量Q1用于计算第一分析物的值C_m1，所述第一分用于定量光学测量的方法和实验室设备 析物的值C_m1取决于Q1并且是所述第一分析物

摘要

的属性特别是所述至少一种样品的所述第一分本发明涉及一种用于至少一种实验室样品 析物的浓度的特征。所述方法还涉及一种实验室中的至少一种分析物的特征属性的定量光学测 设备，所述实验室设备被配置为应用根据本发明量特别是用于至少一种生物化学样品或生物样 的方法。品的荧光测量的方法，所述方法使用具有至少一个光源和至少一个检测器装置的实验室设备，所述设备利用至少一个敏感性参数S，所述敏感性参数S控制所述实验室设备借由所述至少一个检测器装置来检测信号的能力，所述方法使用源光，以使所述至少一个样品射出样品光，并且所述至少一个检测器装置用于检测样品光，并且所述方法利用所述至少一个敏感性参数S来检测对应的所述样品光的至少一个强度I，所述方法包括以下步骤：-确定至少一个参考点（S_ref；I_ref）；将与S_ref不相同的至少一个第一敏感性参数S_m1用于测量被分配给第一分析物的样品光的至少一个第一强度I_m1；确定定量Q1，所述定量Q1为用于一条线的斜率的测量，所述线通过利用所述至少一个参考点（S_ref；I_ref）和所述至少一个测量点（S_m1；I_m1）来确定；将所述定(56)对比文件US 2002195554 A1,2002.12.26,US 2003105195 A1,2003.06.05,EP 1431745 A1,2004.06.23,BRUCE BAGWELL and EARL G ADAMSC.Fluorescence Spectral OverlapCompensation for Any Number of FlowCytometry Parameters《.Annals of the NewYork Academy of Sciences》.1993,167 - 184.

权利要求

1.一种用于至少一种实验室样品中的至少一种分析物的特征属性的定量光学测量的方法(10；20)，所述方法使用具有至少一个光源和至少一个检测器装置的实验室设备，所述设备利用至少一个敏感性参数S，所述敏感性参数S控制所述实验室设备借由所述至少一个检测器装置来检测信号的能力，所述方法使用源光，以使所述至少一个样品射出样品光，并且所述至少一个检测器装置用于检测样品光，并且所述方法利用所述至少一个敏感性参数S来检测所述样品光的至少一个强度I，所述方法包括以下步骤：·(11)确定至少一个参考点(S_ref；I_ref)；

·(16)将与S_ref不相同的至少一个第一敏感性参数S_m1用于测量被分配给第一分析物的样品光的至少一个第一强度I_m1；

·(17)确定定量Q1，所述定量Q1为一条线的斜率的量度，所述线通过利用所述至少一个参考点(S_ref；I_ref)和所述至少一个测量点(S_m1；I_m1)来确定；

·将所述定量Q1用于计算第一分析物的值C_m1，所述第一分析物的值C_m1取决于Q1并且是所述第一分析物的属性特别是所述至少一种样品的所述第一分析物的浓度的特征。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述定量Q1为一条直线的斜率，所述直线至少由所述两点(S_ref；I_ref)和(S_m1；I_m1)限定，Q1根据公式Q1＝(I_m1-I_ref)/(S_m1-S_ref)被计算，并且特别地，其中C_m1与Q1成比例。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述参考点(S_ref；I_ref)为标准化点(S_fix；I_fix)＝(S_ref；I_ref)，并且用于确定标准化点(S_fix；I_fix)的步骤包括以下步骤：·使用所述源光和至少一种光学标准样品，以让所述至少一种标准样品射出至少一种标准样品光，并且让所述检测器装置检测所述至少一种标准样品光以根据I_1(S)＝c1*(S-S_1_0)+I_1_0来将第一标准样品光的至少第一强度I_1确定为所述检测器装置的可变敏感性参数S的第一函数，其中，c1为取决于第一光学标准样品的因子，并且S_1_0和I_1_0为用于限定所述直线的参数；

·利用至少一个第二函数I_2(S)；

·将(S_fix；I_fix)确定为所述至少两个函数I_1(S)和I_2(S)之间的交叉点。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，在确定标准化点的步骤中，至少又一种光学标准样品被使用，以用于根据I_2(S)＝c2*(S-S_2_0)+I_2_0来额外地将至少还第二标准样品光的所述第二强度I_2确定为所述可变敏感性参数S的第二函数I_2(S)，其中，c2为取决于第二光学标准样品的因子，并且S_2_0和I_2_0为用于限定所述直线的参数。

5.根据权利要求3所述的方法，其中，用于确定标准化点的步骤包括以下步骤：

·利用至少三种光学标准样品，以将所述至少三种标准样品光的三种强度确定为函数I_1(S)、I_2(S)和I_3(S)；

·使用数学估计方法来将所述交叉点(S_fix；I_fix)确定为所述至少三个函数I_1(S)、I_2(S)和I_3(S)的所估计的交叉点。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述估计方法提供以下步骤：

