一种线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒及其应用

摘要

本发明涉及一种可以同时检测61个SNP位点的线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒。该试剂盒根据线粒体系统发育树，结合中国人群的遗传特点，精选出61个多态性高，突变率低，分型能力强的SNP位点，包含编码区位点54个，控制区位点7个，采用特异性引物对这61个SNP位点进行检测。该试剂盒作为一个线粒体检测系统，分为三管同时扩增，同时电泳，单倍型多样性达到98.6%，可以作为继常染色体STR、Y染色体STR后的同一母系鉴定试剂盒。

权利要求

1.一种线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：包括有用于扩增如下61个SNP位点的引物：G10398A、Norm9bpDel、C10873T、A3010G、A709G、C7196A、C12705T、C3970T、G13104A、G10310A、C5178A、G13928C、G6446A、C8414T、C8794T、C8793T、C16126T、G16129A、A15043G、C16311T、A8701G、A8697G、C4883T、C10400T、(CA)n、G1719A、C14668T、C12811T、C,T9824A、C9698T、A9123G、C7028T、G11719A、G8584A、A11251G、G8020A、G5460A、G2706A、C11215T、T4216C、G12372A、C16362T、C1541T、C8684T、G9477A、A4491G、G1811A、G16316A、A16319G、G9545A、C11944T、C152T、G14569A、C8964T、G10397A、G3348A、G4833A、G7600A、G5417A、C5442T、C15784T；

所述的引物的序列如下所示：A709G,SEQ ID NO.1-3；A3010G,SEQ ID NO.4-6；

C5178A,SEQ ID NO.7-9；Norm9bpDel,SEQ ID NO.10-11；G10398A,SEQ ID NO.12-14；

C10873T,SEQ ID NO.15-17；C12705T,SEQ ID NO.18-20；G13928C,SEQ ID NO.21-23；

C16311T,SEQ ID NO.24-26；A15043G,SEQ ID NO.27-29；C3970T,SEQ ID NO.30-32；

C8414T,SEQ ID NO.33-35；G6446A,SEQ ID NO.36-38；C7196A,SEQ ID NO.39-41；

G10310A,SEQ ID NO.42-44；G13104A,SEQ ID NO.45-47；C8793T 和 C8794T,SEQ ID NO.48-51；C16126T和G16129A,SEQ ID NO.52-55；C4883T,SEQ ID NO.56-58；C10400T,SEQ ID NO.59-61；(CA)n,SEQ ID NO.62-63；G11719A,SEQ ID NO.64-66；G1719A和C1541T,SEQ ID NO.67-71；G8584A和A8701G和A8697G,SEQ ID NO.72-77；A9123G,SEQ ID NO.78-80；

C7028T,SEQ ID NO.81-83；C14668T,SEQ ID NO.84-86；G2706A,SEQ ID NO.87-89；

G12372A,SEQ ID NO.90-92；T4216C,SEQ ID NO.93-95；A11251G 和 C11215T,SEQ ID NO.96-100；G5460A,SEQ ID NO.101-103；C12811T,SEQ ID NO.104-106；G8020A,SEQ ID NO.107-109；C,T9824A,SEQ ID NO.110-112；C9698T,SEQ ID NO.113-115；C16362T,SEQ ID NO.116-118；C152T,SEQ ID NO.119-121；G1811A,SEQ ID NO.122-124；A4491G,SEQ ID NO.125-127；G4833A,SEQ ID NO.128-130；G5417A 和 C5442T,SEQ ID NO.131-135；

G7600A,SEQ ID NO.136-138；C8684T,SEQ ID NO.139-141；C8964T,SEQ ID NO.142-144；

G9477A 和 G9545A,SEQ ID NO.145-149；G10397A,SEQ ID NO.150-152；G3348A,SEQ ID NO.153-155；C11944T,SEQ ID NO.156-158；G14569A,SEQ ID NO.159-161；C15784T,SEQ ID NO.162-164；G16316A和A16319G,SEQ ID NO.165-168；

