一种用于增加显色持续时间的ELISA酶免显色剂及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种用于增加显色持续时间的ELISA酶免显色剂及其制备方法和应用。与现有技术相比，通过本发明方法制备得到的显色剂，在终止后120分钟内，可以维持接近恒定的显色状态，使得显色终止后维持相当程度的稳态，从而增加OD值测定的稳定性、准确性和精密性，有效降低显色过程不稳定对ELISA测试结果准确性的不利影响。

权利要求

1.一种用于增加显色持续时间的ELISA酶免显色剂，其特征在于按照以下方法制备：(1)配制酸性缓冲溶液，pH 3.6-5.8；

(2)将配制好的酸性缓冲溶液，置于冰浴中，静置直至体系温度达到1-10℃；

(3)将冷却后的酸性缓冲溶液移至完全避光空间，取3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、

4-氯-1萘酚(4C1N)或氯化硝基四氮唑蓝(NBT)作为底物，先溶解于有机溶剂中，待溶解完全后，加入到预先冷却的酸性缓冲溶液中，冰浴；

(4)向步骤(3)得到的溶液中加入占所配制的ELISA酶免显色剂总体积的1/40-1/20的30％的双氧水溶液，充分搅拌混匀后补加配制的酸性缓冲溶液定容，使得3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、4-氯-1萘酚(4C1N)或氯化硝基四氮唑蓝(NBT)的最终浓度为0.1g/L-20g/L；

(5)将步骤(4)配制好的底物溶液转移到水浴中温浴，温度为30-40℃，温浴时间为

1-48小时；

(6)在温浴过程中，加入还原剂，使其终浓度为0.05-15g/L；

(7)待还原剂充分溶解之后取出溶液，储存于4℃，即得。

2.根据权利要求1所述的ELISA酶免显色剂，其特征在于所述的酸性缓冲溶液为Tris-HCl缓冲液、咪唑-HCl缓冲液、柠檬酸-醋酸钠溶液或冰醋酸-醋酸钠溶液。

3.根据权利要求2所述的ELISA酶免显色剂，其特征在于所述的酸性缓冲溶液为柠檬酸-醋酸钠溶液。

4.根据权利要求2或3所述的ELISA酶免显色剂，其特征在于，所述的柠檬酸-醋酸钠溶液浓度为0.01M-0.1M，pH为5.4。

5.根据权利要求4所述的ELISA酶免显色剂，其特征在于，所述的柠檬酸-醋酸钠溶液浓度为0.05M，pH为5.4。

6.根据权利要求1所述的ELISA酶免显色剂，其特征在于步骤(2)中静置直至体系温度达到2-4℃。

7.根据权利要求6所述的ELISA酶免显色剂，其特征在于步骤(2)中静置直至体系温度达到4℃。

8.根据权利要求1所述的ELISA酶免显色剂，其特征在于所述的有机溶剂为DMSO、DMF、甲醇或乙醇。

9.根据权利要求1所述的ELISA酶免显色剂，其特征在于步骤(4)中加入的30％的双氧水溶液占所配制的ELISA酶免显色剂总体积的1/30。

10.根据权利要求1所述的ELISA酶免显色剂，其特征在于步骤(4)中3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、4-氯-1萘酚(4C1N)或氯化硝基四氮唑蓝(NBT)的最终浓度为0.1-10g/L。

11.根据权利要求10所述的ELISA酶免显色剂，其特征在于3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、4-氯-1-萘酚、氯化硝基四氮唑蓝的最终浓度分别为0.5g/L、1.30g/L、5.6g/L。

12.根据权利要求1所述的ELISA酶免显色剂，其特征在于所述的还原剂为硼氢化钠、抗坏血酸、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、柠檬酸三钠、二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、特丁基对苯二酚、聚山梨醇酯80或EDTA中的一种或几种。