·将(S_fix；I_fix)确定为由所述至少三个函数I_1(S)、I_2(S)和I_3(S)框住的区域内的点。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，三种光学标准样品用于确定三个直线函数I_1(S)、I_2(S)和I_3(S)，并且其中，所述估计方法提供以下步骤：·确定三对直线((I_1(S)；I_2(S))；(I_2(S)；I_3(S))和(I_1(S)；I_3(S)))的三个交叉点IS1，IS2和IS3；

·将所述所估计的交叉点(S_fix；I_fix)确定为由所述三个交叉点IS1、IS2、IS3限定的三角形的三个角的角分线的交叉点。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，用于确定至少一个参考点(S_ref；I_ref)的步骤包括以下步骤：·使用被分配给所述第一分析物的至少又一种样品光，以让所述检测器装置检测来自所述样品的至少一种参考光，以通过使用取决于所述可变敏感性参数S的第一参考光的至少一对第一强度I_1来确定数据集合；

·利用所述数据集合的至少一对(S；I_1)，其中，S与S_m1不相同，以将所述至少一个参考点确定为(S_ref；I_ref)＝(S；I_1)。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，使用在不同敏感性参数S_n1下被分配给第一分析物的样品光的检测出的强度I_n1来确定多个参考点，其中，传统回归方法用于限定通过所述测量点(S_m1；I_m1)和所述多个参考点(S_n1；I_n1)的回归线，并且其中，从所述回归线的斜率c_i获得Q1，其中，C_m1特别地与c_i成比例。

10.根据权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：让所述检测器装置取决于检测的至少一个预先确定的特征波长来检测所述样品光的强度，并且其中，取决于所述特征波长来分别确定至少一个参考点(S_ref；I_ref)，从而将所述至少一个参考点(S_ref；I_ref)分配给检测的每个特征波长。

11.根据权利要求1所述的方法，其中在又一个步骤(18)中，所述第一分析物的值C_m1被用于根据CON1＝a(C_m1)或者CON1＝a(C_m1-C_m0)来确定所述至少一种样品中的所述第一分析物的浓度，其中，a是常数或者预先确定的函数，其特别地是使用传统校准方法可确定的，并且其中，C_m0为不包含所述分析物的空白样品的值。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述敏感性参数根据所述检测器装置的至少一个操作参数例如电子增益因子的变化而改变，或者其中，所述敏感性参数根据激发光的强度的变化而改变，其用于测量所述至少一种样品中的所述至少一种分析物。

13.一种用于至少一种实验室样品中的至少一种分析物的特征属性的定量光学测量的实验室设备，所述实验室设备包括：用于使用源光来照明至少一种样品的至少一个光源、用于检测样品光的至少一个检测器装置、和电子控制装置，其中电子控制装置被配置为使用根据权利要求1至12中任一项所述的方法来至少自动计算取决于Q1的第一分析物的值C_m1，所述第一分析物的值C_m1是第一分析物的属性特别是所述至少一种样品中的第一分析物的浓度的特征。

14.根据权利要求13所述的实验室设备，所述实验室设备被配置为荧光计，或者荧光光度计，或者实时PCR仪器。

15.根据权利要求1至12中任一项所述的方法或者根据权利要求13或14所述设备的使用，在于光学地测量生物化学样品或者生物样品特别是PCR样品的荧光。

说明书

用于定量光学测量的方法和实验室设备

技术领域

[0001] 本发明涉及用于定量光学测量的方法和实验室设备，该设备应用所述方法。

背景技术

[0002] 这种方法特别用在化学、生物化学、生物或者生物医学的实验室环境中，以确定样品溶液中的化学、生物化学、生物或者生物医学的分析物的浓度。这种光学测量的典型原理基于荧光的测量。该分析物由荧光标记物来标记，该荧光标记物可以由光源的激发光激发。荧光标记物接收该激发光，并且通常在另一个波长下射出样品光（荧光）。检测出的样品光的强度用于获得溶液中的分析物的浓度。理想地，分析物的浓度与检测出的强度成比例且可以使用校准因子来确定。这种校准因子可以被预先确定，例如被包含在实验室设备的存储器中的数据集合中，或者可以通过传统校准方法来确定。实验室设备（该实验室设备使用荧光测量）为例如荧光计（该荧光计确定荧光样品光的强度）、荧光光度计（该荧光光度计取决于激发光的波长来确定荧光样品光的强度）或者实时PCR仪器（该实时PCR仪器随着时间推移通过观察来自PCR样品的荧光来监视聚合酶链反应（PCR）的进度）。

[0003] 在期望测量多个分析物（其具有基本上不同的浓度）的情况中需要用于执行光学测量的额外的技术工作。针对实验室设备（并且特别是检测器装置）的预先确定的操作参数集合而言，电子光电检测器（该光电检测器通常作为实验室设备中的检测器装置以用于执行光学测量）被限制到可检测的光强度的特定范围。可以在没有改变操作参数集合的情况下检测所述范围之内的强度。为了测量来自所述范围之外的强度，务必改变检测器装置的操作参数集合。通常，电子增益用于改变检测器装置的敏感性。可替选地，改变激发光的强度，以模拟实验室设备的敏感性参数的变化。许多商业可用的检测器装置被设计为自动提供或者使用敏感性参数，该敏感性参数适合于测量入射样品光的强度。检测器装置自动确定在测量期间被施加的与敏感性参数有关的或多或少校正的强度。在理想情况中，除了噪声和信号饱和或者过载之外，强度I至少在函数I（S）的基本线由检测器装置检测的样性区域中与敏感性参数S的值成比例。I（S）通常还取决于品光的波长。