引物在扩增体系中的终浓度是：

2.根据权利要求1所述的线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，所述的引物是分组标记的，G10398A、Norm9bpDel、C10873T、A3010G、A709G、C7196A、C12705T、C3970T、G13104A、G10310A、C5178A、G13928C、G6446A、C8414T、C8794T、C8793T、C16126T、G16129A、A15043G、C16311T位点对应的引物为第一组；A8701G、A8697G、C4883T、C10400T、(CA)n、G1719A、C14668T、C12811T、C,T9824A、C9698T、A9123G、C7028T、G11719A、G8584A、A11251G、G8020A、G5460A、G2706A、C11215T、T4216C、G12372A、C16362T、C1541T位点对应的引物为第二组；C8684T、G9477A、A4491G、G1811A、G16316A、A16319G、G9545A、C11944T、C152T、G14569A、C8964T、G10397A、G3348A、G4833A、G7600A、G5417A、C5442T、C15784T位点对应的引物为第三组。

3.根据权利要求1所述的线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，所述的引物中的正向引物是荧光标记的。

4.权利要求1所述的线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒在案件排查、亲子鉴定及尸源认定中的应用。

说明书

一种线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物体外诊断技术领域，集中体现的是第三代遗传标记SNP（单核苷酸多态性，single nucleotide polymorphism）和荧光检测技术的联合应用，能够利用相对微量的DNA模板快速确定样本的mtDNA单倍型类群，适用于线粒体DNA母系鉴定。

背景技术

[0002] 目前法医学上用于个体识别的试剂盒都是检测常染色体STR遗传标记，由于它们之间不存在连锁关系且不同遗传标记的等位基因间不存在关联，所以个人识别时常染色体的总匹配概率是各遗传标记的匹配概率的乘积，因此进行个体识别时不需要无限地增加遗传标记，一定数量的遗传标记就可以满足法医学检测的要求。而应用于法医学实践的线粒体遗传标记呈单倍型遗传，整个线粒体基因组相当于一个遗传标记，因此线粒体DNA遗传标记的个人识别能力不能通过乘积来计算，要提高线粒体的个人识别能力，唯一的办法就是在mtDNA中发现并应用更多的多态遗传标记以覆盖更多的单倍群类型。

[0003] 目前，用于mtDNA SNP检测方法主要有SnaPshot检测法、探针杂交显色法、直接测序法等，SnaPshot检测技术指的是基于剑桥标准序列，每个SNP设计3条引物，其中2条是目的片段的扩增，长度在200－500bp左右，Tm值在60度左右。第3条的引物的是延伸ddNTP，设计在SNP位点的上游或者是反向的下游。先富集得到目的片段，经酶消化去除多余的dNTP，引物和其他单链DNA产物后再进行单碱基延伸反应，反应产物再次经过酶处理后进行毛细管电泳检测得到位点的SNP信息。这种方法引物设计简单，合成容易价格便宜。但这种方法也有明显的局限性：部分纯化用的消化酶价格昂贵；操作步骤繁琐，工作量大；
引物结合区存在未知突变的位点检测成功率低，具体表现在线粒体控制区位点检测成功率低。

[0004] 目前法医学上对线粒体SNP的研究主要采用直接测序法，主要检测mtDNA控制区（HV I和HV II区），这段序列处于mtDNA复制控制区长度约1122bp，由于其不编码蛋白质，因此在进化过程中选择压力小，决定其相比其他区域有更高的多态性。显然对这段高变区序列测序可以获得大量的信息，但由于该区域本身为突变热点区，存在遗传不稳定性，所以特异性尚显不够。研究发现增加编码区的特定多态性位点，能有效扩大线粒体单倍群的检测范围，能显著提高线粒体的同一母系鉴定能力。全序列测序理论上是最好的方法，但进行mtDNA全序列测序，工作量大，技术要求较高，难于推广，不适合在现有法医实验室中展开大规模的应用。

[0005] 线粒体DNA研究的专利几乎集中在对线粒体疾病的探讨上，而在母系鉴定方面很少涉及，仅有的一篇《一种检测线粒体基因单倍型类群的方法及应用》采用的是寡核苷酸探针的方法，实时定量检测方法具有灵敏度高，特异性好，但同时存在通量低，引物探针设计复杂等缺点，不适合进行大样本检测。