13.根据权利要求12所述的ELISA酶免显色剂，其特征在于所述的还原剂为柠檬酸三钠，终浓度为0.2g/L。

14.权利要求1-13任一项所述的ELISA酶免显色剂在制备ELISA酶免诊断试剂盒中的应用。

说明书

一种用于增加显色持续时间的ELISA酶免显色剂及其制备

方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于增加显色持续时间的ELISA酶免显色剂及其制备方法和应用，使用本发明的ELISA酶免显色剂能够使得ELISA显色反应终止后显色程度在较长时间内保持稳定。

背景技术

[0002] ELISA中文名称“酶联免疫吸附实验”，是一种基于抗原抗体反应的免疫学分析测定技术。可以定性和定量测定各种病原体的抗体，包括IgG、IgM、IgA等，都可以采用该方法检测，从而辅助临床诊断受试者是否感染某种疾病，该技术在医学检验、科研、环境监测、食品安全等有着广泛的应用。

[0003] ELISA试剂盒的主要组成部分包括但不限于：1.反应板；2.样品稀释液；3.酶结合物；4.洗液；5.显色剂；6.终止液；7.阴/阳性参考品等。以某厂家典型的间接法ELISA测丙型肝炎病毒（HCV）抗体为例，反应操作流程为：1.反应板中加入样品稀释液；2.加入待测样品/阴、阳性对照；3.温浴；4.洗涤；5.加酶结合物；6.温浴；7.洗涤；8.加底物液；9.温浴；10.终止反应。通过与阴阳性对照比较判定受试者抗体的阴阳性结果。

[0004] ELISA试剂盒中常用的酶结合物为辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶等，其中以HRP酶的应用最为普遍。常用的HRP酶作用底物有邻苯二胺(OPD)、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）、4-氯-1萘酚（4C1N）、氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、邻苯二胺、氨基水杨酸以及邻联苯甲胺等，这些底物经HRP酶催化后显色，再用特定的试剂终止酶催化反应后呈现特定的颜色，用酶标仪在相应地最大吸收波长下测定OD值，以OD值的高低作为判定的依据。

[0005] 当使用HRP作为标记酶时，底物常使用OPD、TMB、4C1N、NBT等，由于OPD具有很强的致癌作用，因而作为底物，TMB已取代OPD。但是由于TMB的脂溶性，在显色反应终止后，特别是显色程度较深时，常常产生明显的沉淀。解决这一问题的办法是在底物中加入还原剂，通过还原剂的还原反应避免沉淀产生。还原剂的加入可以有效解决显色剂出现沉淀的问题，但与此同时又伴随产生另一个问题：显色不稳定。当加入的还原剂浓度较高时，终止后产物颜色会迅速消退，即使加入的还原剂浓度很低，显色阶段也会缓慢的褪色，使得整个显色过程不稳定，处于一个OD值缓慢降低的动态变化过程，这对ELISA结果判定的准确性会产生不利的影响。

[0006] 理想的显色状态是：终止反应后，显色体系既不产生沉淀，也不发生颜色消退，能在较长时间内维持恒定的显色状态。

发明内容

[0007] 针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于增加显色持续时间的ELISA酶免显色剂及其制备方法。通过本发明方法制备得到的显色剂，在终止后120分钟内，可以维持接近恒定的显色状态，使得显色终止后维持相当程度的稳态，从而增加OD值测定的稳定性、准确性和精密性，有效降低显色过程不稳定对ELISA测试结果准确性的不利影响。

[0008] 为了达到上述目的，本发明所采用的技术手段为：

[0009] 本发明的一种用于增加显色持续时间的ELISA酶免显色剂，其特征在于按照以下方法制备：

[0010] （1）配制酸性缓冲溶液，pH3.6-5.8；

[0011] （2）将配制好的酸性缓冲溶液，置于冰浴中，静置直至体系温度达到1-10℃；

[0012] （3）将冷却后的酸性缓冲溶液移至完全避光空间，取3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）、4-氯-1萘酚（4C1N）或氯化硝基四氮唑蓝（NBT）作为底物，先溶解于有机溶剂中，待溶解完全后，加入到预先冷却的酸性缓冲溶液中，冰浴；