[0004] 总之，检测器装置可以使用内部校正来应用强度和敏感性之间的正确关系。该校正可能单独针对检测器装置是有效的，但是当检测器装置为实验室设备的一部分时可能还需要修正。在实验室装置中，检测器装置和实验室装置（包括光源、过滤器、用于引导光路的装置）的测量设置的组合将导致这样的情形，不同敏感性参数的使用导致由检测器装置评估的强度的准确度减少。特别是，在不同敏感性参数下检测的强度的比较的准确性被减少，因为整个实验室设备的准确校准正在丢失。

[0005] 一种增加针对不同分析物而测量的强度的比较的准确性的可能性在于仅将单个敏感性参数的值用于检测器装置的操作。在该情况中，可以由检测器装置检测的强度范围由噪声效应和信号饱和效应限定，从而仅较小范围可用于测量。而且，缺点在于在例如由用户手动之前，务必找到最佳敏感性参数。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种定量光学测量的方法，该方法提供递增范围以用于测量光强度，这可以与足够准确性相比较。本发明的另一个目的在于提供一种实验室设备，该实验室设备利用根据本发明的方法。

[0007] 根据权利要求1的方法和根据权利要求13的实验室设备满足该目的。本发明的优选实施例为从属权利要求的主题。

[0008] 根据本发明的方法为一种用于至少一种实验室样品中的至少一种分析物的特征属性的定量光学测量的特别是用于至少一种生物化学样品或生物样品的荧光测量的方法，该方法使用具有至少一个光源和至少一个检测器装置的实验室设备，该设备利用至少一个敏感性参数S，该敏感性参数S控制实验室设备借由至少一个检测器装置来检测信号的能
力，该方法使用源光，以使至少一个样品射出样品光，并且至少一个检测器装置用于检测样品光，并且该方法利用至少一个敏感性参数S来检测对应的样品光的至少一个强度I，优选利用至少两个不同的敏感性参数S并且检测对应的样品光的至少两个强度I，该方法包括以下步骤：

[0009] -确定至少一个参考点（S_ref；I_ref）；

[0010] -将与S_ref不相同的至少一个第一敏感性参数S_m1用于测量被分配给第一分析物的样品光的至少一个第一强度I_m1；

[0011] -确定定量Q1，该定量Q1为一条线的斜率的量度，该线通过利用至少一个参考点（S_ref；I_ref）和至少一个测量点（S_m1；I_m1）来确定；

[0012] -将定量Q1用于计算第一分析物的值C_m1，该第一分析物的值C_m1取决于Q1并且是第一分析物的属性特别是至少一种样品中的第一分析物的浓度的特征。

[0013] 在该方法的优选实施例中，定量Q1为一条线（优选直线）的斜率，该斜率至少由两个点（S_ref；I_ref）和（S_m1；I_m1）限定，Q1优选根据公式Q1=（I_m1-I_ref）/（S_m1-S_ref）或者根据插值函数或者一条线或者回归函数或者通过（S_ref；I_ref）和多个不同测量点（S_m1；I_m1）的线来计算，并且其中，特别地，C_m1与Q1成比例，优选C_m1=Q1。这里，参考点优选为标准化点，其优选针对至少一个分析物（或者至少两个分析物）是相同的，而该分析物特别地使用至少两个不同敏感性参数S来测量。而且，参考点优选针对检测的至少一个预先确定特征波长是相同的。优选地，一个标准化点被用于每个检测的特征波长。

[0014] 在该方法的另一个优选实施例中，定量Q1为直接内插线或者回归线的斜率，这适合于（S_m1；I_m1）和多个参考点（S_n1，I_n1），以使用相同的第一分析物来确定。

[0015] 优选地，关系I（S）被认为还取决于由检测器装置检测的样品光的特征波长。通常，使用源光照明至少一种样品，该源光具有至少一种特征波长ω_s，其为源光强度I（ω_s）具有最大值的波长。源光可以为单色的，这意味着，该源光射出基本上仅在特征波长处的光。检测器装置可以装备有光学滤波器，以仅检测在检测的特征波长ω周围的一个或多个预先确定的光谱区，检测的特征波长ω优选与样品光的光谱在其处具有最大值的特征射出波长对应。这种射出波长可以由分析物的荧光限定。优选地，该方法包括以下步骤：让检测器装置取决于检测的至少一个预先确定的特征波长来检测样品光的强度，并且其中，取决于检测的特征波长来分别确定至少一个参考点（S_ref；I_ref），从而将至少一个参考点（S_ref；
I_ref）分配给每个检测的特征波长。

[0016] 该方法优选应用在化学、生物化学、生物或者生物医疗的实验室中，以确定在至少一种样品中的至少一种分析物的特征属性。优选地，该特征属性为样品中的优选化学、生物化学、生物或者生物医疗的分析物的浓度，该样品优选化学、生物化学、生物或者生物医疗样品。