发明内容

[0006] 线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒的出现，为高效快速检测单核苷酸突变提供了途径。通过建立mtDNA高变区和编码区联合检测的模式，可以建立一种快速、高效、可靠的mtDNA单倍型分型策略和检测方法。和现有的STR试剂盒操作方法相同，符合当前法医实验室人员技术水平，且适合大样本检测，具有很大的应用前景。

[0007] 本发明的目的是提供一种线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒，采用四色荧光标记技术，特异性荧光引物扩增结合毛细管电泳检测，以FAM、HEX、TAMRA、SIZ荧光信号为检测信号。通过遗传测序仪对荧光信号的收集来检测特定的mtDNA突变，因此本发明在之前申请的35个SNP位点（专利公开号：CN103290108A）的基础上增加至61个位点，可以有效覆盖更多的单倍群类型。

[0008] 技术方案是：

[0009] 一种线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒，包括有用于扩增如下61个SNP位点的引物：G10398A、Norm9bpDel、C10873T、A3010G、A709G、C7196A、C12705T、C3970T、G13104A、G10310A、C5178A、G13928C、G6446A、C8414T、C8794T、C8793T、C16126T、G16129A、A15043G、C16311T、A8701G、A8697G、C4883T、C10400T、(CA)n、G1719A、C14668T、C12811T、C,T9824A、C9698T、A9123G、C7028T、G11719A、G8584A、A11251G、G8020A、G5460A、G2706A、C11215T、T4216C、G12372A、C16362T、C1541T、C8684T、G9477A、A4491G、G1811A、G16316A、A16319G、G9545A、C11944T、C152T、G14569A、C8964T、G10397A、G3348A、G4833A、G7600A、G5417A、C5442T、C15784T。

[0010] 进一步地，上述的引物优选如下：

[0011] A709G,SEQ ID NO.1-3;A3010G,SEQ ID NO.4-6;C5178A,SEQ IDNO.7-9;Norm9bpDel,SEQ ID NO.10-11;G10398A,SEQ ID NO.12-14;C10873T,SEQ
ID NO.15-17;C12705T,SEQ IDNO.18-20;G13928C,SEQ ID NO.21-23;C16311T,SEQ ID NO.24-26;A15043G,SEQ IDNO.27-29;C3970T,SEQ ID NO.30-32;C8414T,SEQ ID NO.33-35;G6446A,SEQ ID NO.36-38;C7196A,SEQ ID NO.39-41;G10310A,SEQ ID
NO.42-44;G13104A,SEQ ID NO.45-47;C8793T 和 C8794T,SEQ ID NO.48-51;C16126T和 G16129A,SEQ ID NO.52-55;C4883T,SEQ IDNO.56-58;C10400T,SEQ ID
NO.59-61;(CA)n,SEQ ID NO.62-63;G11719A,SEQ ID NO.64-66;G1719A 和 C1541T,SEQ ID NO.67-71;G8584A 和 A8701G 和 A8697G,SEQ ID NO.72-77;A9123G,SEQ ID
NO.78-80;C7028T,SEQ ID NO.81-83;C14668T,SEQ ID NO.84-86;G2706A,SEQ ID
NO.87-89;G12372A,SEQ ID NO.90-92;T4216C,SEQ ID NO.93-95;A11251G和C11215T,SEQ ID NO.96-100;G5460A,SEQ ID NO.101-103;C12811T,SEQ ID NO.104-106;G8020A,SEQ ID NO.107-109;C,T9824A,SEQ ID NO.110-112;C9698T,SEQ ID NO.113-115;C16362T,SEQ ID NO.116-118;C152T,SEQ ID NO.119-121;G1811A,SEQ ID NO.122-124;A4491G,SEQ ID NO.125-127;G4833A,SEQ ID NO.128-130;G5417A 和 C5442T,SEQ
IDNO.131-135;G7600A,SEQ ID NO.136-138;C8684T,SEQ ID NO.139-141;C8964T,SEQ IDNO.142-144;G9477A 和 G9545A,SEQ ID NO.145-149;G10397A,SEQ ID
NO.150-152;G3348A,SEQ ID NO.153-155;C11944T,SEQ ID NO.156-158;G14569A,SEQ ID NO.159-161;C15784T,SEQ ID NO.162-164;G16316A和A16319G,SEQ ID NO.165-168。

