一种聚乙二醇修饰的rhG-CSF药物组合物及其制备方法

摘要

本发明提供了一种聚乙二醇修饰的rhG-CSF药物组合物及其制备方法。本发明的聚乙二醇修饰的rhG-CSF药物组合物包括以下组分：组分I：N-末端mono-mPEG20000-rhG-CSF，纯度≥95.0％；组分II：选自rhG-CSF、非N-末端mono-mPEG20000-rhG-CSF、di-mPEG20000-rhG-CSF、tri-mPEG20000-rhG-CSF中的一种或几种，0≤含量≤5.0％，且0≤rhG-CSF含量≤3.0％；组分III：mPEG20000，0≤含量≤5.0％；以及残余量杂质，含量＜0.5％。本发明提供的聚乙二醇修饰的rhG-CSF药物活性组合物，各项指标均符合药用要求，质量均一，且体外活性、半衰期、安全性等方面均优于现有技术产品，能够保证聚乙二醇修饰的rhG-CSF制剂的临床疗效及用药安全。

权利要求

1.一种N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，(1) 离子交换色谱法层析：将N-末端mono-mPEG-rhG-CSF粗品用Macro Cap SP离子交换色谱法层析，包括：①上样：将N-末端mono-mPEG-rhG-CSF粗品以缓冲液A稀释上样；

②冲洗：以缓冲液A冲洗1~5个柱体积；

③梯度洗脱：以缓冲液A及缓冲液B梯度洗脱，收集洗脱峰1、2、3；

(2) 分子筛层析：将离子交换层析收集峰2用Superdex 75柱进行分子筛层析，包括：①上样：将收集峰2用缓冲液A上样；

②以缓冲液A洗脱，收集洗脱峰4和洗脱峰5，洗脱峰5即N-末端mono-mPEG-rhG- CSF；

所述缓冲液A为10mM醋酸钠-醋酸缓冲液和0.004%吐温-80溶液的混合液；所述缓冲液B为缓冲液A与1M氯化钠的混合溶液。

2.如权利要求1所述的N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组合物的制备方法，包括如下步骤：(1) 离子交换色谱法层析：将N-末端mono-mPEG-rhG-CSF粗品用Macro Cap SP离子交换色谱法层析，包括：①上样：将N-末端mono-mPEG-rhG-CSF粗品以缓冲液A稀释至100~200μg/mL，以

340mL/min±10%的流速上样；

②冲洗：以缓冲液A以400mL/min±10%的流速冲洗3个柱体积；

③梯度洗脱：以缓冲液A及缓冲液B以90mL/min±10%的流速梯度洗脱6个柱体积，所述梯度为0至50%±10%，收集洗脱峰1、2、3；

(2) 分子筛层析：将离子交换层析收集峰2用Superdex 75柱进行分子筛层析，包括：①上样：将收集峰2用缓冲液A以120mL/min±10%的流速上样，上样体积为柱体积的

5%；

②以缓冲液A以120mL/min±10%的流速洗脱，收集洗脱峰4和洗脱峰5，洗脱峰5即N-末端mono-mPEG-rhG-CSF。

3. 一种N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组合物，其特征在于，采用如权利要求1或权利要求2所述的制备方法制得。

说明书

一种聚乙二醇修饰的rhG-CSF药物组合物及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种聚乙二醇修饰的rhG-CSF药物组合物及其制备方法。

背景技术

[0002] 粒细胞集落刺激因子G-CSF是一种药学上的活性蛋白，其可以促使中性粒系细胞的产生，增殖和分化，并激活血液中成熟中性粒细胞的功能。G-CSF可用于各种白细胞减少症，它可以使干细胞和前体细胞从骨髓转移，并且用于治疗由于化学疗法引起的粒细胞减少患者，或用作骨髓移植的前序。rhG-CSF由原核表达系统(E.coli)重组表达制备，由175个氨基酸残基组成的单链的非糖基化多肽链。