[0017] 通常，分别地提供多个不同样品，每个样品具有优选由荧光测量的待光学测量的至少一个分析物或者恰好一个分析物。还可以并且优选的是对具有待测量的两种或更多种分析物的一种样品进行测量。用于执行本发明方法的实验室设备可以被配置为保持一种样品（该样品例如可以由用户与待测量的另一种样品进行交换）或者保持多种样品，以测量在实验室设备中并行或者依次布置的多种样品。

[0018] 优选地，该方法提供针对样品中的分析物的特定浓度优选自动、优选半自动或者优选手动选择特定敏感性参数，从而敏感性参数允许在所测量的强度I与敏感性参数S基本成线性关系的线性范围内操作检测器装置。通常，使用特定敏感性参数来测量每个分析物的每个样品。

[0019] 当比较或者进一步计算浓度值时，用于获得C_m1的特别是样品中的分析物的浓度的参考点（S_ref；I_ref）的使用增加了准确度。不是仅从例如根据CON1=b的一个测量来获得浓度例如第一分析物的浓度CON1（其中，b是校准函数b（I_m1）或者CON1=b（I_m1-I_m0），并且I_m0为使用没有分析物的空白样品的测量），而是根据本发明从直线的斜率C_m1获得浓度，该直线贯穿参考点和所测量点（S_m1；I_m1），或者为通过多个参考点和所测量点的回归线。

[0020] 优选地，参考点（S_ref；I_ref）为标准化点（S_fix；I_fix）=（S_ref；I_ref），并且用于确定标准化点（S_fix；I_fix）的步骤包括以下步骤：

[0021] ·使用源光和至少一种光学标准样品，以用于让至少一种标准样品射出至少一种标准样品光，并且让检测器装置检测该至少一种标准样品光以根据I_1（S）=c1*（S-S_1_0）+I_1_0来将第一标准样品光的第一强度I_1确定为可变敏感性参数S的第一函数，其中，c1为取决于第一光学标准的因子，并且S_1_0和I_1_0为用于限定直线的参数，其可以使用数据集合（S；I_1）来确定；

[0022] ·利用至少一个第二函数I_2（S）；

[0023] ·将（S_fix；I_fix）确定为至少两个函数I_1（S）和I_2（S）之间的交叉点。

[0024] 在该情况中，优选在样品测量之前确定的单个标准化点（S_fix；I_fix）优选针对检测器装置的检测的至少一个预先确定的特征波长，来用于优选在不同样品中的不同分析物的测量，其中，优选将一个个别标准化点（S_fix；I_fix）分配给检测的一个特征波长。I_1（S）由S的变化并且检测相关联的强度I_1（S）来确定。为了确定S_1_0和I_1_0，数据集合（S；I_1）应当包含至少两个点（S；I_1）。优选，数据集合（S；I_1）包含多个点（S；I_1）。用于确定I_1（S）的方法可以包括传统回归方法和插值法，以用于将函数I_1（S）拟合为所测量的数值对（S；I_1）。标准化点（S_fix；I_fix）可以由N（N>0）个分析物的测量的所有计算C_m1，C_m2,C_m3，C_m4,…C_mN共享。这进一步提高了不同强度的比较的整个准确性，这涉及在不同敏感性参数S_m1，S_m2,S_m3，S_m4，…S_mM下的测量，其中，M可为优选小于或者等于N的数值。

[0025] 优选地，光学标准样品为以下光学样品，该光学样品是预先确定的并且表示分析物的某种浓度，特别是表示荧光标记物的某种浓度。通常，光学标准样品可用作样品集合，其中，光学相互作用（例如，通过荧光）物质被包含在具有不同预先确定浓度的每个样品中。然而，可以由用户例如通过将样品分析物以不同预先确定浓度溶解在溶液中来制备标准样品。可以使用传统校准方法来确定参数c1。

[0026] 优选地，根据本发明的方法还包括以下步骤：

[0027] -将至少一个第二敏感性参数S_m2用于测量被分配给第一分析物或者优选第二分析物的样品光的至少一个第二强度I_m2；

[0028] -确定定量Q2，其为一条线的斜率的量度，所述测量Q1通过利用相同标准化点或者另一个标准化点（S_fix；I_fix）和至少一个测量点（S_m2；I_m2）来确定；

[0029] -将定量Q2用于计算分析物的值C_m2，该分析物的值C_m2取决于Q2并且优选为被分配给第二分析物的第二分析物的值，并且是分析物优选第二分析物的属性特别是至少一种样品中的分析物优选第二分析物的浓度的特征，特别地根据公式：