[0012] 以上的引物中，C8793T和C8794T、C16126T和G16129A、G16316A和A16319G、G11719A和G1719A、G8584A和A8701G和A8697G、A11251G和C11215T、C,T9824A和C9698T、G5417A和C5442T、G9477A和G9545A位点共用同一个正向引物。

[0013] 进一步，以上的引物是分组标记的，G10398A、Norm9bpDel、C10873T、A3010G、A709G、C7196A、C12705T、C3970T、G13104A、G10310A、C5178A、G13928C、G6446A、C8414T、C8794T、C8793T、C16126T、G16129A、A15043G、C16311T位点对应的引物为第一组；A8701G、A8697G、C4883T、C10400T、(CA)n、G1719A、C14668T、C12811T、C,T9824A、C9698T、A9123G、C7028T、G11719A、G8584A、A11251G、G8020A、G5460A、G2706A、C11215T、T4216C、G12372A、C16362T、C1541T位点对应的引物为第二组；C8684T、G9477A、A4491G、G1811A、G16316A、A16319G、G9545A、C11944T、C152T、G14569A、C8964T、G10397A、G3348A、G4833A、G7600A、G5417A、C5442T、C15784T位点对应的引物为第三组。以上所述的“第一”、“第二”和“第三”不构成对先后次序的限制。

[0014] 其中，9824位点存在有碱基是C、T或者A的情况，在本发明中描述为C,T9824A。

[0015] 进一步，以上引物中的正向引物是荧光标记的。

[0016] 进一步，以上引物中第一组的正向引物是由FAM标记的；第二组的正向引物是由HEX标记；第三组的正向引物是由TAMRA标记。

[0017] 本发明还提供了上述试剂盒的使用方法，具体的技术方案是：

[0018] 一种线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

[0019] S1：从生物检材提取线粒体DNA，作为mt DNA模板；所述的生物检材可以是毛发、烟蒂、牙齿、脱落细胞、骨骼、血液、精斑、唾液等；以上的DNA提取方法DNA的方法可以是磁珠法、Chelex-100提取法、硅膜法等经简单定量后稀释到合适浓度；

[0020] S2：配制PCR反应液，加入反应缓冲液、Taq酶、复合引物、水，DNA模板，采用三步扩增法，对样本进行扩增；

[0021] S3：对扩增产物进行电泳，软件分析电泳结果并进行单倍型类群分型。电泳时需在跑样板孔中加入去离子甲酰胺、分子量内标；内标的作用是用于电泳过程中的内标指示。还可以加入等位基因分型标准物，用来与未知样品比对确定基因型。

[0022] 以上试剂盒在案件排查、亲子鉴定及尸源认定中的应用。

[0023] 有益效果

[0024] 1、线粒体DNA分为控制区和编码区，其中控制区的HVI及HVII区突变率较高，为当前法医线粒体主要检测的部分，但有研究表明，HV I的随机偶合概率为2%，HV II为4%，仅仅依靠控制区有时很难将两个无关个体区分开来，故本发明在位点的选取上合理避开了这一缺点，采用了54个编码区和7个控制区位点联合检测，把控制区的位点高突变率和编码区位点稳定遗传的特点相结合，大大增加试剂盒的鉴别能力，优化复合扩增SNP位点的多重PCR体系；并将DNA复合扩增与毛细管电泳技术相结合，极大地提高了检验速度和效率，完全超越了现有检测方法的检测速度，可以成为案件检验和数据库建设的主要检测方法。

[0025] 2、本发明方法设计合理，建立了一种新型的利用荧光标记引物特异性扩增结合毛细管电泳技术的mtDNA单倍型类群分型方法；

[0026] 3、样本适应性强，对于一些DNA提取量很少的检材，如骨骼、牙齿和毛发，本试剂盒仍可以较好的进行检测。甚至检材非常陈旧或严重降解时，细胞质中的mt DNA依旧是可靠的检测物质，这得益于细胞中mt DNA拷贝数多，且被双层细胞壁包裹着，不易降解；

