。
权利要求 :
1.一种同时测定16种人参皂苷单体HPLC方法，所测定的16种人参皂苷单体分别为Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、F1、Rd、F2、Rg3、protopanaxatriol、Compound K、Rh2、protopanaxadiol，测定样品范围包括含有上述皂苷中1种以上的人参、西洋参及其制剂；
由以下步骤完成：
（1）对照品溶液的制备
分别精密称取16种人参皂苷单体对照品Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、F1、Rd、F2、Rg3、protopanaxatriol、CK、Rh2、protopanaxadiol 5mg，至于5ml容量瓶，用甲醇溶解-1并定容，制得1mg﹒ml 的溶液；
（2）样品溶液的制备
分为固体样品和液体样品两种：精密称取固体样品人参及其制剂粉末1g，用滤纸包好，放置索氏提取器中，加适量石油醚，80℃回流提取4h，弃去石油醚液，加适量甲醇，80℃回流提取10h，收集提取液,加色谱纯甲醇定容，用0.45μm滤膜过滤入样品瓶备用；液体样品直接用0.45μm滤膜过滤入样品瓶备用；
（3）16种人参皂苷单体含量测定标准曲线的建立
色谱条件：C18色谱柱为150×4.6mm，5μm；流动相为乙腈和水，流动相梯度洗脱条件：
0min为18%乙腈，40min为21%乙腈，42min为26%乙腈，46min为32%乙腈，66min为33.5% 乙腈，71min为38%乙腈，86min为65%乙腈， 91min为65%乙腈，96min为85%乙腈，103min-1为85%乙腈，105min为18%乙腈，106min为18%乙腈；流速1.0 mL﹒min ；检测波长 203 -1nm，柱温35℃；将1.0mg﹒ml 的对照品溶液进样2uL，4uL，6uL，10uL,16uL,20uL,建立标准曲线，计算每个皂苷单体线性回归方程；
（4）样品中人参皂苷含量的测定
按上述标准曲线色谱条件对制备的样品溶液进行测定，制备的样品溶液进样量为
20uL,利用线性回归方程，计算样品中16种人参皂苷含量。
说明书 :
一种同时测定16种人参皂苷单体HPLC方法
技术领域
[0001] 本发明涉及人参、西洋参等药用植物及其制剂中人参皂苷单体含量的测定方法，属于对中药材及其制剂进行质量控制的技术领域。
背景技术
[0002] 人参是我国地道药材中应用最广泛的代表，人参皂苷是人参的主要药效成分，人参皂苷具有增强记忆力，提高免疫力，改善心血管，调节内分泌，延缓衰老和抗肿瘤等功能，人参皂苷的含量测定已经成为国内外研究的热点。
[0003] 随着社会的发展，对于药品质量控制的要求也越来越高，但由于人参化学成分复杂，人参皂苷种类多样，现已确定并分离的人参皂苷化合物单体有50余种，根据苷元的不同，人参皂苷被分为原人参二醇类皂苷、原人参三醇类皂苷及齐墩果酸类皂苷。因此建立同时、多种、快捷、方便、可靠的人参皂苷检测方法对人参及其制剂的质量控制具有重要意义。
[0004] 虽然大量研究报道了人参皂苷单体含量的HPLC测定方法，但大多为同时测定12种以下人参皂苷单体含量方法，尚未见同时测定16种人参皂苷单体含量的报道。
[0005] 本发明提供一种同时测定16种人参皂苷单体HPLC方法，所测定的16种人参皂苷单体为Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、F1、Rd、F2、Rg3、protopanaxatriol、Compound K、Rh2、protopanaxadiol，测定范围包括含有上述1种以上皂苷单体的人参、西洋参等药用植物及其制剂；由以下步骤完成：对照品溶液的制备，样品溶液的制备，16种人参皂苷含量测定标准曲线的建立，样品中人参皂苷含量的测定；与现有技术相比，本专利同时测定的人参皂苷单体种类多达16种，提高了效率；本专利方法只用乙腈和水作流动相，解决了磷酸盐对色谱柱损耗大,系统清洗麻烦等问题，流动相配制方便，简便了操作；本专利方法色谱柱为普通色谱柱，便于购买，降低成本；本专利方法16种人参皂苷单体在0.5～40μg范围内均呈良好的线性关系、线性范围广，方法准确、重现性好、快捷简便、稳定可靠。本专利方法能够更好地分析人参皂苷单体的含量，为人参、西洋参等药用植物及其制剂的质量控制提供理论依据。发明内容：