[0003] 蛋白治疗药物rhG-CSF的生物利用度通常受血浆半衰期的限制，并且对蛋白酶降解敏感，阻碍了最大的临床潜能。市售rhG-CSF有短期的药理学作用，且在白细胞减少状态的持续期间通常必须一天给药一次以上，这给病人带来很大痛苦。

[0004] PEG-rhG-CSF就是用PEG(聚乙二醇)对rhG-CSF进行修饰，从而降低rhG-CSF的免疫原性并延长其半衰期。

[0005] 中国专利申请CN1139932A(文献1)公开了一种N-末端单聚乙二醇化的rhG-CSF的制品，所述制品优选由至少90％的N-末端单聚乙二醇化的rhG-CSF及至多10％的未发生聚乙二醇化的rhG-CSF组成；更优选由至少95％的N-末端单聚乙二醇化的rhG-CSF及至多5％的未发生聚乙二醇化的rhG-CSF组成。在该专利说明书中，当所用PEG为甲氧聚乙二醇醛(mPEG)时，未提示纯化后样品单PEG化的rhG-CSF的含量。我们参考该专利公开方法，采用mPEG20kDa对rhG-CSF进行反应，单PEG化的rhG-CSF的转化率只有70％左右，按照其公开的纯化方法也不能得到高纯度(90％以上)的单PEG化的rhG-CSF。OlafB.Kinstler等 在 Pharmacutical research Vol.13No.71996，“Characterization and Stability ofN-terminally PEGylated rhG-CSF”(文献2)中公开了与CN1139932A类似方法。我们采用PEG20kDa对rhG-CSF进行反应，单PEG化的rhG-CSF的转化率也只有70％左右，按照其公开的纯化方法也不能得到高纯度(90％以上)的单PEG化的rhG-CSF。

[0006] 为了提高对rhG-CSF的N-末端单聚乙二醇化的专一性及产品纯度，我公司进行了大量研究工作，并于2005年3月25日提交了中国专利申请CN1687106A(文献3)，公开了一种改进的聚乙二醇修饰蛋白质α-氨基的方法，将用N-末端单mPEG-rhG-CSF的转化率提高到95％，经纯化后的产品含95％mPEG-rhG-CSF及5％的rh-G-CSF。用该专利公开方法可得到基本上均一的N-末端单mPEG20000-rhG-CSF产品，但产品中未反应的rhG-CSF含量稍高，将对产品质量产生一定影响，并且该方法增加了对ε氨基进行保护及去除保护基步骤，操作相对繁琐，且在生产上需要增加相应反应设备，增加了生产成本。

发明内容

[0007] 本发明人长期致力于PEG化rhG-CSF的研究工作，通过对用现有技术方法制备得到的mPEG-rhG-CSF产品进行研究，发现产品中主要存在以下杂质：

[0008] (1)未反应完的原料，如：mPEG，rhG-CSF；

[0009] (2)其它取代位置的单(mono)取代mPEG-rhG-CSF；

[0010] (3)多取代的mPEG-rhG-CSF，如di-mPEG-rhG-CSF、tri-mPEG-rhG-CSF；

[0011] (4)其它杂质，如外源性DNA、宿主菌蛋白等。

[0012] 发明人通过大量研究发现，当产品中N末端mono-mPEG-rhG-CSF纯度达到95％以上，上述(2)～(3)类杂质总和含量≤5％，且(1)类杂质中G-CSF含量≤3％，(4)类杂质含量＜0.5％时，产品质量基本均一，且动物实验表明产品安全有效。因此，发明人对用现有技术方法制备得到的mPEG-rhG-CSF粗品的纯化方法进行了研究，终于找到一种能够使N末端mono-mPEG-rhG-CSF纯度达到95％以上，且各类杂质能够降到上述指标甚至更低以下，从而提高了mPEG-rhG-CSF的质量稳定性，保障了其临床用药安全。

[0013] 因此，本发明的一方面提供一种N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组合物，其特征在于，包括以下组分：

[0014] 组分I：N-末端mono-mPEG-rhG-CSF，纯度≥95.0％；

[0015] 组 分II：选 自rhG-CSF、非N-末 端 mono-mPEG-rhG-CSF、di-mPEG-rhG-CSF、tri-mPEG-rhG-CSF中的一种或几种，0≤含量≤5.0％，且0≤rhG-CSF含量≤3.0％；