[0027] 4、本试剂盒对SNP的检测片段大小控制在325bp以内，使得检测成功率大大提高。传统STR检测失败的情形仍可以成功分型；

[0028] 5、应用本发明的线粒体SNP荧光检测试剂盒进行母系鉴定，较传统的测序方法成本低、操作简便，数据分析简单，可以在3～4小时内得出实验结果，因此可以在大规模尸源认定、亲子鉴定、人类起源及进化研究中得到广泛应用。

附图说明

[0029] 图1是线粒体SNP61个位点排布图及内标siz-500片段大小的位置示意图；

[0030] 图2是SNP位点和邻近位点对应引物设计原理示意图；

[0031] 图3a是异质性位点试剂盒检测图谱；

[0032] 图3b是异质性位点试剂盒测序图谱；

[0033] 图4a是sister I姐妹关系鉴定图谱；

[0034] 图4b是sister II姐妹关系鉴定图谱；

[0035] 图5a是标准品9947A检测图谱；

[0036] 图5b是经人工改造与9947A分型互补的DNA模板的检测图谱。

具体实施方式

[0037] 下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0038] 实施例1本发明线粒体SNP位点的选取、分组、引物设计及反应体系的建立[0039] 1、SNP位点筛选

[0040] 参考线粒体系统发育树（mtDNA tree Build16(19Feb2014))，结合中国人群线粒体DNA遗传特点，筛选出主要线粒体基因单倍型类群及其亚型的特征性位点；根据中国人群mtDNA单倍型类群分型树结合线粒体在中国人群中的多态性调查和文献调研、数据库分析最后筛选出61个mtDNA特征性位点，均具有较高GD值，涵盖了中国人群主要mtDNA单倍型类群及其主要亚型。其中73.7%的位点GD值位于0.2以上，最大值达到了0.5。保证人类线粒体DNA检验系统的鉴别能力（入选本发明的61个位点及GD值见附表3）。

[0041] 基因多样性（GD），按公式GD=N（1-∑Pi2）/（N-1）计算，n为样本例数，Pi为等位基因频率。

[0042] 表1本发明涉及的所有61个位点的等位基因及位点GD值

[0043]SNP位点 等位基因 GD值 SNP位点 等位基因 GD值
10398 G,A 0.50 11719 G,A 0.22
9bp DEL,NORM 0.30 8584 G,A 0.24
10873 T,C 0.45 11251 A,G 0.09
3010 G,A 0.32 8020 G,A 0.28
709 G,A 0.27 5460 G,A 0.22
7196 C,A 0.03 2706 G,A 0.19
12705 C,T 0.50 11215 C,T 0.23

[0044]3970 C,T 0.21 4216 T,C 0.09
13104 G,A 0.12 12372 G,A 0.14
10310 G,A 0.13 16362 C,T 0.36
5178 C,A 0.20 1541 C,T 0.30
13928 G,C 0.21 9698 C,T 0.17
6446 G,A 0.25 8684 T,C 0.23
8414 C,T 0.18 9477 G,A 0.23
8794 C,T 0.34 4491 A,G 0.14
8793 C,T 0.30 1811 G,A 0.16
15043 A,G 0.41 16319 G,A 0.18
16311 C,T 0.30 16316 G,A 0.19
16129 A,G 0.27 9545 G,A 0.40
16126 C,T 0.25 11944 C,T 0.12
8701 A,G 0.45 152 C,T 0.43
8697 A,G 0.50 14569 G,A 0.14
4883 C,T 0.20 8964 C,T 0.16
10400 C,T 0.39 10397 G,A 0.44
CA 3,4,5,6,7,8 0.51 3348 G,A 0.04
1719 G,A 0.34 4833 G,A 0.11
14668 C,T 0.18 7600 G,A 0.12
12811 C,T 0.42 5417 G,A 0.14
9824 T,C,A 0.35 5442 C,T 0.18
9123 A,G 0.11 15784 C,T 0.24
7028 CT 0.19

[0045] 注：Norm指序列长度正常的等位基因，Del指缺失9bp碱基的等位基因。

[0046] 2、引物设计

[0047] 在确定了SNP位点之后，根据突变位点设计特异性检测引物（试剂盒特征性位点引物序列见表2）。通过设置人工突变，对每条引物的人工突变最佳位置进行了逐一摸索，并构建出各SNP位点对应的质粒进行引物测试和筛选，最后保留效率高且特异性强的引物，用来组配复合扩增体系。

