一种18O在线标记的蛋白质定量分析平台及其操作方法转让专利
申请号 : CN201210554634.2
文献号 : CN103884807B
文献日 : 2015-11-18
发明人 : 张丽华 , 张珅 , 周愿 , 袁辉明 , 杨开广 , 张玉奎
申请人 : 中国科学院大连化学物理研究所
摘要 :
权利要求 :
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1.一种 O在线标记的蛋白质定量分析平台,其特征在于:
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O在线标记的蛋白质定量分析平台的构建:进样针(2)与注射泵(1)传动连接,由注射泵(1)驱动进样针(2)向酶反应器(4)内进样;酶反应器(4)置于一柱温箱(3)内,酶反应器(4)的样口入口与进样针(2)相连,酶反应器(4)的样口出口接第一四通或六通阀(5)的第一接口;二台液相色谱泵(9)的物料入口分别与两个流动相储罐相连,二台液相色谱泵(9)的物料出口分别与一个混合器的入口相连,混合器的出口接第一四通或六通阀(5)的第二接口;肽段捕集柱(6)入口端与三通的第一接口相连,三通的第二接口与第一四通或六通阀(5)的第三接口相连,三通的第三接口与第二四通或六通阀(8)的第一接口相连;
第一四通或六通阀(5)的第四接口接废液收集容器;肽段捕集柱(6)的出口端与四通的第一接口相连,四通的第二接口与第二四通或六通阀(8)的第二接口相连,第二四通或六通阀(8)的第三接口和第四接口接废液收集容器;四通的第三接口接高压加电金属针;四通的第四接口与多肽分离柱(7)的入口端相连,多肽分离柱(7)的出口端与质谱检测器(10)的进样口相连;
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所述 O在线标记的蛋白质定量分析平台将蛋白酶解部件、O在线标记、多肽分离部件、检测器集成化;
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酶反应器是实现 O在线标记的关键部件,能够在酶解的同时对酶解后的肽段进行高
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效的 O标记;制备酶反应器的材料为有机基质的整体材料或有机-无机杂化的整体材料或有机基质的颗粒材料;制备酶反应器所固载的酶的种类为:丝氨酸蛋白酶。
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2.一种如权利要求1所述 O在线标记的蛋白质定量分析平台的操作方法,其特征在于:操作方法如下:通过注射泵(1)调节流速,将进样针(2)中的蛋白样品注射进入酶反应器(4)中,酶反应器(4)被放置在柱温箱(3)中,停留孵育45min至90min后,将酶反应器(4)中酶解后的肽段通过第一四通或六通阀(5)注入到捕集柱(6)上,切换第一四通或六通阀(5)和第二四通或六通阀(8),捕集柱(6)上的肽段样品将被液相色谱泵(9)流动相带入
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多肽分离柱(7)中进行进一步分离,最后通过质谱检测器(10)进行分析;O在线酶促标记
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时,NH4HCO3溶于H2 O制成NH4HCO3溶液,蛋白样品溶于NH4HCO3溶液中,其浓度范围为20mM
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至100mM;O在线酶促标记时,反应温度设定为25℃至40℃;O在线酶促标记时,酶促标记的时间为45min至90min。
说明书 :
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一种 O在线标记的蛋白质定量分析平台及其操作方法
技术领域:
的蛋白质定量分析平台是一种集蛋白质在线酶解,O在线标记,多肽分离,检测为一体的系统。
背景技术:
主要有如下两点:1、O标记效率较低:O标记主要分为一步法和两步法,一步法操作较简
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单,只需将样品溶在 O的溶液中进行酶解即可,但此种方法标记效率很低;两步法标记效
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率相对一步法高,但操作繁琐耗时,需先将样品在 O的溶液中进行酶解,酶解后除盐蒸干,
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蒸干后的肽段再溶于 O的溶液中孵育。2、O标记存在回交问题,即采用传统方法进行 O