[0030] -Q2=（I_m2-I_fix）/（S_m2-S_fix）或者根据通过（S_fix；I_fix）和多个不同测量点（S_m2；I_m2）的回归线。

[0031] -并且其中，特别地，C_m2与Q2成比例，特别地，C_m2=Q2。

[0032] 这特别适用在测量超过一个分析物、例如测量至少两个分析物的情况中。在该情况中，特别地，根据本发明的方法优选包括以下步骤：比较第一样品值C_m1和第二样品值C_m2，以确定比较值。可以例如通过计算差值例如以接收与（C_m1-C_m2）成比例的结果来执行比较。此外，可以例如通过计算除操作以接收与（C_m1/C_m2）成比例的结果来执行比较。其它比较操作是可能的。特别地，还可以使用第一分析物来测量C_m2。在该情况中，在两个不同敏感性参数下的相同第一分析物的测量可以用于确定例如平均定量，其可以为=0.5*（C_m1+C_m2）。这可以提高确定第一分析物的属性例如浓度的结果的准确性。

[0033] 在用于确定标准化点的方法中，第二函数I_2（S）可以为I_2（S）=常数，例如I_2（S）=0。这可以针对在不同敏感性参数下的不同分析物而测量的不同强度的比较操作来实现足够准确性。

[0034] 优选地，在用于确定标准化点的方法中，至少两个光学标准样品被使用，以用于根据I_2（S）=c2*（S-S_2_0）+I_2_0而额外地将至少还第二标准样品光的第二强度I_2确定为可变敏感性参数S的第二函数I_2（S），其中，c2为取决于第二光学标准的因子，并且可以通过传统校准方法被接收。S_2_0和I_2_0为用于限定直线的参数，该直线可以使用数据集合（S；I_2）来确定。I_2（S）根据S的变化并且检测相关联的强度I_2（S）来计算。用于确定I_2（S）的方法可以包括传统回归方法或插值法，以将函数I_2（S）拟合为所测量的数值对（S；I_2）。在许多情况中，两条直线I_1（S）和I_2（S）的使用已经证明了针对在不同敏感性参数下的不同分析物而测量的不同强度的比较操作来实现足够准确性。

[0035] 优选地，用于确定标准化点的方法包括以下步骤：

[0036] ·利用至少三种光学标准，以将至少三种标准样品光的三种强度确定为函数I_1（S），I_2（S）和I_3（S）；

[0037] ·使用数学估计方法来将（S_fix；I_fix）确定为至少三个函数I_1（S），I_2（S）和I_3（S）之间所估计的交叉点。

[0038] 这里，根据I_3（S）=c3*（S-S_3_0）+I_3_0来额外地将至少还第三标准光的第三强度I_3确定为可变敏感性参数S的第三函数I_3（S），其中，c3为取决于第三光学标准样品的因子，并且可以通过传统校准方法来接收。S_3_0和I_3_0为用于限定直线的参数，该直线可以使用数据集合（S；I_3）来确定。用于确定I_3（S）的方法可以包括传统回归方法和插值法，以将函数I_3（S）拟合为所测量的数值对（S；I_3）。

[0039] 在三个函数或者超过三个函数I_1（S），I_2（S）和I_3（S）用于确定（S_fix；I_fix）的情况中，可能的是三个或者更多个函数不具有单个交叉点。可能将存在三个函数的交叉点对。在该情况中，优选可以使用以下任何数学方法，该方法将交叉点限定为所估计的交叉点。数学估计方法可以为几何方法，或者均分函数的交叉点对的坐标的方法，或者任何其它回归方法。

[0040] 在大多数情况中，至少三条直线I_1（S），I_2（S）和I_3（S）的使用已经证明针对在不同敏感性参数下的不同分析物而测量的不同强度的比较操作来在合理努力下有效地实现最佳准确性。

[0041] 优选地，数学估计方法提供以下步骤：

[0042] ·将（S_fix；I_fix）确定为由至少三个函数I_1（S），I_2（S）和I_3（S）所框住的区域内的点。

[0043] 在大多数情况中，（S_fix；I_fix）的选择是最有效的，并且针对在不同敏感性参数下的不同分析物而测量的不同强度的比较操作示出了足够准确性。

[0044] 优选，至少三种或者恰好三种光学标准样品用于确定三条直线的函数I_1（S），I_2（S）和I_3（S），并且其中，数学估计方法提供以下步骤：

[0045] ·确定三对直线（（I_1（S）；I_2（S））（；I_2（S）；I_3（S））和（I_1（S）；I_3（S）））的三个交叉点IS1，IS2和IS3；

[0046] ·将（S_fix；I_fix）确定为由三个交叉点IS1、IS2、IS3限定的三角形的三个角的角分线的交叉点。

[0047] （S_fix；I_fix）的选择是非常有效的，并且针对在不同敏感性参数下的不同分析物而测量的不同强度的比较操作示出了改进的准确性。

[0048] 不是将用于所有测量C_m1,、C_m2、C_m3、C_m4、…C_mN的共同标准化点与不同敏感性参数S_m1、S_m2、S_m3、S_m4、…S_mM一起使用，而是优选针对于至少检测的一个特征波长，在根据本发明的另一个优选实施例方法中的方法在于多次使用样品中的一种分析物来更准确地确定每个值C_m1,、C_m2、C_m3、C_m4、…C_mN。在该情况中，特别地，根据本发明的方法包括用于确定至少一个参考点（S_ref；I_ref）的修改步骤：

[0049] ·-使用被分配给第一分析物的至少又一种样品光，以用于让检测器装置检测来自所述样品的至少一个参考光，以通过使用取决于可变敏感性参数S的第一参考光的第一强度I_1对来确定数据集合；

