万伏高压电场增强液相色谱系统

摘要

万伏高压电场增强液相色谱系统，涉及液相色谱系统。设有高压纳流泵、进样阀、连接管、二通、捕集柱、四通、放空阀、左铂丝电极、毛细管长柱、紫外检测器、三通、右铂丝电极和高压直流电源；所述高压纳流泵的出口接进样阀的进口，进样阀的出口经连接管接二通的一端口，二通的另一端口经捕集柱接四通的一端口，四通的第二端口经毛细管长柱接三通的第一端口，四通的第三端口接左铂丝电极，四通的第四端口接放空阀，三通的第二端口接右铂丝电极，三通的第三端口排废，左铂丝电极和右铂丝电极分别与高压直流电源连接。提高液相色谱的选择性和分离度。充分发挥色谱与电泳双重分离机理的作用，获得显著提高的分辨能力和色谱与电泳耦合的分离度最大化。

权利要求

1.万伏高压电场增强液相色谱系统，其特征在于设有高压纳流泵、进样阀、连接管、二通、捕集柱、四通、放空阀、左铂丝电极、毛细管长柱、紫外检测器、三通、右铂丝电极和高压直流电源；

所述高压纳流泵的出口接进样阀的进口，进样阀的出口经连接管接二通的一端口，二通的另一端口经捕集柱接四通的一端口，四通的第二端口经毛细管长柱接三通的第一端口，四通的第三端口接左铂丝电极，四通的第四端口接放空阀，三通的第二端口接右铂丝电极，三通的第三端口排废，左铂丝电极和右铂丝电极分别与高压直流电源连接。

说明书

万伏高压电场增强液相色谱系统

技术领域

[0001] 本发明涉及液相色谱系统，尤其是涉及一种万伏高压电场增强液相色谱系统。技术背景

[0002] 色谱与电泳是人类目前掌握的最重要的两种液相分离技术。两者都具有良好的分离度，但选择性不同，即，两者对于同样的混合物会给出不同排布的分离谱图。鉴于两者的高分离度，如果能将色谱与电泳有效地耦合起来，则有望获得进一步提高的分辨能力，从而为高度复杂样品的分离分析提供解决方案。早年提出的加压毛细管电色谱（pCEC）就是一个很好的尝试。pCEC是一种微柱分离技术（Zhang,K.;Jiang Z.J.;Yao C.Y.;Zhang Z.C.;Wang Q.S.;Gao R.Y.;Yan C.Separation of peptides by pressurized capillary electrochromatography.J.Chromatogr.A2003,987:453–458），兼具高效液相色谱及毛细管电泳的双重分离机理。其在电色谱柱入口端通过压力引入流动相，样品在毛细管色谱柱中的保留行为同时受到电泳迁移及其在流动相与固定相之间分配系数的影响，从而获得更好的分离度。但需要指出的是，pCEC是建立在电色谱的基础之上，其所使用的固定相通常是基于老一代的未封尾的裸硅材料以产生电渗流驱动分离，这不仅会导致带电分子（尤其是碱性混合物）的不可逆吸附现象，且电渗流的可控性较差使得分离的稳定性欠佳。另外，在仪器装置方面，pCEC通常采用20cm左右的短柱进行，不仅色谱柱本身分离能力有限，且限制了更高电场的施加，从而大大限制了电泳机理对分离度的贡献。近年，有人报道了基于液相色谱的电场辅助液相色谱技术（eLC）。其与pCEC不同之处主要在于eLC的驱动来自于液相色谱高压泵，而不是电渗流。这就大大放宽了色谱材料的选择，可以使用优良的封尾型硅胶色谱填料获得满意的分离效果；而泵驱动液流也大大提高了分离的稳定性。但是，由于eLC普遍仍采用20cm左右的短柱进行，导致无法施加更高的电压，这就使得电泳贡献的分离度贡献甚微，无法真正发挥色谱与电泳的协同作用以实现分离能力的最大化。