[0006] 1、一种同时测定16种人参皂苷单体HPLC方法，所测定的16种人参皂苷单体分别为Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、F1、Rd、F2、Rg3、protopanaxatriol、Compound K、Rh2、protopanaxadiol，测定样品范围包括含有上述皂苷中1种以上的人参、西洋参等药用植物及其制剂；由以下步骤完成：
[0007] （1）对照品溶液的制备
[0008] 分别精密称取16种人参皂苷单体对照品Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、F1、Rd、F2、Rg3、protopanaxatriol、CK、Rh2、protopanaxadiol5mg，至于5ml容量瓶，用甲醇溶解并定容，制得1mg﹒ml-1的溶液；
[0009] （2）样品溶液的制备
[0010] 分为固体样品和液体样品两种：精密称取固体样品人参及其制剂粉末1g，用滤纸包好，放置索氏提取器中，加适量石油醚，80℃回流提取8h，弃去石油醚液，加适量甲醇，80℃回流提取10h，收集提取液,加色谱纯甲醇定容，用0.45μm滤膜过滤入样品瓶备用；
液体样品直接用0.45μm滤膜过滤入样品瓶备用。
液体样品直接用0.45μm滤膜过滤入样品瓶备用。
[0011] （3）16种人参皂苷含量测定标准曲线的建立
[0012] 色谱条件：C18色谱柱为150×4.6mm，5μm；流动相为乙腈和水，流动相梯度洗脱条件：0min为18%乙腈，40min为21%乙腈，42min为26%乙腈，46min为32%乙腈，66min为33.5%乙腈，71min为38%乙腈，86min为65%乙腈，91min为65%乙腈，96min为85%乙腈，
103min为85%乙腈，105min为18%乙腈，106min为18%乙腈；流速1.0mL·min-1；检测波长
203nm，柱温35℃；将1.0mg﹒ml-1的对照品溶液进样2uL，4uL，6uL，10uL,16uL,20uL,建立标准曲线，计算每个皂苷单体线性回归方程；
103min为85%乙腈，105min为18%乙腈，106min为18%乙腈；流速1.0mL·min-1；检测波长
203nm，柱温35℃；将1.0mg﹒ml-1的对照品溶液进样2uL，4uL，6uL，10uL,16uL,20uL,建立标准曲线，计算每个皂苷单体线性回归方程；
[0013] （4）样品中人参皂苷含量的测定
[0014] 按上述标准曲线色谱条件对制备的样品溶液进行测定，制备的样品溶液进样量为20uL,利用线性回归方程，计算样品中16种人参皂苷含量。
附图说明
[0015] 图1是人参皂苷单体对照品混标与人参及人参制剂样品色谱图。
具体实施方式
[0016] 本发明提供了一种同时测定16种人参皂苷单体HPLC方法，本发明领域技术人员可借鉴本发明内容，适当改进工艺参数实现，所有类似的替换和改动对本领域技术人员是显而易见的，都视为本发明。本发明所述一种同时测定16种人参皂苷单体HPLC方法已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0017] 下面结合实施例，进一步阐述本发明。
[0018] 实施例1一种同时测定16种人参皂苷单体HPLC方法
[0019] 1、材料
[0020] 日本岛津LC-2010A高效液相色谱仪，配有LC-2010A型液相色谱泵，LC-2010A型自动进样器，CLASS-vP色谱工作站；日本岛津AUY220电子分析天平，昆山舒美KQ-250DV超声波清洗器。
[0021] 人参药材购自于吉林省抚松县，经张连学教授鉴定为人参；人参茎叶采自吉林农业大学药植园，生脉散为实验室自制；生脉饮（吉林敖东延边药业股份有限公司，批号Z22024479）。
[0022] 人参皂 苷对照 品Rg1（201022），Re（201035），Rf（201007），Rb1(201058)、Rg2(201023)，Rc(201069)，Rb2(201078)，Rb3(201029)，F1(201225)，Rd(201018)，F2(201255)，Rg3(201237)，protopanaxatriol(201206)，Compound K(201243)，Rh2(2012009)，protopanaxadiol(201235)购自于吉林大学天然药物化学实验室，含量均在98%以上，乙腈、甲醇(均为色谱纯)；水为娃哈哈超纯水；其余试剂为分析纯。