[0013] （4）向步骤（3）得到的溶液中加入占所配制的ELISA酶免显色剂总体积的1/40-1/20的30%（w/w）的双氧水溶液，充分搅拌混匀后补加配制的酸性缓冲溶液定容，使得3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）、4-氯-1萘酚（4C1N）或氯化硝基四氮唑蓝（NBT）的最终浓度为0.1g/L-20g/L；

[0014] （5）将步骤（4）配制好的底物溶液转移到水浴中温浴，温度为30-40℃，温浴时间为1-48小时；

[0015] （6）在温浴过程中，加入还原剂，使其终浓度为0.05-15g/L；

[0016] （7）待还原剂充分溶解之后取出溶液，储存于4℃，即得。

[0017] 在本发明中，优选的，所述的酸性缓冲溶液为Tris-HCl缓冲液、咪唑-HCl缓冲液、柠檬酸-醋酸钠溶液或冰醋酸-醋酸钠溶液，更优选的，所述的酸性缓冲溶液为柠檬酸-醋酸钠溶液。

[0018] 在本发明中，优选的，所述的柠檬酸-醋酸钠溶液浓度为0.01M-0.5M，更优选为0.05M，pH为5.4。

[0019] 在本发明中，优选的，步骤（2）中静置直至体系温度达到2-4℃，更优选为4℃。

[0020] 在本发明中，优选的，所述的有机溶剂为DMSO、DMF、甲醇或乙醇。

[0021] 在本发明中，优选的，步骤（4）中加入的30%的双氧水，溶液占所配制的ELISA酶免显色剂总体积的1/30。

[0022] 在本发明中，优选的，步骤（4）中3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）、4-氯-1萘酚（4C1N）或氯化硝基四氮唑蓝（NBT）的最终浓度为0.1-10g/L。

[0023] 更优选的，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、4-氯-1-萘酚、氯化硝基四氮唑蓝的最终浓度分别为0.5g/L、1.30g/L、5.6g/L。

[0024] 在本发明中，优选的，所述的还原剂为硼氢化钠、抗坏血酸、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、柠檬酸三钠、二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、特丁基对苯二酚、聚山梨醇酯80或EDTA中的一种或几种，优选的，所述的还原剂为柠檬酸三钠，终浓度为0.2g/L。

[0025] 进一步的，本发明还提出了所述的ELISA酶免显色剂在制备ELISA酶免诊断试剂盒中的应用。

附图说明

[0026] 图1为采用常规方法配制的显色剂在终止后显色能力评价；

[0027] 该底物中TMB浓度为3mM，测定HEV-IgG抗体标准品，标准品最高浓度为0.500U，依次倍比稀释后加样，理论浓度分别是0.500U、0.250U、0.125U、0.063U、0.032U、0.016U、0.008U、0.000U共8个梯度。终止反应后，立即用酶标仪双波长450nm/630nm条件下读数，测定OD值，之后每隔2分钟读数依次，记录OD值变化状况；

[0028] 图2为采用本发明的方法配制的显色剂在终止后显色能力评价。

[0029] 该底物中TMB浓度为5mM。测定HEV-IgG抗体标准品，标准品最高浓度为0.500U，依次倍比稀释后加样，理论浓度分别是0.500U、0.250U、0.125U、0.063U、0.032U、0.016U、0.000U共7个梯度。终止后连续观测OD值变化状况。

具体实施方式

[0030] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[0031] 实施例1用于增加显色持续时间的ELISA酶免3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）显色剂（1L）的制备