[0016] 组分III：mPEG，0≤含量≤5.0％；

[0017] 以及残余量杂质，含量＜0.5％。

[0018] 上述药物活性组合物中：

[0019] 优选地，组分I：纯度≥96.0％；组分II：选自rhG-CSF、di-mPEG-rhG-CSF中的一种或两种，0≤含量≤4.0％；组分III：0≤mPEG含量≤4.0％。

[0020] 更优选地，组分I：纯度≥97.0％；组分II选自rhG-CSF、di-mPEG-rhG-CSF中的一种或两种，且0＜di-mPEG-rhG-CSF含量≤3.0％，0＜rhG-CSF含量≤2.0％，组分III：0≤mPEG含量≤3.0％。

[0021] 进一步优选地，组分I：纯度≥98.0％；组分II：选自rhG-CSF、di-mPEG-rhG-CSF中的一种或两种，且0＜di-mPEG-rhG-CSF含量≤2.0％，0＜rhG-CSF含量≤1.0％，组分III：0≤mPEG含量≤2.0％。

[0022] 进一步优选地，组分I：纯度≥99.0％；组分II：选自rhG-CSF、di-mPEG-rhG-CSF中的一种或两种，且0＜di-mPEG-rhG-CSF含量≤1.0％，0＜rhG-CSF含量≤0.5％，组分III：0≤mPEG含量≤1.0％。

[0023] 上述任一药物活性组合物中，所述mPEG优选为分子量为20kDa的mPEG。

[0024] 上述任一药物活性组合物中，所述残余量杂质包含外源性DNA、宿主菌蛋白；优选地，所述外源性DNA含量≤10ng/剂量，所述宿主菌蛋白含量≤0.02％。

[0025] rhG-CSF序列中的5个赖氨酸为mPEG的结合位点，因此，上述药物活性组合物中，所述mono-mPEG-rhG-CSF指的是，5个结合位点中，任一位点与PEG结合的mPEG-rhG-CSF；非N-末端mono-mPEG-rhG-CSF指的是，除N-末端外，其它任一结合位点形成的mono-mPEG-rhG-CSF；所述di-mPEG-rhG-CSF指的是，5个结合位点中任意两个位点结合mPEG的mPEG-rhG-CSF；所述tri-mPEG-rhG-CSF指的是，5个结合位点中任意三个位点结合mPEG的mPEG-rhG-CSF。

[0026] 本发明中所述组分I含量指的是其蛋白含量。

[0027] 本发明另一方面还提供了一种上述N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组合物的制备方法，包括以下步骤：

[0028] (1)离子交换色谱法层析：将N-末端mono-mPEG-rhG-CSF粗品用Macro Cap SP离子交换色谱法层析，包括上样、冲洗、梯度洗脱步骤；

[0029] (2)分子筛层析：将离子交换层析富含N-末端mono-mPEG-rhG-CSF的收集峰用Superdex 75柱进行分子筛层析，包括上样、洗脱步骤，得N-末端mono-mPEG-rhG-CSF。

[0030] 上述制备方法中：离子交换色谱法层析和分子筛层析中的上样和冲洗步骤所用缓冲液相同，为10mM醋酸钠-醋酸缓冲液，任选地，可加入少量表面活性剂，所述表面活性剂优选为0.004％吐温-80溶液，下文中将10mM醋酸钠-醋酸缓冲液和0.004％吐温-80溶液组成的缓冲液简称为缓冲液A；离子交换色谱法层析中的梯度洗脱步骤所用缓冲液为10mM醋酸钠-醋酸缓冲液与氯化钠溶液，和/或表面活性剂的混合液，所述氯化钠溶液浓度优选为1M，所述表面活性剂优选为0.004％吐温-80溶液，下文将缓冲液A与1M氯化钠的混合溶液简称缓冲液B。

[0031] 进一步地，所述N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组合物的制备方法，包括以下步骤：

