蛋白IbGlu及其编码基因与在提高甘薯茎线虫病抗性中的应用

摘要

本发明公开了蛋白IbGlu及其编码基因与在提高甘薯茎线虫病抗性中的应用。本发明提供了的蛋白IbGlu，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗虫性相关的由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明发现了一种IbGlu蛋白及其编码基因，将该基因导入野生型甘薯中，得到转基因甘薯植株，研究发现，与野生型甘薯相比，转基因甘薯植株抗甘薯茎线虫，说明该蛋白及其编码基因在提高甘薯茎线虫病抗性中具有重要的应用价值；本发明将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

权利要求

1.一种蛋白，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下(1)或(2)中的DNA分子：(1)序列表中序列1自5’末端第41-1188位核苷酸所示的DNA分子；

(2)序列表中序列1自5’末端第49-1080位核苷酸所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求1所述蛋白的编码基因插入表达载体中，得到表达权利要求1所述蛋白的重组载体。

6.扩增权利要求2或3所述基因全长的引物对。

7.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因或权利要求4所述重组载体、表达盒或重组菌在调节植物抗病性中的应用；

所述病为线虫病；所述线虫病为甘薯茎线虫病；

所述植物为双子叶植物；所述双子叶植物为甘薯。

8.一种培育转基因植物的方法，为将权利要求1所述蛋白的编码基因导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物的抗病性高于所述目的植物；所述病为线虫病；所述线虫病为甘薯茎线虫病；所述目的植物为双子叶植物；所述双子叶植物为甘薯。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：权利要求1所述蛋白的编码基因通过权利要求4或5所述的重组载体导入目的植物。

说明书

蛋白IbGlu及其编码基因与在提高甘薯茎线虫病抗性中的

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种蛋白IbGlu及其编码基因与在提高甘薯茎线虫病抗性中的应用。

背景技术

[0002] 植物在面临多种病菌挑战中，逐渐进化形成了一系列复杂的防御机制来抵抗病原菌的侵害，保护自己，减轻病害的危害程度。植物的抗病性是建立在一定的物质基础上的,是由植物的形态结构和生理生化等多方面因素在时间和空间上综合表现的结果。它是通过体内抗病基因的表达,进而控制有关蛋白酶的表达和有关抗病调控物质的产生来实现的。抗病基因的存在与否,抗病基因的表达速度,有关蛋白酶的活性及调控物质的量,就决定了植物抗病性的强弱。植物的主动抗性由许多防卫反应组成，而且它们在时间和空间上相互交叉，并且，抗性表现的快慢及程度不同，其中氧爆发、一氧化氮生成、细胞壁蛋白的交联和胼胝质的合成与沉积是抗性中涉及的快速反应。这些反应不需要基因的转录和蛋白质的合成；过敏反应、植保素合成、木质化、病程相关蛋白(如几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶等)和富含羟脯氨酸糖蛋白的合成，以及系统获得性抗性都需要基因转录和蛋白质合成，属于抗性中较慢的反应。

[0003] β-1,3-葡聚糖酶在植物中广泛存在，参与细胞分裂、种子萌芽、芽休眠、花的形成和果实成熟等生理分化和发育过程，并在植物病害的防卫反应中起着重要的作用，其生物合成受细胞分裂素、水杨酸、乙烯、病原物等诱导。β-1,3-葡聚糖酶可以催化大多数植物真菌细胞壁的主要成分之一β-1,3-葡聚糖的水解，水解后释放的低聚糖反过来又能诱导植物产生其他多种病程相关蛋白(如植物抗毒素等)。β-1,3-葡聚糖酶属于病程相关蛋白大家族中的一员，根据蛋白质产物大小、等电点、一级结构、细胞定位和调控模式等特征，可将其分为5类(Ⅰ～Ⅴ)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类受病原菌的诱导，属于病原相关蛋白家族，Ⅰ类β-1,3-葡聚糖酶是碱性液泡蛋白，Ⅱ类β-1,3-葡聚糖酶是酸性胞外蛋白，与Ⅰ类蛋白序列一致性为52%，Ⅲ类β-1,3-葡聚糖酶是酸性或碱性胞外蛋白，与Ⅰ、Ⅱ类蛋白一致性低于57%。