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标记后,由于蛋白酶仍存在于溶液中,一旦碰到 O的溶液,标记上 O的肽段又会回交为
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O(Journal of Proteome Research 2009,8,2140-2143;Journal ofProteome Research
2009,8,2157-2163)。
多肽分离、检测于一体的分析系统。该系统通过将包含酶反应器的在线分析平台与 O标记
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有机结合,实现蛋白质在线酶解、O在线标记、多肽分离以及检测的快速定量分析,在蛋白质组学研究中具有很好的 应用前景。
发明内容
体的系统。该系统可以快速的进行 O在线标记,避免了传统的离线标记方法所带来的操作繁琐耗时、标记效率低、存在回交等问题。为了实现该目的,本发明的技术方案是:
行高效的 O标记;制备酶反应器的材料可以为有机基质的整体材料,有机-无机杂化的整体材料,有机基质的颗粒材料;制备酶反应器所固载的酶的种类为:丝氨酸蛋白酶。
在线酶促标记时,反应温度可设定为25℃至40℃;O在线酶促标记时,酶促标记的时间为
45min至90min。
附图说明
具体实施方式
组成。该分析装置的特征在于将蛋白酶解, O标记,多肽分离系统集成化。操作过如下:
通过注射泵1调节流速,将进样针2中的蛋白样品注射进入酶反应器4中(酶反应器4被放置在柱温箱3中),停留孵育1小时后,将酶反应器4中酶解后的肽段通过第一四通或六通阀5注入到捕集柱6上,切换第一四通或六通阀5和第二四通或六通阀8,捕集柱6上的肽段样品将被液相色谱泵9流动相带入多肽分离柱7中进行进一步分离,最后通过质谱检测器10进行分析。
溶液(溶于H2 O配成的50mM NH4HCO3中)上样到酶柱上孵育一小时,孵育完后使用H2 O配成的50mM NH4HCO3将样品洗脱并使用MALDI-TOF进行分析;同样,将0.1mg/mL的牛血清白
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蛋白溶液(溶于H2 O配成的50mM NH4HCO3中)上样到酶柱上孵育一小时,孵育完后使用H2 O配成的50mM NH4HCO3将样品洗脱并使用MALDI-TOF进行分析。两份样品的MALDI-TOF分析结果如图2所示。
mL的牛血清白蛋白溶液(溶于H2 O配成的50mM NH4HCO3中)上样到酶柱上孵育一小时,孵
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育完后使用H2 O配成的50mM NH4HCO3将样品洗脱并使用MALDI-TOF分析了 O的标记效
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率;向另一份0.1mg/mL的牛血清白蛋白溶液(溶于H2 O配成的50mM NH4HCO3中)中加入胰酶(胰酶与蛋白质量比为1:25)酶解过夜,再对酶解后的溶液进行除盐蒸干,蒸干后的样品
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复溶于H2 O配成的50mM NH4HCO3(其中含体积比为20%的乙腈)中,再加入胰酶(胰酶与蛋
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白质量比为1:25)孵育24小时,最后用MALDI-TOF对 O的标记效率进行分析。两种方法
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对牛血清白蛋白的 O标记效率对比如图3所示。
示方法对牛血清白蛋白进行在线 O标记后,对样品进行了MALDI-TOF分析;向这一份样品
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中添加10倍体积H2 O配成的50mM NH4HCO3溶液,放置一周后,对样品进行了MALDI-TOF分析。分析结果如图4所示。
方法是将样品在酶反应器中孵育一小时即可;一步法是将样品直接溶于H2 O配成的溶液
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中进行离线酶解;两步法是将样品先溶于H2 O配成的溶液中进行酶解,酶解后的溶液经除
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盐蒸干后再复溶于H2 O配成的溶液中进行孵育。具体对比结果如表1所示。
时间 1hour 约24hour 大于48hour
标记效率 90%以上 低于80% 90%左右