[0032] (1)离子交换色谱法层析：将N-末端-mPEG-rhG-CSF粗品用Macro Cap SP离子交换色谱法层析，包括：

[0033] ①上样：将N-末端mono-mPEG-rhG-CSF粗品以缓冲液A稀释上样；

[0034] ②冲洗：以缓冲液A冲洗1～5个柱体积；

[0035] ③梯度洗脱：以缓冲液A及缓冲液B梯度洗脱，收集洗脱峰1、2、3；

[0036] (2)分子筛层析：将离子交换层析收集峰2用Superdex75柱进行分子筛层析，包括：

[0037] ①上样：将收集峰2用缓冲液A上样；

[0038] ②以缓冲液A洗脱，收集洗脱峰4和洗脱峰5，洗脱峰5即N-末端-mPEG-rhG-CSF。

[0039] 更进一步的，所述N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组合物的制备方法，包括以下步骤：

[0040] (1)离子交换色谱法层析：将N-末端mono-mPEG20000-rhG-CSF粗品用Macro Cap SP离子交换色谱法层析，包括：

[0041] ①上样：将N-末端mono-mPEG-rhG-CSF粗品以缓冲液A稀释至100～200μg/mL，以340mL/min±10％的流速上样；

[0042] ②冲洗：以缓冲液A以400mL/min±10％的流速冲洗3个柱体积；

[0043] ③梯度洗脱：以缓冲液A及缓冲液B以90mL/min±10％的流速梯度洗脱6个柱体积，所述梯度为0至50％±10％，收集洗脱峰1、2、3；

[0044] (2)分子筛层析：将离子交换层析收集峰2用Superdex75柱进行分子筛层析，包括：

[0045] ①上样：将收集峰1用缓冲液A以120mL/min±10％的流速上样，上样体积为柱体积的

[0046] 5％；

[0047] ②以缓冲液A以120mL/min±10％的流速洗脱，收集洗脱峰4和洗脱峰5，洗脱峰5即

[0048] N-末端mono-mPEG-rhG-CSF。

[0049] 所述洗脱峰1～5参见附图1和2。

[0050] 本发明另一方面还提供一种上述N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物组合物，包含上述N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组合物及药学上可接受的载体，通常将其制成注射制剂，优选冻干粉针剂，这些制剂可采用本领域一般技术人员公知的相应辅料，采用相应公知的药物制剂的制备技术制得。

[0051] 本发明另一方面还提供上述N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组合物或包含其的药物组合物在制备用于治疗以造血或免疫功能减退为特征的疾病的药物中的应用，优选所述疾病是由化疗、放疗、感染性疾病、严重慢性嗜中性粒细胞减少症或白血病引起的。

[0052] 本发明另一方面还提供一种采用上述N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组7
合物的制备方法得到的mPEG20000-rhG-CSF产品，体外活性≥9×10IU/mg，优选为1.2～
8
2.5×10IU/mg。

[0053] 本发明所述N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组合物，各项指标均符合药用要求，质量均一，且药效、半衰期、安全性等方面均优于现有技术产品，能够保证N-末端mono-mPEG-rhG-CSF制剂的临床疗效及用药安全。