发明内容

[0004] 本发明的一个目的是提供一种蛋白IbGlu及其编码基因。

[0005] 本发明提供的蛋白IbGlu，是如下（a）或（b）：

[0006] （a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0007] （b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由序列2衍生的蛋白质。

[0008] 上述蛋白中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

[0009] 编码上述蛋白的基因也是本发明保护的范围。

[0010] 上述基因是如下(1）-(4）中任一种的DNA分子：

[0011] (1）编码序列为序列表中序列1自5’末端第41-1188位核苷酸所示的DNA分子；

[0012] (2）编码序列为序列表中序列1自5’末端第49-1080位核苷酸所示的DNA分子；

[0013] (3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA序列杂交且编码植物抗病性相关蛋白的DNA分子；

[0014] (4）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码植物抗病性相关蛋白的DNA分子。

[0015] 上述严格条件为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。

[0016] 上述序列表中的序列1由1541个碱基组成，其开放阅读框架（ORF）为自5′末端第49-1080位碱基，编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的IbGlu。

[0017] 含有上述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

[0018] 上述重组载体为将上述蛋白的编码基因插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。

[0019] 在本发明的实施例中，表达载体具体为载体pCBGUS；上述重组载体为将上述蛋白的编码基因（序列表中序列1自5’末端第41-1188位核苷酸所示的DNA分子）插入pCBGUS的Sac I和BamH I酶切位点间得到的载体。

[0020] 上述pCBGUS载体是通过包括如下步骤的方法得到的：

[0021] （1）将pCAMBIA1301载体（购自CAMBIA公司）经过Hind III和EcoR I双酶切，回收11786bp的载体大片段；

[0022] （2）将pBI121载体（购自Clontech公司；含35S启动子，gusA报告基因，nos终止子片段）也经过Hind III和EcoR I双酶切，回收包含gusA基因的3032bp的片段；

[0023] （3）将步骤（1）中回收的11786bp载体大片段与步骤（2）中回收的包含gusA基因的3032bp的片段经T4DNA酶连接，得到重组载体pCBGUS。

[0024] 上述pCAMBIA3301载体购自CAMBIA公司；上述pBI121载体购自Clontech公司。

[0025] 扩增上述基因全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。

[0026] 上述引物对为如下1）或2）：

[0027] 1）由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；

[0028] 2）由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成。

[0029] 上述蛋白、上述编码基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调节植物抗病性中的应用也是本发明保护的范围；

[0030] 所述调节植物抗病性具体为提高植物抗病性；

[0031] 所述病具体为线虫病；所述线虫病进一步具体为甘薯茎线虫病；

[0032] 所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物进一步具体为甘薯。

[0033] 本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

[0034] 本发明提供的方法，为将上述蛋白的编码基因导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物的抗病性高于所述目的植物。

[0035] 上述方法中，所述病为线虫病；所述线虫病具体为甘薯茎线虫病；

[0036] 上述蛋白的编码基因通过上述的重组载体导入目的植物。

[0037] 上述方法中，所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物具体为甘薯。具体为甘薯品种徐薯18。

[0038] 本发明的实验证明，本发明发现了一种IbGlu蛋白及其编码基因，将该基因导入野生型甘薯中，得到转基因甘薯植株，研究发现，与野生型甘薯相比，转基因甘薯植株抗甘薯茎线虫，说明该蛋白及其编码基因在提高甘薯茎线虫病抗性中具有重要的应用价值；本发明将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

附图说明

[0039] 图1为转IbGlu甘薯植株的PCR检测结果图

[0040] 图2为转IbGlu甘薯植株块根的室内茎线虫接种鉴定结果图

具体实施方式

[0041] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0042] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0043] 下述实施例中甘薯品种徐薯18，公众可从中国农业大学获得，记载过该材料的非专利文献是：Guo JM,Liu QC,Zhai H,Wang YP.Regeneration of plants from Ipomoea cairica L.protoplasts and production of somatic hybrids between I.cairica L.and sweetpotato,I.batatas(L.)Lam.Plant Cell Tiss Organ Cult,2006(87):321–327。