[0023] 2、方法
[0024] 2.1对照品溶液的制备
[0025] 分别精密称取16种人参皂苷对照品Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、F1、Rd、F2、Rg3、protopanaxatriol、Compound K、Rh2、protopanaxadiol各5mg，加甲醇制成上述16种人参皂苷的质量浓度分别为1.0，0.94，1.12，1.0，0.98，0.94，0.96，0.96，1.12，0.88，
0.86，1.0，1.06，0.96，1.04，0.94mg·ml-1的对照品溶液，0.45μm滤膜过滤，备用。
0.86，1.0，1.06，0.96，1.04，0.94mg·ml-1的对照品溶液，0.45μm滤膜过滤，备用。
[0026] 2.2样品溶液的制备
[0027] 分为固体样品和液体样品两种：精密称取固体样品人参及其制剂粉末1g，用滤纸包好，放置索氏提取器中，加适量石油醚，80℃回流提取4h，弃去石油醚液，加适量甲醇，80℃回流提取10h，收集提取液,加色谱纯甲醇定容，用0.45μm滤膜过滤入样品瓶备用；
液体样品直接用0.45μm滤膜过滤入样品瓶备用。
液体样品直接用0.45μm滤膜过滤入样品瓶备用。
[0028] 2.316种人参皂苷含量测定标准曲线的建立
[0029] 色谱条件：C18色谱柱为150×4.6mm，5μm；流动相为乙腈和水，流动相梯度洗脱条件：0min为18%乙腈，40min为21%乙腈，42min为26%乙腈，46min为32%乙腈，66min为33.5%乙腈，71min为38%乙腈，86min为65%乙腈，91min为65%乙腈，96min为85%乙腈，-1
103min为85%乙腈，105min为18%乙腈，106min为18%乙腈；流速1.0mL·min ；检测波长-1
203nm，柱温35℃；将1.0mg﹒ml 的对照品溶液进样2uL，4uL，6uL，10uL,16uL,20uL,建立标准曲线，以进样中人参皂苷质量（Y）对峰面积（X）作图，计算每个皂苷单体线性回归方程。精密度试验、稳定性试验、重复性试验、回收率试验按常规方法进行。
103min为85%乙腈，105min为18%乙腈，106min为18%乙腈；流速1.0mL·min ；检测波长-1
203nm，柱温35℃；将1.0mg﹒ml 的对照品溶液进样2uL，4uL，6uL，10uL,16uL,20uL,建立标准曲线，以进样中人参皂苷质量（Y）对峰面积（X）作图，计算每个皂苷单体线性回归方程。精密度试验、稳定性试验、重复性试验、回收率试验按常规方法进行。
[0030] 2.4样品含量测定取人参、人参茎叶、生脉散、生脉饮按供试品溶液制备方法制成样品溶液，按2.3色谱条件进样分析，根据线性回归方程计算16种人参皂苷的含量。
[0031] 3、结果
[0032] 3.1色谱峰的归属
[0033] 图1中，A是人参皂苷对照品，B是生晒参，C是人参茎叶，D是生脉散，E是生脉饮；图1中人参皂苷对照品从左到右1～16号峰分别代表Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、F1、Rd、F2、Rg3、protopanaxatriol、Compound K、Rh2、protopanaxadiol。由图1可见,根据单标对照品保留时间，保留时间分别为Rg1:35.744min、Re:37.706min、Rf:51.174min、Rb1:54.133min、Rg2:55.108min、Rc:56.263min、Rb2:59.083min2、Rb3:60.089min、F1：61.493min、Rd:66.602min、F2：78.779min、Rg3：81.297min、Protopanaxatriol：
83.391min、Compound K：87.040min、Rh2：88.351min、Protopanaxadiol：101.596min，确定人参单体皂苷单体在混标中位置。从对照品溶液中可以检出16个单体人参皂苷单体,样品溶液中待检的单体人参皂苷单体也能和其他的杂峰分开，各组分的分离度良好。