附图说明

[0054] 图1：本发明实施例离子交换色谱法层析洗脱示意图

[0055] 图2：本发明实施例分子筛层析洗脱示意图

[0056] 图3：制备例制备的mPEG20000-rhG-CSF粗品的液相图谱

[0057] 图4：实施例1制备的mPEG20000-rhG-CSF药物活性组合物组分I和II检测的液相图谱

[0058] 图5：实施例2制备的mPEG20000-rhG-CSF药物活性组合物组分I和II检测的液相图谱

[0059] 图6：实施例3制备的mPEG20000-rhG-CSF药物活性组合物组分I和II检测的液相图谱

[0060] 图7：实施例4制备的mPEG20000-rhG-CSF药物活性组合物组分I和II检测的液相图谱

[0061] 图8：实施例5制备的mPEG20000-rhG-CSF药物活性组合物组分I和II检测的液相图谱

[0062] 图9：实施例6制备的mPEG20000-rhG-CSF药物活性组合物组分I和II检测的液相图谱具体实施方式

[0063] 以下结合具体实施例对本发明所述内容做进一步详细的说明。

[0064] 以下制备例和实施例检测方法如下：

[0065] 1、组分I及组分II中各成分的含量检测方法：照高效液相色谱法测定[0066] 色谱条件及测定方法：

[0067] 仪器：WATERSTM600型高效液相色谱仪

[0068] 色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂

[0069] 测定方法：以A相(三氟乙酸-水溶液：量取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀)、B相(三氟乙酸-乙腈溶液：量取1.0ml三氟乙酸和99ml水加入色谱纯乙腈至1000ml，充分混匀)为流动相，在室温条件下，按下表进行梯度洗脱。上样量应不低于10μg，在波长280nm处检测。

[0070] 表1组分I及组分II流动相洗脱梯度

[0071]时间(min) 流速(ml/min) A％ B％
0 0.8 97.0 3.0
65 0.8 30.0 70.0
85 0.8 20.0 80.0
95 0.8 20.0 80.0

[0072] 对液相图上的峰进行标注：

[0073] 峰1——di-mPEG20000-rhG-CSF

[0074] 峰2——N-末端mono-mPEG20000-rhG-CSF

[0075] 峰3——rhG-CSF

[0076] 2、组分III的含量检测方法：

[0077] 仪器设备：高效液相色谱仪HPLC，蒸发光散射检测器；

[0078] 色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(5μm，4.6×250mm)[0079] 测定方法：先将待测原液的空白进样100μl，再将待测原液稀释至500μg/ml蛋白，进样100μl，以A相(三氟乙酸-水溶液：量取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀)、B相(三氟乙酸-乙腈溶液：量取1.0ml三氟乙酸和99ml水加入色谱纯乙腈至1000ml，充分混匀)为流动相，在室温条件下，按下表进行梯度洗脱。进行PEG峰的面积积分，根据标准曲线计算出PEG含量。

[0080] 表2组分III流动相洗脱梯度

[0081]时间(min) 流速(mL/min) A％ B％
0 1.0 95 5
10 1.0 50 50
15 1.0 50 50
20 1.0 5 95
30 1.0 5 95

[0082] 3、残余量杂质：

[0083] (1)外源性DNA残留量

[0084] 依据《中华人民共和国药典》2010年版(三部)附录IVB外源性DNA残留量测定法。

[0085] (2)宿主菌蛋白残留量

[0086] 依据《中华人民共和国药典》2010年版(三部)附录IVC大肠埃希菌体蛋白残留量测定法。

[0087] 4、体外活性试验

[0088] 实验材料：NFS-60细胞。

[0089] 所需试剂：

[0090] rhG-CSF国家标准品(5×106IU/支)；

[0091] RPMI1640培养液：取RPMI1640培养基粉末1袋(规格为1L)，加水溶解并稀释至1000ml，加青霉素105IU和链霉素105IU，再加入碳酸氢钠2.1g，溶解后，混匀，除菌过滤，
4℃保存；

[0092] 基础培养液：量取新生牛血清10ml，加入RPMI1640培养液90ml中，4℃保存；

[0093] 完全培养液：基础培养液加入mPEG20000-rhG-CSF至最终浓度20ng/ml，4℃保存；

[0094] PBS：称取氯化钠8、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释成1000mL，经121℃、20分钟灭菌。

[0095] 噻唑蓝(MTT)溶液：称取MTT粉末0.10g，溶于PBS20ml中，配制成每1ml含5.0mg的溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存。

[0096] 裂解液：量取盐酸14mL、Triton X-100溶液50mL，加异丙醇，配制成500mL的溶液。室温避光保存。

[0097] 标准品溶液：取rhG-CSF生物学活性测定标准品，按说明书复溶后，用基础培养液稀释至250IU/ml。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔，每孔分别留50μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。

[0098] 供试品溶液：

[0099] 取mPEG20000-rhG-CSF溶液，用基础培养液稀释至约50～300IU/ml。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔，每孔分别留50μl供试品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。