[0044] 实施例1、IbGlu蛋白及其编码基因的获得

[0045] 实验材料：甘薯品种鲁薯3号（公众可从中国农业大学获得，记载过该材料的非专利文献是：翟红,商丽丽,刘庆昌.甘薯茎线虫诱导抑制差减杂交cDNA文库的构建及表达序列标签分析。农业生物技术学报，2010,18（1）：141–148）在大田种植约90天，块根膨大前期收获直径3～4cm的块根，液氮速冻，-80°C保存。

[0046] 1、块根总RNA提取和纯化

[0047] 取鲁薯3号薯块2g，在液氮中研磨成粉状，加入10mL离心管，用Applygen植物RNA提取试剂盒（Applygen Technologies Inc，Beijing）提取甘薯块根总RNA，试剂盒中包括：Plant RNA Reagent，植物组织裂解、分离RNA、去除植物多糖和多酚；Extraction Reagent，有机抽提去除蛋白质、DNA、多糖和多酚；Plant RNA Aid，去除植物多糖多酚和次生代谢产物。利用QIAGEN Oligotex Mini mRNA Kit（QIAGEN，GmbH，Germany）从总RNA中纯化mRNA。
最后，取1μL于1.2%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，另取2μL稀释至500μL，用紫外分光光度计检测其质量（OD260）和纯度(OD260/OD280)，提取的鲁薯3号的块根总RNA，经非变性胶琼脂糖凝胶电泳检测，28S和18S条带清晰，且二者亮度比值为1.5～2︰1，表明总RNA没有降解，纯化所得mRNA符合实验要求，可用于甘薯IbGlu蛋白cDNA全长的克隆。

[0048] 2、IbGlu蛋白cDNA的全长克隆

[0049] 以本实验室获得的IbGlu EST片段设计引物进行IbGlu蛋白cDNA的全长克隆。

[0050] （1）3′-RACE

[0051] 以鲁薯3号块根cDNA为模板，用IbGlu EST正向引物1及Takara RNA PCR Kit(AMV).3.0中的M13Primer M4引物2作为反向引物进行PCR反应。引物序列如下：

[0052] 引物1：5’TCCGCCGTTGGATTGCTC3’

[0053] 引物2：5’GTTTTCCCAGTCACGAC3’

[0054] PCR得到的3′RACE片段，回收后连接pGEM T-Easy载体进行TA克隆，以SP6/T7通用引物进行测序。

[0055] （2）5′-RACE

[0056] 以鲁薯3号块根cDNA为模板，用IGluEST正向引物3和正向引物4及反向引物5、反向引物6(反向引物5、反向引物6序列参照Invitrogen5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends,Version2.0)进行PCR反应。其中正向引物3在引物4的下游。引物序列如下：

[0057] 引物序列如下：

[0058] 引物3：5’GCCGGCGGAATTGGGGTTGGGCTC3’

[0059] 引物4：5’CGAGTAAAGGTAGGTTGTTTTGG3’

[0060] 引物5：5’GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG3’

[0061] 引物6：5’GGCCACGCGTCGACTAGTAC3’

[0062] PCR得到的5′RACE片段，回收后连接pGEM T-Easy载体进行TA克隆，以SP6/T7通用引物进行测序。

[0063] （3）PCR扩增IbGlu蛋白cDNA的编码区

[0064] 利用DNAMAN6.0软件拼接候选的甘薯IbGlu蛋白cDNA序列。进一步设计正向引物7和反向引物8进行PCR扩增IbGlu蛋白cDNA的编码区。引物序列如下：

[0065] 引物7：5’ATTACCTCATGGCTCTGC3’（序列3）

[0066] 引物8：5’GCCCATTCTCTTATTCTCTG3’（序列4）

[0067] 以鲁薯3号块根总RNA经Oligo(dT)反转录为模板，用引物7、引物8、高保真的KOD酶，进行PCR扩增，PCR条件为94℃5min，随后60℃30min和72℃2min30s进行34个循环，最后72℃延伸5min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，获得1029bp长度的PCR产物。