[0048] 各引物设计原理如图2所示，除个别邻近位点如（C8793T和C8794T）、（C16126T和G16129A）、（G11719A和 G1719A）、（G8584A 和A8701G和A8697G）、（A11251G和 C11215T）、（C,T9824A和C9698T）、（G5417A和C5442T）、（G9477A和G9545A）位点采用共用标记引物同时检测外，其余位点均有各自对应的标记引物，每一个SNP位点的引物是根据修正后的剑桥参考序列(revised Cambridge Reference Sequence,rCRS)NC_012920.1进行设计，其中一条F-primer的5’端用相应的荧光素进行标记，另外两条非标记引物的3’端对等位基因序列特异识别，两条非标引物的其中任一条5’端引入3～4个和模板不配对核苷酸，一般添加“TATA”碱基，对引物TM值影响最小。由于两条非标记引物的长度不同导致扩增产物长度不同，电泳迁移速率不同，最终达到检测的目的。

[0049] 由于9bp缺失和(CA)n重复两者的多态性表现为长度多态性，只需要分别设计一条F-primer和非标记引物，就可以根据产物大小不同加于区分。

[0050] 对于大多数的位点，每个位点包括两条非标记引物和一条荧光标记引物，上述两条引物的3’端最后一个碱基对等位基因模板进行特异识别，为了进一步提高扩增特异性，在距3’端2～7个碱基处引入人工错配，人工错配位置离3’端距离不同引物的特异性也不同，经过反复摸索发现，对于荧光效率较高的FAM，HEX荧光素标记的引物，当人工错配在离3’端第2个碱基处时引物错配特异性最好，对于荧光效率差的TAMRA荧光素标记的引物，则将人工错配置于离3’端第3个碱基处效果较好。至于引入什么类型的碱基则遵循如下原则：如果3’端是强错配（T-C、A-G配对），则应引入弱错配（A-C、G-T配对）；如果3’端是中度错配（A-A、G-G、C-C、T-T配对），则就引入中度错配；如果3’端是弱错配，则应引入强错配。另外，为了提高等位基因的识别度，两条非标记引物通过在5’端外挂3～4个碱基使扩增产物存在长度差异，各位点的等位基因则可以通过扩增产物长度不同达到区分的目的。考虑到后续引物复合扩增的需要，在此设计的引物Tm值均在62～64℃之间（TM值计算方法是最邻近法(the nearestneighbor method)）。

[0051] 表2各个位点对应的引物

[0052]

[0053]

[0054]

[0055]

[0056] 由于每条引物效率之间存在差异，至使每条引物要达到同样的扩增峰值时在体系中的加量不同，各引物的合适工作浓度采用引物浓度梯度实验进行摸索，最终获得了各引物的工作浓度，如表3所示。

[0057] 复合引物中每条引物的工作浓度是通过引物浓度梯度实验获得，每条引物浓度从0.01μM至0.2μM做浓度梯度，梯度间隔为0.02μM，做单扩获得一个较大的引物浓度范围然后组复扩引物复测试进一步微调引物浓度，最重要的指标是不能出现非特异峰；根据检测结果，选择峰高RFU在2000～2500之间的引物浓度作为优选。

[0058] 表3试剂盒各位点的引物的在扩增体系中的终浓度

[0059]

[0060]

[0061] 3、荧光标记复合扩增体系的SNP组合方案设计

[0062] 本发明提供的试剂盒中，每个SNP位点的对应的上游引物(F-primer)可以通过同位素、荧光素进行标记，比较发现荧光素标记效果较好。对应的下游引物(R-primer)是未被标记的引物。