[0003] 已报道的pCEC 与eLC 通常使用千伏水平的辅助电场（Zhang,H.P.;Wang,Y.;Gu,X.;Zhou,J.Y.;Yan,C.Metabolomic profiling of human plasma in pancreatic cancer using pressurized capillary electrochromatography.Electrophoresis2011,32,340–347 ；Wei,J.;Gu,X.;Wang,Y.;Wu,Y.;Yan,C.Two-dimensional separation system by on-line hyphenation of capillary isoelectric focusing with pressurized capillary electrochromatography for peptide and protein mapping.Electrophoresis2011,32,230–237），这是因为相对于20cm左右的短柱而言，根据欧姆定律，更高的电场会导致显著的焦耳热效应，这会导致峰展宽从而损失分离度，更严重的还会导致气泡的产生并造成断电流。此外，由于短柱两端的物理距离较短，过高电场的施加还会引起电击穿。这些都限制了色谱-电泳复合型液相分离系统的实际使用。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种在纳流液相色谱的基础上，施加万伏高压电场以显著增强电分离选择性，从而可获得色谱与电泳耦合的分离度最大化，可为高度复杂样品的选择性调控与高分辨分离提供解决方案的万伏高压电场增强液相色谱系统。

[0005] 本发明设有高压纳流泵、进样阀、连接管、二通、捕集柱、四通、放空阀、左铂丝电极、毛细管长柱、紫外检测器、三通、右铂丝电极和高压直流电源；

[0006] 所述高压纳流泵的出口接进样阀的进口，进样阀的出口经连接管接二通的一端口，二通的另一端口经捕集柱接四通的一端口，四通的第二端口经毛细管长柱接三通的第一端口，四通的第三端口接左铂丝电极，四通的第四端口接放空阀，三通的第二端口接右铂丝电极，三通的第三端口排废，左铂丝电极和右铂丝电极分别与高压直流电源连接。

[0007] 本发明旨在提高液相色谱的选择性和分离度。在纳流液相色谱平台上，进行万伏高压的施加，充分发挥色谱与电泳双重分离机理的作用，从而获得显著提高的分辨能力和色谱与电泳耦合的分离度最大化，本发明基于毛细管长柱开展液相色谱分离，并在其两端安装电极施加高电压，从而构建万伏高压电场增强液相色谱系统。可为高度复杂样品的选择性调控与高分辨分离提供解决方案。

附图说明

[0008] 图1是本发明实施例的结构组成示意图。

[0009] 图2是本发明的电流变化示意图。

[0010] 图3是本发明分离三种多肽的色谱图。

[0011] 图4是本发明分离牛血清白蛋白的酶解液的色谱图。

具体实施方式

[0012] 参见图1～4，本发明实施例设有高压纳流泵1、进样阀2、连接管3、二通4、捕集柱5、四通6、放空阀7、左铂丝电极8、毛细管长柱9、紫外检测器10、三通11、右铂丝电极12和高压直流电源13。

[0013] 所述高压纳流泵1的出口接进样阀2的进口，进样阀2的出口经连接管3接二通4的一端口，二通4的另一端口经捕集柱5接四通6的一端口，四通6的第二端口经毛细管长柱9接三通11的第一端口，四通6的第三端口接左铂丝电极8，四通6的第四端口接放空阀7，三通11的第二端口接右铂丝电极12，三通11的第三端口排废，左铂丝电极8和右铂丝电极12分别与高压直流电源13连接。

[0014] 以下给出本发明具体实施例。

[0015] 实施例1：多肽分离的选择性调控

[0016] 将三种多肽：血管紧张素II、催产素、醋酸生长抑素（购买自生工生物工程(上海)股份有限公司），配置成浓度均为0.1mg/ml的混合溶液作为样品；将牛血清白蛋白（购买自生工生物工程(上海)股份有限公司）通过胰蛋白酶酶解制得蛋白酶解样品。高压纳流泵流速100nl/min，214nm波长紫外检测。