[0068] 经过测序，该PCR产物具有序列表中序列1自5’末端第41-1188位核苷酸所示的核苷酸，该序列所示的基因命名为IbGlu，该基因的编码区为序列表中序列1自5′端第49-1080位核苷酸；序列表中序列1由1541个碱基组成；该基因编码的蛋白命名为IbGlu，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2；序列表中序列2由343个氨基酸残基组成。

[0069] 实施例2、IbGlu蛋白在提高植物抗虫性中的应用

[0070] 一、转IbGlu甘薯的获得

[0071] 1、重组载体pCBIbGlu的构建

[0072] 根据甘薯IbGlu蛋白cDNA的编码序列，设计扩增出完整编码序列的引物序列，正反向引物分别引入BamH I和Sac I酶切位点，引物序列如下：

[0073] 引物9：5’CGGGATCCATTACCTCATGGCTCTGC3’（序列5）（下划线部分为BamH I酶切位点），

[0074] 引物10：5’TTCGAGCTCGCCCATTCTCTTATTCTCTG3’（序列6）（下划线部分为Sac I酶切位点）。

[0075] 以人工合成的序列表中序列1为模板，用引物9和引物10进行PCR扩增，得到1165bp的PCR产物，将PCR产物连接到pGEM-TEasy载体（购自北京泽平科技有限责任公司，产品目录号为A1360）上，命名为pGIbGlu载体，进行T7/sp6的测序，该PCR产物具有序列表中序列1自5’末端第41-1188位核苷酸；保证甘薯IbGlu蛋白cDNA的阅读框及酶切位点的正确。

[0076] 用Sac I和BamH I酶切载体pCBGUS，回收12926bp载体大片段；同时，用Sac I和BamH I酶切载体pGIbGlu，回收约1.2kb中间片段；将回收12926bp载体大片段与约1.2kb中间片段连接，得到重组载体pCBIbGlu。

[0077] 将重组载体pCBIbGlu转化大肠杆菌DH5a（购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CD201-01），37℃培养20h，进行重组载体的PCR分析和酶切鉴定，并进行测序验证。测序结果表明，重组载体pCBIbGlu为将序列表中序列1自5′端第41位-第1188位所示核苷酸插入载体pCBGUS的BamH I和Sac I酶切位点（替换掉gusA报告基因）间得到的载体。

[0078] 上述pCBGUS载体是通过包括如下步骤的方法得到的：

[0079] （1）将pCAMBIA1301载体（购自CAMBIA公司）经过Hind III和EcoR I双酶切，回收11786bp的载体大片段；

[0080] （2）将pBI121载体（购自Clontech公司；含35S启动子，gusA报告基因，nos终止子片段）也经过Hind III和EcoR I双酶切，回收包含gusA基因的3032bp的片段；

[0081] （3）将步骤（1）中回收的11786bp载体大片段与步骤（2）中回收的包含gusA基因的3032bp的片段经T4DNA酶连接，得到重组载体pCBGUS。

[0082] 2、重组载体pCBIbGlu转化农杆菌

[0083] (1)从-80℃低温冰箱中取出200μLEHA105感受态细胞（购自北京拜尔迪生物技术有限公司），置冰上融化，加入1μg上述步骤1得到的重组载体pCBIbGlu，混匀；

[0084] (2)液氮冷冻1min，37℃温育5min；

[0085] (3)加入800μL LB液体培养基，28℃培养2-6h；

[0086] (4)取100μL菌液至LB固体培养基上（含100μg/mL利福平(Rif)、25μg/mL卡那霉素(Kan)），涂布均匀，将培养皿封口。倒置培养皿28℃培养2d；

[0087] (5)PCR鉴定呈阳性（引物9和引物10进行扩增，得到1165bp为阳性）的单菌落命名为EHA105/pCBIbGlu；将EHA105/pCBIbGlu接种到含有100μg/mL Rif、25μg/mL Kan的LB液体培养基中，28℃培养30h至对数生长期，取适量农杆菌用液体MS培养基稀释30倍备用，即得到EHA105/pCBIbGlu农杆菌菌液。