83.391min、Compound K：87.040min、Rh2：88.351min、Protopanaxadiol：101.596min，确定人参单体皂苷单体在混标中位置。从对照品溶液中可以检出16个单体人参皂苷单体,样品溶液中待检的单体人参皂苷单体也能和其他的杂峰分开，各组分的分离度良好。
[0034] 3.2线性关系考察
[0035] 分别精密称取对照品溶液2，4，6，10，16，20μL进样，以进样中人参皂苷质量（Y）对峰面积（X）作图，得到线性回归方程，见表1。本方法测定16种人参皂苷在0.38～22.40μg范围内呈良好的线性关系（r值均>0.9990(n=6)）。
[0036] 表1人参皂苷单体的回归方程
[0037]
[0038] 3.3精密度试验
[0039] 分别进对照品溶液20μL，重复进样6次，Rg1，Re，Rf，Rb1，Rg2，Rc，Rb2，Rb3，F1，Rd，F2，Rg3，protopanaxatriol，Compound K，Rh2，protopanaxadiol峰面积的RSD分别为1.12%，1.54%，0.65%，1.36%，1.43%，1.3%，0.78%，1.35%，0.98%，0.78%，0.56%，1.29%，0.95%，
1.06%，0.8%，0.75%，可见精密度良好。
1.06%，0.8%，0.75%，可见精密度良好。
[0040] 3.4稳定性试验
[0041] 在0，2，4，8，16，24h进样20μL，Rg1，Re，Rf，Rb1，Rg2，Rc，Rb2，Rb3，F1，Rd，F2，Rg3，protopanaxatriol，Compound K，Rh2，protopanaxadiol峰面积的RSD分别为1.65%，1.73%，1.92%，1.53%，1.6%，2.05%，1.49%，1.82%，1.5%，1.39%，1.46%，1.38%，1.43%，2.18%，
1.34%，1.91%，说明供试品溶液在24h内稳定。
1.34%，1.91%，说明供试品溶液在24h内稳定。
[0042] 3.5重复性试验
[0043] 取同一批样品，按样品制备方法制备6份，分别进样20μL，Rg1，Re，Rf，Rb1，Rg2，Rc，Rb2，Rb3，F1，Rd，F2，Rg3，protopanaxatriol，Compound K，Rh2，protopanaxadiol含量的RSD分别为0.12%，0.12%，1.22%，0.37%，1.14%，0.67%，0.40%，1.63%，1.90%，2.42%，0.42%，0.41%，1.39%，1.66%，1.86%，0.97%，均小于2.5%，重复性较好。
[0044] 3.6回收率试验
[0045] 按本方法液相色谱条件，精密移取一定量的对照品溶液加入到样品中，按本方法液相色谱条件进行操作，与样品溶液同时测定。Rg1，Re，Rf，Rb1，Rg2，Rc，Rb2，Rb3，F1，Rd，F2，Rg3，protopanaxatriol，Compound K，Rh2，protopanaxadiol回收率分别为98.71%，99.35%，100.23%，96.46%，97.30%，99.26%，95.37%，101.33%，99.69%，97.23%，100.11%，
96.88%，98.37%，97.78%，99.65%，101.21%，RSD分别为1.37%，0.89%，1.78%，1.25%，1.81%，
0.89%，1.26%，1.38%，1.05%，0.67%，1.22%，1.07%，1.49%，1.03%，0.73%，1.29%。3.7样品含量测定
96.88%，98.37%，97.78%，99.65%，101.21%，RSD分别为1.37%，0.89%，1.78%，1.25%，1.81%，
0.89%，1.26%，1.38%，1.05%，0.67%，1.22%，1.07%，1.49%，1.03%，0.73%，1.29%。3.7样品含量测定
[0046] 取人参、人参茎叶、生脉散、生脉饮按供试品溶液制备方法制成样品溶液，按2.3色谱条件进样分析，根据线性回归方程计算16种人参皂苷的含量，见表2。不同样品中皂苷单体种类和含量不同，本方法可为人参、西洋参等药用植物及其制剂的质量控制提供理论依据。
[0047] 表2人参及其制剂中16种人参皂苷含量（n=6）%