[0050] ·利用数据集合的至少一对（S；I_1），以将至少一个参考点确定为（S_ref；I_ref）=（S；I_1）。

[0051] 数据集合可以包括两个或者更多个点（S_mi；I_mi）。可以从贯穿第一分析物的测量的两个点（S_m1；I_m1）和（S_m2；I_m2）的直线的斜率来获得数值C_m1。该方法已经示出具有比确定C_m1=d*I_m1更高的准确性，d为校准因子或者函数。

[0052] 可以从贯穿第一分析物的测量的多个点（S_ni；I_ni）的直线的斜率进一步获得数值C_m1；优选，使用在不同敏感性参数S_n1下被分配给第一分析物的样品光的检测出的强度I_n1来确定多个参考点，其中，传统回归方法用于限定通过所测量点（S_m1；I_m1）和多个参考点（S_n1；I_n1）的回归线，并且其中，从回归线的斜率c_i获得第一分析物的值C_m1，其中，特别地C_m1与c_i成比例。

[0053] 优选，第一分析物的值C_m1用于根据CON1=a（C_m1）或者CON1=a（C_m1-C_m0）来确定至少一种样品中的第一分析物的浓度，其中，a是预先确定的函数或者常数，其特别地使用传统校准方法而是可确定的，并且其中，C_m0为不包含分析物的空白样品的值。可以通过使用用于执行该方法的实验室设备来执行本底辐射的测量（例如本底荧光测量）从而确定C_m0，该实验室设备包含相同样品保持件、样品容器和优选的溶液，该溶液为同样用于溶解分析物的溶液。样品可以被限定为具有其中溶解分析物的溶液的分析物。优选，CON1与C_m1或者（C_m1-C_m0）成比例。

[0054] 敏感性参数可以理解为具有检测器装置的实验室设备的任何操作参数，该参数控制实验室设备借由检测器装置来检测信号的能力。通常，传感器的“敏感性”被限定为针对输入的规定变化而言的输出电压变化。优选，敏感性参数根据检测器装置的至少一个操作参数（例如，电子检测器装置（例如，光度计）的电子增益因子）的变化而改变。还可以并且优选的是，敏感性参数根据源光的强度的变化而改变，其用于测量至少一种样品中的至少一种分析物。还在该情况中，增加检测出的信号的数值，这意味着增加光源的强度的效果等同于增加传感器的敏感性。

[0055] 用于至少一种实验室样品中的至少一种分析物的特征属性的定量光学测量的特别是至少一种生物化学样品或者生物样品的荧光测量的根据本发明的实验室设备包括：用于使用源光来照明至少一种样品的至少一个光源、用于检测样品光的至少一个检测器装
置、和电子控制装置，其中电子控制装置被配置为使用根据本发明的方法或者本发明的优选实施例中的一个来至少自动计算取决于Q1的第一分析物的值C_m1，该第一分析物的值C_m1是第一分析物的属性特别是至少一种样品中的第一分析物的浓度的特征。

[0056] 优选地，根据本发明的方法由设备或者控制装置优选通过利用计算机程序代码来实现，该计算机程序代码优选存储在存储器装置（例如，光学数据盘或者闪速存储器）上。优选地，根据本发明的实验室设备被配置为将所述计算机程序代码存储在实验室设备的数据存储器中。优选，所述计算机程序代码是可执行的，并且根据本发明的实验室设备被配置为执行计算机程序代码以应用根据本发明的方法。

[0057] 优选地，根据本发明的实验室设备被配置为荧光计、或者荧光光度计，或者实时PCR仪器。可以从根据本发明的实验室设备的功能的描述来获得其它优选方法步骤。

[0058] 实验室设备优选包括其它组件，例如：样品保持区域，其用于容纳样品保持件、用于保持至少一个样品容器、特别是用于保持单个容器例如加盖或者未加盖的样品管、或者用于保持多个样品容器例如微量滴定板或PCR板；用户接口，例如键盘、显示器或者触摸屏；数据交换接口和连接。实验室设备特别是样品保持件可以包括用于加热并且/或者冷却样品保持件的温度装置例如珀耳帖（Peltier）元件，和/或热传感器。实验室设备和电子控制装置可以包括用于分别控制样品保持件温度或者样品温度的电子控制回路。优选地，实验室设备被配置为将温度程序施加到样品保持件，以例如通过不同温度水平（热循环）来反复地调整样品保持件的温度。优选地，实验室设备被配置为用于执行实时PCR的热循环仪。