[0088] 3、转IbGlu甘薯的获得

[0089] 1）转化

[0090] 用农杆菌介导的方法将IbGlu cDNA的编码序列导入到甘薯品种徐薯18（以下也称为野生型甘薯）中，具体方法如下：

[0091] (1)选取经过悬浮培养约3d、直径0.7-1.3mm的甘薯品种徐薯18胚性细胞团，悬浮于上述步骤2制备好的EHA105/pCBIbGlu农杆菌菌液中，5min后将菌液吸出，并用含有30mg/l AS（乙酰丁香酮）和2.0mg/l2,4-D的MS液体培养基洗涤2次。将侵染过的胚性细胞团接种培养在固体培养基（30mg/l AS、2.0mg/l2,4-D的MS）上。28℃、黑暗，共培养3d。

[0092] 甘薯品种徐薯18胚性细胞团的制备方法如下：

[0093] 剥取长约0.5mm的甘薯品种徐薯18的茎尖组织(带1-2片叶原基)，将其在胚性愈伤组织诱导培养基（添加2.0mg/L2,4-D、3.0%蔗糖和0.8%琼脂的MS培养基(pH5.8)上培养,在温度为27℃、黑暗条件下培养8周后，将诱导得到的胚性愈伤组织转入液体培养基，该液体培养基除不加琼脂外，其余成分与上述胚性愈伤组织诱导培养基相同。将三角瓶放在水平摇床上以100r/min进行振荡培养，培养条件为：27℃，每天13h、500lx光照，悬浮培养每10天继代1次。

[0094] (2)将共培养3d后的胚性细胞团用含有500mg/l Carb和2.0mg/l2,4-D的MS液体培养基洗涤2次后，将胚性细胞团转至含有2.0mg/l2,4-D、100mg/l Carb和5-20mg/l Hyg的固体MS培养基上进行选择培养，培养条件为27±1℃、黑暗，每2周继代培养1次。经过10-12周选择培养，将其转移至含有1.0mg/lABA和100mg/l Carb的MS固体培养基上进行体细胞胚诱导，培养条件为27±1℃、每日13h、3000lx的光照。2-4周后，将抗性愈伤组织转移至MS基本培养基上，培养条件为27±1℃、每日13h、3000lx的光照，4-8周后，形成完整的再生植株，得到T0代转IbGlu甘薯植株。

[0095] 采用同样的方法将空载体pCBGUS转入野生型甘薯中，得到转空载体甘薯植株。

[0096] 2）分子鉴定

[0097] 用CTAB法提取T0代转IbGlu甘薯、转空载体甘薯和野生型甘薯叶片的基因组DNA作为模板，用常规方法进行PCR检测，所使用的IbGlu基因引物为：primer1：5 ′ATGCTTCTCCACCTCATCACC3 ′ 和 primer2：5 ′ TTGCCCAGCTATCTGTCACTT3 ′。 在
0.2mlEppendorf离 心 管 中 加 入 10×PCR buffer2μl、4dNTP(10mol/L)1μl、引 物(10μmol/l)均为1μl、模板DNA（50ng/ul）2μl、Taq DNA聚合酶1ul，加H2O至总体积
20μl。反应程序为94℃变性4min，60℃复性1min，72℃延伸2min，共36个循环。

[0098] 电泳检测扩增结果见图1（泳道M为Maker，泳道W为野生型甘薯植株；泳道P为阳性对照（重组质粒pCBIbGlu）；泳道C为转空载体甘薯植株；泳道1-泳道13为T0代转IbGlu甘薯植株）,可以看出，得到1231bp的为阳性T0代转IbGlu甘薯植株，除4、7、12以外的其余T0代转IbGlu甘薯植株均为阳性T0代转IbGlu甘薯植株；表明IbGlu基因已经整合到徐薯18的基因组中，并证明这些再生植株为阳性转基因植株；转空载体甘薯植株和野生型甘薯植株均没有目的片段。