[0063] 本发明对荧光染料进行了鉴别、遴选，选用了蓝、绿、黑、橙四种荧光标记物，构建了四色荧光组合方案。

[0064] 在确定4色荧光组合方案的基础上，通过大量反复实验，遵循引物效率高的使用荧光效率低的荧光素标记如TAMRA，引物效率低的使用荧光效率高的荧光素标记如FAM，引物效率持中的标记为HEX的原则。摸索出61个SNP位点组合方式以及各位点的荧光标记类型，将61个SNP位点分成3组，分子量内标用橙色的荧光染料SIZ进行标记。最终确定的荧光染料标记的组合为：其中G10398A、Norm9bpDel、C10873T、A3010G、A709G、C7196A、C12705T、C3970T、G13104A、G10310A、C5178A、G13928C、G6446A、C8414T、C8794T、C8793T、C16126T、G16129A、A15043G、C16311T这20个位点的F-primer是由FAM标记。A8701G、A8697G、C4883T、C10400T、(CA)n、G1719A、C14668T、C12811T、C,T9824A、C9698T、A9123G、C7028T、G11719A、G8584A、A11251G、G8020A、G5460A、G2706A、C11215T、T4216C、G12372A、C16362T、C1541T这23个位点的F-primer是由HEX标记。C8684T、G9477A、A4491G、G1811A、G16316A、A16319G、G9545A、C11944T、C152T、G14569A、C8964T、G10397A、G3348A、G4833A、G7600A、G5417A、C5442T、C15784T这18个位点的F-primer是由TAMRA标记。按此分组方式一方面可以尽可能多的排布位点，覆盖更多的单倍型类群；另一方面能够使得因引物之间相互作用而产生的非目的条带在软件监测范围之外，在实际使用中，将FAM色标记的引物及其对应非标引物配制为FAM色复合引物；同理配制HEX色复合引物和TAMRA色复合引物。内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为SIZ(制备方法参照专利CN101307226中披露的本公司自主研发的siz500荧光标记内标，总共13条荧光标记片段：75bp、100bp、139bp、150bp、160bp、200bp、250bp、300bp、340bp、350bp、400bp、450bp、500bp)。这种SNP位点组合方式使得仅需标记4种荧光就可实现这61个SNP位点同时检测分析。四色排布图见图1。

[0065] 试剂盒中还包括有两套阳性对照，一套是9947A，另一套是与9947A各位点分型互补的人工改造的DNA序列，阳性对照作为每次实验的阳性质控品，用于监控PCR扩增体系的正确性，排除假阴性；阴性对照用于控制配制体系过程的污染情况，排除假阳性。与9947A分型互补的人工序列制备方法如下：先后采用定点突变、融合PCR和克隆技术获得，首先根据9947A的各位点等位基因信息，设计出各位点另一个等位基因的定点突变引物，将突变点置于引物中间，引物TM值约78℃且上下游引物刚好反向互补，这样扩增出各个片段由于含有互补序列，可直接用于下一步融合扩增获得各个片段的融合产物，将融合产物经克隆至pMD18-T转入DH5α中保存，提取质粒即为标准品。

[0066] 本发明的试剂盒中的引物经过严格设计和验证，具有高度的扩增特异性和种属特异性。3、扩增及产物检测

[0067] （1）首先在冰上完成除模板外的PCR反应体系的配制，最后加入模板，模板加入顺序先待检样本后阳性对照和阴性对照，本实施例试剂盒中的Taq酶是采用专利公开号CN101050453中披露的热启动耐高温酶；提取线粒体DNA模板时，最好要将提取的DNA稀释50～100倍，实际操作中，一般可以取1～2μl的mt DNA模板进行扩增。具体加量如表4所示。

[0068] 表4试剂盒扩增体系

[0069]

[0070]

[0071] （2）上述体系配制后瞬时离心，置于热循环仪上，照表5所示的程序进行扩增。

[0072] 表5线粒体SNP检测试剂盒扩增扩增程序

[0073]

[0074] （3）扩增产物检测及结果分析

[0075] 采用DNA变性剂去离子甲酰胺与试剂盒配套的分子量内标（AGCU Marker SIZ-500）按体积比为12：0.5混合组成上样混合液。将12.5μL上样混合液与1μL扩增产物和试剂盒配套的等位基因分析标准物混合，混匀后瞬时离心去除气泡。98℃变性5min后立即冰上放置3min，用遗传分析仪ABI3100进行电泳检测，GeneMapperID v3.2软件对结果进行分析。