[0059] 根据本发明的方法或者根据本发明的实验室设备的优选使用在于：光学测量生物化学样品或者生物样品特别是PCR样品的荧光。

附图说明

[0060] 此外，可以参考附图从根据本发明的方法和实验室设备的下列实施例中获得本发明的进一步的优点、特征和应用。在下文中，相同的参考附图基本上描述相同的装置。

[0061] 图1示意性地示出根据本发明的实验室装置的实施例，该实验室装置被配置为应用根据本发明的方法。

[0062] 图2示意性地示出根据本发明的方法的实施例的流程图。

[0063] 图3a、图3b、图3c和图3d分别示出具有用于确定根据图2的方法的步骤11中的标准化点的曲线的图形。

[0064] 图4示出能够由根据本发明的方法和实验室设备的实施例所使用的表，该表根据图2的方法的步骤16将敏感性参数分配给检测出的样品光的强度。

[0065] 图5示意性地示出根据图2中的方法的步骤17来如何从测量点和标准化点获得样品中的分析物的浓度。

[0066] 图6示意性地示出根据本发明的方法另一个实施例的流程图。

[0067] 图7示意性地示出根据图6中的方法的步骤23来如何从测量点和标准化点获得样品中的分析物的浓度。

具体实施方式

[0068] 图1示出根据本发明的实验室装置1，该实验室装置1被配置为应用图2中示出的方法10。该实验室设备为用于执行多个生物化学样品或者生物样品（例如PCR样品）的荧光测量的荧光光度计1。实验室设备具有光源2，该光源2被配置为射出一个470nm的激发波长的光，在本实施例的情况中，特别地向样品保持件4之内的第一样品5射出光3，并且向样品保持件的每个样品中的每个分析物依次或者同时射出光3’。如果仅提供一个包含两个试剂的样品容器，则实验室设备的实施例以同样的方式工作。实验室设备还包括检测器装置7，该检测器装置7具有用于检测样品光6，6’并且用于提供电子信号的至少一个光电检测器8，该光电检测器8定量样品光6，6’的强度。检测器装置7为德国（Germany）QIAGEN股份有限公司的商业FluoSens模块。可以通过控制光源（射出激发光的LED）的强度来改变FluoSens模块的敏感性参数。光电检测器在本实施例中具有两种检测的特征波长，该特征波长为520nm和560nm。

[0069] 此外，检测器装置或者实验室设备分别具有电子控制装置9。该电子控制装置9优选包括微处理器、或者至少CPU和存储器，特别是RAM和固态存储器。电子控制装置优选被配置用于应用根据本发明的方法，特别是方法10或者方法20。这意味着例如电子控制装置包括可编程电路，对该可编程电路进行编程，以执行根据本发明的方法。所述编程可以为使用计算机程序代码的软件编程。

[0070] 图2示出用于至少一种生物化学或者生物样品5的定量荧光测量的方法10的流程图。典型任务在于确定在多个独立样品或者一个单独样品中的多个分析物的浓度，并且准确地比较所确定的浓度。方法10适合于使用检测出的分析物的浓度的依次比较来实现这种测量的足够准确性。方法10在没有任何实质额外用户交互的情况下由实验室设备1自动运行并且提供所述准确测量，这对用户来说是舒适的，并且提高了实验室中的工作流程的效率。

[0071] 首先，方法10提供了实验室设备的调整步骤11。所述调整提供三种光学标准样品例如用户准备好的标准样品的使用，以用于在步骤11中确定参考点（S_ref;I_ref），该参考点（S_ref;I_ref）为标准化点（S_fix;I_fix）。单个标准化点（S_fix;I_fix）用于使用多个敏感性参数S_m1…S_mM来准确地确定多个分析物的测量的定量C_m1…C_mN。

[0072] 在本实施例的情况中，确定两个标准化点（S_fix；I_fix）-1和（S_fix；I_fix）-2（未示出），其中，使用用于仅检测520nm（即在大约520nm的相当窄光谱之内）的光的检测器装置的520nm的特征波长来确定（S_fix；I_fix）-1，并且使用560nm的特征波长来确定（S_fix；I_fix）-2。在本实施例中，下面的步骤被描述用于在520nm处的测量并且务必重复在560nm处的测量。

[0073] 在用于确定标准化点（S_fix；I_fix）的步骤12中，在520nm的特征波长处确定第一多点数据集合（S_1;I_1）。这意味着，针对第一光学标准样品而言，预先确定的光强度正在照明样品，并且所激发的样品光由检测器装置检测，而使用多个（至少两个）不同敏感性参数S_1。针对S_1的每个值而言，样品光的强度I_1被检测、测量并且存储。产生的数据集合图形地示出在图3a的示意图中。

[0074] 第一直线I_l被拟合通过所述数据集合的多个点。通常，数据集合的两个点足以画一条线。然而，提供多个点，增加了估计方法的准确性。所述估计方法可以是传统的，以使用传统曲线拟合方法（例如使用最小二乘近似的拟合方法）来拟合直线通过数据集合的多个点（或者在数据集合的多个点之间）。优选地，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、50个（和/或者这些值的最大值个）或者另外数目的点用于确定数据集合，这有效地限定了直线。优选地，额外的算法被提供以用于解决由于噪声或者信号饱和而出现的异常值。

[0075] 在用于确定标准化点（S_fix；I_fix）的步骤13中，确定第二多点数据集合（S_2;I_2）。这意味着，针对第二光学标准样品而言，预先确定的光强度正在照明样品，并且所激发的样品光由检测器装置（在相同特征波长处）检测，而使用多个（至少两个）不同敏感性参数S_2。针对S_2的每个值，样品光的强度I_2被检测、测量并且存储。除了数据集合（S_1;I_1）之外，产生的数据集合图形地示出在图3b的示意图中。