[0032] （1）配制0.05M柠檬酸-醋酸钠缓冲溶液：称量醋酸钠4.1g，溶于1L纯水中。再用柠檬酸调整溶液的pH值为5.4；

[0033] （2）取900mL柠檬酸-醋酸钠缓冲液，置于冰浴中，静置直至体系温度达到4℃；

[0034] （3）将反应体系移至完全避光空间，取TMB0.5g，先溶解于50mL DMSO中，待溶解完全后，加入到预先冷却的柠檬酸-醋酸钠缓冲液中，冰浴；

[0035] （4）再加入30%的双氧水溶液33mL，充分搅拌混匀后补加0.05M柠檬酸-醋酸钠缓冲液定容至1L，底物TMB的最终浓度为0.5g/L；

[0036] （5）将配制好的底物取出，转移到水浴中温浴，温度为35℃，温浴时间为48小时；

[0037] （6）在温浴过程中，加入柠檬酸三钠，使其终浓度为0.2g/L；

[0038] （7）柠檬酸三钠完全溶解后取出溶液，储存于4℃，即得。

[0039] 实施例2用于增加显色持续时间的ELISA酶免4-氯-1萘酚（4C1N）显色剂（1L）的制备

[0040] （1）配制0.05M柠檬酸-醋酸钠缓冲溶液：称量醋酸钠4.1g，溶于1L纯水中。再用柠檬酸调整溶液的pH值为5.4

[0041] （2）取900mL柠檬酸-醋酸钠缓冲液，置于冰浴中，静置直至体系温度达到4℃；

[0042] （3）将反应体系移至完全避光空间，取4-氯-1萘酚1.3g，先溶解于50mL DMF中，待溶解完全后，加入到预先冷却的柠檬酸-醋酸钠缓冲液中，冰浴；

[0043] （4）再加入30%的双氧水溶液50mL，充分搅拌混匀后补加0.05M柠檬酸-醋酸钠缓冲液定容至1L，底物4-氯-1萘酚的最终浓度为1.3g/L；

[0044] （5）将配制好的底物取出，转移到水浴中温浴，温度为30℃，温浴时间为36小时；

[0045] （6）在温浴过程中，加入丁基羟基茴香醚，使其终浓度为1g/L；

[0046] （7）丁基羟基茴香醚完全溶解后取出溶液，储存于4℃，即得。

[0047] 实施例3用于增加显色持续时间的ELISA酶免氯化硝基四氮唑蓝（NBT）显色剂（1L）的制备

[0048] （1）配制0.1M咪唑-HCl缓冲液：取咪唑盐酸盐6.8g，溶于1L纯水中，用浓盐酸调pH为5.4；

[0049] （2）取900mL咪唑-HCl缓冲液，置于冰浴中，静置直至体系温度达到4℃；

[0050] （3）将反应体系移至完全避光空间，取氯化硝基四氮唑蓝5.6g，先溶解于50mLDMF中，待溶解完全后，加入到预先冷却的咪唑-HCl缓冲液缓冲液中，冰浴；

[0051] （4）再加入30%的双氧水溶液50mL，充分搅拌混匀后补加0.1M咪唑-HCl缓冲液定容至1L，底物氯化硝基四氮唑蓝（NBT）的最终浓度为5.6g/L；

[0052] （5）将配制好的底物取出，转移到水浴中温浴，温度为30℃，温浴时间为36小时；

[0053] （6）在温浴过程中，加入硼氢化钠，使其终浓度为0.2g/L；

[0054] （7）硼氢化钠完全溶解后取出溶液，储存于4℃，即得。

[0055] 对比例1配制未经本发明处理的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）显色剂（1L）[0056] 配制0.05M柠檬酸-醋酸钠缓冲溶液：称量醋酸钠4.1g，溶于1L纯水中充分溶解，混匀。再用柠檬酸调整溶液的pH值为5.4；

[0057] 另取50mL容量瓶一只，称量TMB0.5g，转入容量瓶中，加入DMSO定容到50mL，待TMB溶解，再用双蒸水冲洗瓶内壁2次，冲洗后液体一并转移到1L容量瓶中；取30%的双氧水溶液33mL，加入到上述1L容量瓶中，再补加0.05M醋酸-柠檬酸缓冲液，定容到1L，充分混匀，并装入棕色试剂瓶内保存。

[0058] 对比例2配制未经本发明处理的4-氯-1萘酚（4C1N）显色剂（1L）[0059] 配制0.05M柠檬酸-醋酸钠缓冲溶液：称量醋酸钠4.1g，溶于1L纯水中充分溶解，混匀。再用柠檬酸调整溶液的pH值为5.4；