[0017] 操作时，首先将放空阀打开，样品在捕集柱上富集和脱盐；之后，将阀关闭，开启高压源，进行电场增强液相色谱分离。图2是1万伏电压下电流的变化曲线，其缓慢的变化趋势说明万伏高压电场有效且稳定地施加在毛细管长柱两端，且随着分离的进行，柱内电阻发生缓慢的变化。同时，其输出电流水平（～10μA）较低，大大低于出现焦耳热效应的工作电流上限（100μA），充分证明长柱的使用和该电场增强系统构建的合理性、有效性和稳定性。

[0018] 图3展示了万伏高压电场增强液相色谱对三种多肽的分离选择性的精细调节。当不施加电场时（即纯液相色谱分离），其出峰顺序为1，2，3，且峰对1-2未完全分离开来。当施加0.5万伏高压时，峰1和峰2位置发生交换，其分离选择性开始发生改变，且峰形变锐，峰容量增大（即分离度提高）。而当施加1万伏电压后，峰1和峰2位置彻底交换并完全分离开来，且三个多肽的平均半峰宽比纯液相色谱模式下的平均半峰宽锐化了42%，分离度显著提高。该示例说明万伏高压电场对分析物的分离选择性具有良好的调控能力。

[0019] 实施例2：复杂混合物的分离度增强效应

[0020] 通过高度复杂的实际生物样品---蛋白降解物，还演示了万伏高压电场增强液相色谱显著提高的分离度。如图4所示，施加1.5万伏高压下电场增强液相色谱系统比纯液相色谱的分离能力显著增强，实际读出色谱峰的数目从92个增加到113个，峰容量从239增加到357，分辨能力显著提高50%。这是万伏高压电场对分离度增强效应的充分体现。

[0021] a毛细管色谱长柱的制备

[0022] 采用单颗粒塞技术制备柱塞（参见文献：Xiao,Z.L.;Wang,L.;Liu,Y.;Wang,Q.Q.;Zhang,B.A“plug-and-use”approach towards facile fabrication of capillary columns for high performance nanoflow liquid chromatography.J.Chromatogr.A2014,1325:109-114；Zhang,B.;Liu,Q.;Yang,L.J.;Wang,Q.Q.Performance of single particle fritted capillary columns in electrochromatography.J.Chromatogr.A2013,1272:136-140），高压匀浆填充的方法制备毛细管柱。基于单颗粒塞的高通透性，可制得有效长度为80cm的颗粒填充毛细管长柱（80cm后开0.5cm检测窗口，总长88.5cm）。通过相同的方法制备2cm长的毛细管柱作为捕集柱。

[0023] b万伏高压电场增强液相色谱系统

[0024] 高压纳流泵（Shimadzu LC-20AD，岛津）驱动液流通过进样阀，阀后接入连接管（100cm长内径为50μm的毛细管，永年县锐沣色谱器件有限公司），连接管末端通过一个二通（Upchurch）与捕集柱连接，捕集柱后接入一个四通（Upchurch）一端，四通其他三端分别接入左铂丝电极（Pt）、放空阀和毛细管长柱。随后将毛细管长柱检测窗口嵌入紫外检测器（Waters Quanta4000E，沃特世公司）以便检测。毛细管长柱柱后接入三通（Upchurch）一端，其它两端分别接入右铂丝电极（Pt）和排废液的毛细管。毛细管长柱的两端连接有万伏高压直流电源（东文高压电源（天津）有限公司），该高压直流电源正极接在柱前的四通电极上和负极接在柱后的三通电极上。在进样时，柱前四通一端的放空阀处于放空状态以完成样品在捕集柱上的加载；在分析时，放空阀处于闭合状态以完成样品从捕集柱向下游分析柱的转移。流动相液流的组成以及流速可通过高压纳流泵进行控制；所施加的电场则由高压直流电源控制。该外加电场将基于分析物的带电性来调节其分离选择性，从而获得电场增强的色谱分离效果。