[0100] 测定方法：

[0101] ①细胞的收集与处理

[0102] NFS-60细胞株用完全培养液于37℃、5％二氧化碳条件下培养，控制细胞浓度为1.0×105～4.0×105cell/ml，传代后24～36小时用于活性测定。将试验所用溶液预温至37℃。取足量NFS-60细胞培养物，收集于离心管中，1000rpm，离心3分钟，弃去上清，用RPMI1640培养液洗涤三次，然后重悬于基础培养液配成细胞浓度为2.0×105cell/ml的细胞悬液，置37℃备用。

[0103] ②铺板：在无菌条件下，在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中，每孔加入细胞悬液50μl，于37℃、5％CO2条件下培养40～48小时。

[0104] ③染色：在无菌条件下，向每孔加入20μl MTT，于37℃、5％二氧化碳条件下继续培养5小时。

[0105] ④显色：每孔加入100μl裂解液，混匀，放入酶标仪，以630nm为参比波长，在波长570nm测定吸光度，记录测定结果。

[0106] 实验结果处理：

[0107] 以PEG-rhG-CSF的稀释倍数为横坐标，以测量波长与参比波长的吸光度之差为纵坐标，绘制活性曲线，分别计算各实验样品的半效稀释倍数，再由公式计算出样品活性：

[0108]

[0109] 式中Pr为标准品生物学活性IU/ml；

[0110] Ds为供试品预稀释倍数；

[0111] Dr为标准品预稀释倍数；

[0112] Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；

[0113] Er为标准品半效量的稀释倍数。

[0114]

[0115] 制备例：mPEG20000-rhG-CSF粗品的制备(参照文献1公开方法)

[0116] 制备rhG-CSF反应溶液，浓度为5mg/mL，内含100mM在10mL NaH2PO4，pH5.0，还含有20mMNaCNBH3，将其于4℃下充分搅拌后，加入摩尔数为rhG-CSF摩尔数5倍量的20kDa的mPEG，反应液于4℃下搅拌反应10h。然后将反应液用100mM HCl调至pH4.0，浓缩，得mPEG20000-rhG-CSF粗品。用HPLC方法进行检测，粗品中所含组分及各组分见表3，HPLC检测图谱见图3，体外活性测定结果见表4。

[0117] 实施例1：N-末端mono-mPEG20000-rhG-CSF的制备

[0118] (1)离子交换色谱法层析：将制备1所得mPEG20000-rhG-CSF粗品用Macro Cap SP(直径300mm，高12cm)的离子交换色谱法层析：

[0119] ①上样：将mPEG20000-rhG-CSF粗品以缓冲液A(pH4.0±0.5)稀释至100～200μg/mL，以340mL/min±10％流速上样，上样量10mg蛋白/ml填料；

[0120] ②冲洗：以缓冲液A400mL/min±10％流速冲洗3个柱体积；

[0121] ③梯度洗脱：以缓冲液A及缓冲液B以90mL/min±10％的流速洗脱梯度洗脱6个柱体积(梯度从0％至60％)，收集洗脱峰1、2、3；

[0122] (2)分子筛层析：

[0123] ①将离子交换层析收集峰2用Superdex75柱(直径200mm，高60cm)以120mL/min±10％的流速上样，上样体积为柱体积的5％；

[0124] ②以缓冲液A以120mL/min±10％的流速洗脱，收集洗脱峰4和洗脱峰5，洗脱峰5即N-末端mono-PEG20000-rhG-CSF。

[0125] 将所得流分进行浓缩至5mg/mL，检测，检测结果见表3，HPLC检测图谱见图4。体外活性测定结果见表4。

[0126] 实施例2：N-末端mono-mPEG20000-rhG-CSF的制备

[0127] (1)离子交换色谱法层析：将制备1所得mPEG20000-rhG-CSF粗品用Macro Cap SP(直径300mm，高12cm)的离子交换色谱法层析：

[0128] ①上样：将mPEG20000-rhG-CSF粗品以缓冲液A(pH4.0±0.5)稀释至100～200μg/mL，以340mL/min±10％流速上样，上样量8mg蛋白/ml填料；