[0076] 在用于确定标准化点（S_fix；I_fix）的步骤14中，确定第三多点数据集合（S_3;I_3）。这意味着，针对第三光学标准样品而言，预先确定的光强度正在照明样品，并且所激发的样品光由检测器装置（在相同特征波长处）检测，而使用多个（至少两个）不同敏感性参数S_3。针对S_3的每个值，样品光的强度I_3被检测、测量并且存储。除了数据集合（S_1;I_1）和（S_2;I_2）之外，产生的数据集合图形地示出在图3c的示意图中。

[0077] 直线I_1（S）和I_2（DS）分别被拟合为数据集合（S_1;I_1）和（S_2;I_2）。

[0078] 在用于确定标准化点（S_fix；I_fix）的步骤15中，确定三对直线（I_1（S）；I_2（S））、（I_2（S）；I_3（S））和（I_1（S）；I_3（S））的三个交叉点IS1、IS2、IS3。标准化点被确定为由三个交叉点IS1、IS2、IS3限定的三角形的三个角的角分线的交叉点。三角形面积的尺寸可以用于评估用于确定标准化点的方法的质量因子。交叉点例如由实验室设备的电子控制装置数值地进行确定。图3d示出了将标准化点（S_fix；I_fix）确定为由三个交叉点IS1、IS2、IS3限定的三角形的三个角的角分线的交叉点的“几何”方法。

[0079] 在方法10的步骤16中，自动确定敏感性S_m1，其适用于测量样品光的强度，其被分配给待测量的第一分析物。测量值从S_m1的默认值开始，并且确定I_m1。如果检测出的I_m1值被包括在表（例如，图4中的表）中包括的敏感性的范围（图4，“下限”、“上限”）内，则该表可以用于核查，以确定表中的相关联值S_m1（图4，“产生的敏感性”），其被分配给包括所测量值I_m1的强度的范围。如果所测量值I_m1不包括在根据该表的强度的范围中，则使用另一个值S_m1来自动重复步骤16，直到找到有效值S_m1为止。对与有效值S_m1相关联的强度I_m1进行存储。

[0080] 在方法10的步骤17中，根据公式C_m1=(I_m1-I_ref)/(S_m1-S_ref)将标准化点（S_fix；I_fix）用于计算第一分析物的值C_m1，其是第一分析物的属性特别是至少一种样品中的第一分析物的浓度的特征。C_m1是贯穿两个点（S_fix；I_fix）和（S_m1；I_m1）的直线的斜率。这图形地示出在图5中。

[0081] 在方法10的步骤18中，从C_m1，优选根据CON1=a（C_m1-C_m0），来计算样品中的分析物的浓度值CON1，其中，a是由传统校准方法预先确定的因子或者函数，并且C_m0是光学系统的本底荧光的测量结果，该光学系统包括实验室设备中光路的至少一部分、样品保持件、样品容器和没有分析物的溶液。传统校准方法可以包括以下步骤：提供样品集合，每个样品包含预先确定浓度的样品分析物，并且通过记录与样品对应的强度，特别地使用标准源光（可以具有标准强度、标准频率），优选使用光源的标准照明和/或检测次数和/或标准输出能量。

[0082] 可以针对检测的特征波长中的一个或者多个波长，来使用相同标准化点或者另一个标准化点（S_fix；I_fix），以对多个样品和多个分析物来重复方法步骤16至18，从而接收准确的测量结果，特别地这可以通过计算步骤准确地比较。

[0083] 在图6中，示出了根据本发明的方法的可替选实施例，即方法20。不是将参考点（S_ref；I_ref）计算为共同标准化点，而是使用具有第一分析物的样品代替使用光学标准样品来在步骤21中计算参考点。优选在检测的只一个波长处运行该方法，但是也可以针对每个检测的特征波长而运行该方法一次。方法20包括步骤22：使用被分配给第一分析物的至少又一个样品光，以让检测器装置检测来自样品的至少一个参考光，以通过使用取决于可变敏感性参数S_m1（S_m2）的所测量的强度I_m1（I_m2）对来确定具有点（S_m1；I_m1）和（S_m2；I_m2）的数据集合。在本文中，确定值S_m1，S_m2，从而通过使用如图4所示的表来检测“有效”值I_m1，I_m2；步骤22利用（S_m2；I_m2）以将至少一个参考点确定为（S_ref；I_ref）=（S_m2；I_m2）。在步骤23中使用两个点，以获得C_m1作为贯穿两个点（S_m1；I_m1）和（S_m2；I_m2）的直线的斜率。这图形地示出在图7中。在步骤24中，根据C_m1，优选根据CON1=a（C_m1-C_m0），来计算样品中的分析物的浓度值CON1，其中，a是由传统校准方法预先确定的因子或者函数，并且C_m0是光学系统的本底荧光的测量结果。在更多的扩展测量时间是可接受的情况中，多个参考点（S_n1；I_n1）可以用于更加准确地限定直线，并且使用传统方法获得斜率，这导致了CON1的更加准确的测量。相同方法20可以应用于每个分析物。