[0076] 对标准品9947A和经人工改造与9947A分型互补的DNA模板分别进行扩增的结果如图5a和图5b所示，可以看出各个位点之间的扩增产物峰明显，无其它非特异性扩增产物出现。

[0077] 在图5a中，第一行的各个检测出的位点是：

[0078] 10398、9bp、10873、3010、709、7196、12705、3970、13104、10310、5178、13928、6446、8414、8794、15043、16311、(16126和16129)。

[0079] 第二行的各个检测出的位点是：

[0080] 8701、4883、10400、(CA)n、1719、14668、12811、9824、9123、7028、11719、8584、11251、8020、5460、2706、11215、4216、12372、16362、9698、1541。

[0081] 第三行的各个检测出的位点是：

[0082] 8684、9477、4491、1811、(16316 和 16319)、9545、11944、152、14569、8964、10397、3348、4833、7600、5417、5442、15784。

[0083] 实施例2本发明线粒体SNP检测试剂盒的准确性验证和大样本测试

[0084] 采用实施例1中的引物、分组荧光标记以及扩增体系和参数，进行大样本线粒体SNP检测，共随机选取200个汉族和200个维吾尔族人群样本，样本经过提取后用试剂盒进行扩增，经电泳检测结果显示：汉族主要分型结果D4*,B5,D5a,和D4b2分别占7%,6.5%,4.5%,和4.5%，同样在维吾尔族人群中D4*,T,和W分别占7.5%,7%,和6%。汉族作为古老的华夏族的后代，它的扩散分布符合德米奇扩散模型。在人口爆发时期，它与多个民族之间存在基因交流；对于维吾尔族而言，它们的分型至少有12个单倍型是和欧洲人和其他人种所共有的，这显示出维吾尔族拥有欧洲人和东亚人混合血统。400份样本共分成了
106种单倍型，分辨力达到了98.6%。为了验证试剂盒的准确性，每个位点随机挑选三个样本使用AB公司的BigDye测序试剂盒直接测序，结果显示二者完全一致，充分证明了该试剂盒的准确性，能够用于mtDNA SNP检测分析。

[0085] 实施例3本发明所提供试剂盒对mtDNA SNP位点异质性的检测

[0086] mtDNA异质性的存在，给法医学的同一母系鉴定带来了不确定性，应在实际案件中进行相应的评价。国际法医遗传学会（International Society for Forensic Genetics，ISFG）规定，如果遇到两个样本出现一个碱基不同，而且这个碱基位置被公认是异质性热点，则不能排除；当遇到两个碱基位置不同时，如果两个位置都是异质性热点，则不能排除，否则不能判断；当出现三个位置不同时，可以做出排除结论。本发明所提供试剂盒，不仅可以实现一般SNP位点的检测，而且当位点存在异质性时仍能够成功检测。在实际样本检测中，发现维吾尔族200份样本中某些样本16319位点存在异质性，并采用直接测序方法验证，二者结果一致，试剂盒检测电泳图谱和测序图谱见附图3，其中3a为异质性位点试剂盒检测图谱，3b为异质性位点测序图谱。

[0087] 实施例4本发明所提供试剂盒在母系关系鉴定中的应用

[0088] 本发明所提供的试剂盒在一例疑似姐妹的关系鉴定案件中起到了辅助作用，从母系遗传角度提高了本例母系关系鉴定案件的可信度。

[0089] 1、测定步骤如下：

[0090] （1）收集待鉴定案件中的头发样本：姐妹关系鉴定样本由某法庭科学实验室提供。

[0091] （2）检材线粒体DNA提取：采取DTT消化结合Chelex法提取。

[0092] （3）扩增检测：按照实施例1中试剂盒实施步骤进行线粒体DNA的SNP检测，sister I的分型结果见图4a，sister II的分型结果见图4b，其对比结果见下表6，不同的位点由粗斜体显示出来。

[0093] 表6sister I和sister II的线粒体61个位点基因分型

[0094]

[0095]

[0096] 结果显示：sister I和sister II的线粒体SNP的检测结果61个位点有7个不同，根据线粒体系统发育树进行单倍型分析显示sister I为G型，sister II为C型，结合这两点足可以排除他们来自同一个母系家族的可能。

[0097] 以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。