[0099] 将经鉴定为阳性的编号为1、2、3、6、10、13、14的T0代转IbGlu甘薯植株扩繁，并进行隔离大田种植，收获编号为1、2、3、6、10、13、14的转IbGlu甘薯薯块进行茎线虫接种鉴定。

[0100] 二、转IbGlu甘薯的抗虫验证

[0101] 1、转基因植株块根的室内茎线虫接种鉴定

[0102] 将收获得到的编号为1、2、3、6、10、13、14的转IbGlu甘薯块根进行甘薯茎线虫 (Gao S,Yu B,Yuan L，Zhai H,He SZ,Liu QC(2011):Production of transgenic sweetpotato plants resistant to stem nematodes using oryzacystatin-I gene.Scientia Horticulturae,128:408-414;公众可从中国农业大学获得)接种，以鉴定其对甘薯茎线虫病的抗性。以转空载体甘薯块根和野生型甘薯块根为对照。

[0103] 线虫接种方法参照于波（2007）中国农业大学博士学位论文中的方法，具体方法如下：

[0104] （1）甘薯茎线虫的增殖培养和分离

[0105] 1）用浅盘法分离出线虫，在烧杯中室温沉淀，然后转入1.5ml离心管中，5000rpm室温离心2min，收集线虫，在显微镜下观察线虫口针和尾部来确认甘薯茎线虫。

[0106] 2）用1ml100mg l-1Str消毒15min，反复轻摇使线虫与Str充分混合接触。

[0107] 3）5000rpm，室温下离心2min，弃掉Str，用灭菌水清洗3次，每次5000rpm室温下离心2min。收集的线虫4℃灭菌水保存。

[0108] 4）取10μl线虫加入90μl水稀释10倍，在显微镜下计数，重复3次确定收集线虫的浓度，以雌虫、雄虫和幼虫总和作为虫量。

[0109] 5）将编号为1、2、3、6、10、13、14的转IbGlu甘薯块根及野生型甘薯块根用自来水洗净甘薯块根表面的泥土，然后用70%乙醇清洗块根进行表面消毒。每个株系各取3个块根作为重复。

[0110] 6）用打孔器在甘薯块根中部打孔，用枪头将500条甘薯茎线虫注入孔中，将打孔器中的薯条插入孔中，用熔化的石蜡封口。25℃培养，30d。

[0111] (2)室内茎线虫接种鉴定

[0112] 接种培养30d后，沿着接种孔切开横切面，观察、统计转IbGlu甘薯块根和野生型甘薯块根的感病面积。

[0113] 甘薯茎线虫病抗性的鉴定方法参照谢逸萍等（2002），对感病面积进行分级，根据病情指数来确定转基因株系的抗病性：

[0114] 1）薯块发病程度

[0115] 以薯块横切面发病程度分级

[0116] 0级：无病症；

[0117] 1级：发病面积占横切面的25%以下；

[0118] 2级：发病面积占横切面的25%-50%；

[0119] 3级：发病面积占横切面的50%-75%；

[0120] 4级：发病面积占横切面的75%以上。

[0121] 2）病情指数和防治效果：

[0122] 病情指数和防治效果按照下列公式计算：

[0123] 病情指数=[∑（各级病块数×相应病级数）/（调查总薯数×最高病级数）]×100%[0124] 防治效果=[（1-病情指数）/对照病情指数]×100%

[0125] 根据防治效果划分其抗性如表1所示：

[0126] 表1为防治效果划分其抗性结果图

[0127]

[0128] 编号为1、2、3、6、10、13、14的转IbGlu甘薯块根和野生型甘薯块根（CK）进行室内茎线虫接种结果如图2所示，具体病斑大小统计见表1。

[0129] 表1为转IbGlu基因甘薯块根室内茎线虫接种鉴定结果

[0130]

[0131] 转空载体甘薯块根和野生型甘薯块根的结果无显著差异。

[0132] 结果表明，同野生型甘薯植株相比，转IbGlu甘薯植株的块根表现出明显的甘薯茎线虫抗性，其中株系号为3、6、10、13、14转基因植株抗病类型为中抗，说明导入IbGlu基因可以提高甘薯对茎线虫病的抗性。