[0060] 另取50mL容量瓶一只，称量4-氯-1萘酚（4C1N）1.3g，转入容量瓶中，加入DMSO定容到50mL，待TMB溶解，再用双蒸水冲洗瓶内壁2次，冲洗后液体一并转移到1L容量瓶中；

[0061] 取30%的双氧水溶液50mL，加入到上述1L容量瓶中，再补加0.05M醋酸-柠檬酸缓冲液，定容到1L，充分混匀，并装入棕色试剂瓶内保存。

[0062] 对比例3配制未经本发明处理的氯化硝基四氮唑蓝（NBT）显色剂（1L）[0063] 配制0.1M咪唑-HCl缓冲液：取咪唑盐酸盐6.8g，溶于1L纯水中，用浓盐酸调pH为5.4；

[0064] 另取50mL容量瓶一只，称量氯化硝基四氮唑蓝5.6g，转入容量瓶中，加入DMSO定容到50mL，待TMB溶解，再用双蒸水冲洗瓶内壁2次，冲洗后液体一并转移到1L容量瓶中；

[0065] 取30%的双氧水溶液50mL，加入到上述1L容量瓶中，再补加0.1M咪唑-HCl缓冲液，定容到1L，充分混匀，并装入棕色试剂瓶内保存。

[0066] 试验例1间接法ELISA测戊型肝炎病毒（HEV）IgG抗体标准品实验

[0067] 对照组：

[0068] 包被反应板：将HEV抗原稀释到100ng/100uL浓度，取100uL加入到96孔酶标板上包被，包被液含如下物料：碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，BSA0.1%。

[0069] 封闭反应板：按每孔150uL用量加入封闭液，封闭液含如下物料：BSA0.6%，蔗糖2%，Casein0.05%，0.01M PB，pH7.2。

[0070] 封闭好的反应板进行干燥处理，干燥时间2-10小时。

[0071] 加样：每孔加入样品稀释液100uL，再加入按梯度稀释好的HEV-IgG标准品10uL，标准品系列浓度为：0.500U，0.125U，0.063U，0.032U，0.016U，0.008U。同时设置阴性对照和空白各1孔。样品稀释液含以下物料：小牛血清30%（V/V），SDS0.005%，Tris-HCL缓冲液0.01M，pH7.0。

[0072] 温浴：将反应板置于37℃温箱，温浴30min，取出板清洗5次。洗液含以下物料：NaCl2%，0.1M PB，Tween200.5%。

[0073] 加酶结合物：取鼠抗人IgG单克隆抗体，稀释到适当的比例，制备成酶结合物。每孔加入酶结合物100uL。

[0074] 温浴：将反应板置于37℃温箱，温浴30min，取出板清洗5次。

[0075] 加显色剂：加入对比例1配制的显色剂100uL，显色20min后，加入含2M H2SO4的终止液50uL。

[0076] 测定：在酶标仪450/630nm条件下读数。并在终止后，每隔2min读数一次，连续观测A值变化状况。结果见图1。

[0077] 实验组：

[0078] 实验操作步骤与实施例1相同，在加显色剂时，加入采用本发明方法（实施例1）配制的显色剂，终止后在酶标仪450/630nm条件下读数。并在终止后，每隔一定时间读数一次，连续观测至120min以后，观察A值变化状况，结果见图2。

[0079] 从图1和图2的对比结果能够看出通过本发明方法制备得到的显色剂，在终止后120分钟内，可以维持接近恒定的显色状态，使得显色终止后维持相当程度的稳态，从而增加了OD值测定的稳定性、准确性和精密性，有效降低显色过程不稳定对ELISA测试结果准确性的不利影响。

[0080] 试验例2

[0081] 分别将对比例2以及对比例3制备的显色剂与实施例2和实施例3制备得到的显色剂按照试验例1的方法进行试验，结果发现通过本发明方法制备得到的显色剂，在终止后120分钟内，可以维持接近恒定的显色状态，与试验例1的结果相同。