[0129] ②冲洗：以缓冲液A400mL/min±10％流速冲洗3个柱体积；

[0130] ③梯度洗脱：以缓冲液A及缓冲液B以90mL/min±10％的流速洗脱梯度洗脱6个柱体积(梯度从0％至55％)，收集洗脱峰1、2、3；

[0131] (2)分子筛层析：

[0132] ①将离子交换层析收集峰2用Superdex75柱(直径200mm，高60cm)以120mL/min±10％的流速上样，上样体积为柱体积的5％；

[0133] ②以缓冲液A以120mL/min±10％的流速洗脱，收集洗脱峰4和洗脱峰5，洗脱峰5即N-末端mono-PEG20000-rhG-CSF。

[0134] 将所得流分进行浓缩至5mg/mL，检测，检测结果见表3，HPLC检测图谱见图5。体外活性测定结果见表4。

[0135] 实施例3：N-末端mono-mPEG20000-rhG-CSF的制备

[0136] (1)离子交换色谱法层析：将制备1所得mPEG20000-rhG-CSF粗品用Macro Cap SP(直径300mm，高12cm)的离子交换色谱法层析：

[0137] ①上样：将mPEG20000-rhG-CSF粗品以缓冲液A(pH4.0±0.5)稀释至100～200μg/mL，以340mL/min±10％流速上样，上样量6mg蛋白/ml填料；

[0138] ②冲洗：以缓冲液A400mL/min±10％流速冲洗3个柱体积；

[0139] ③梯度洗脱：以缓冲液A及缓冲液B以90mL/min±10％的流速洗脱梯度洗脱6个柱体积(梯度从0％至50％)，收集洗脱峰1、2、3；

[0140] (2)分子筛层析：

[0141] ①将离子交换层析收集峰2用Superdex75柱(直径200mm，高60cm)以120mL/min±10％的流速上样，上样体积为柱体积的5％；

[0142] ②以缓冲液A以120mL/min±10％的流速洗脱，收集洗脱峰4和洗脱峰5，洗脱峰5即N-末端mono-PEG20000-rhG-CSF。

[0143] 将所得流分进行浓缩至5mg/mL，检测，检测结果见表3，HPLC检测图谱见图6。体外活性测定结果见表4。

[0144] 实施例4：N-末端mono-mPEG20000-rhG-CSF的制备

[0145] (1)离子交换色谱法层析：将制备1所得mPEG20000-rhG-CSF粗品用Macro Cap SP(直径300mm，高12cm)的离子交换色谱法层析：

[0146] ①上样：将mPEG20000-rhG-CSF粗品以缓冲液A(pH4.0±0.5)稀释至100～200μg/mL，以340mL/min±10％流速上样，上样量4mg蛋白/ml填料；

[0147] ②冲洗：以缓冲液A400mL/min±10％流速冲洗3个柱体积；

[0148] ③梯度洗脱：以缓冲液A及缓冲液B以90mL/min±10％的流速洗脱梯度洗脱6个柱体积(梯度从0％至45％)，收集洗脱峰1、2、3；

[0149] (2)分子筛层析：

[0150] ①将离子交换层析收集峰2用Superdex75柱(直径200mm，高60cm)以120mL/min±10％的流速上样，上样体积为柱体积的5％；

[0151] ②以缓冲液A以120mL/min±10％的流速洗脱，收集洗脱峰4和洗脱峰5，洗脱峰5即N-末端mono-PEG20000-rhG-CSF。

[0152] 将所得流分进行浓缩至5mg/mL，检测，检测结果见表3，HPLC检测图谱见图7。体外活性测定结果见表4。

[0153] 实施例5：N-末端mono-mPEG20000-rhG-CSF的制备

[0154] (1)离子交换色谱法层析：将制备1所得mPEG20000-rhG-CSF粗品用Macro Cap SP(直径300mm，高12cm)的离子交换色谱法层析：

[0155] ①上样：将mPEG20000-rhG-CSF粗品以缓冲液A(pH4.0±0.5)稀释至100～200μg/mL，以340mL/min±10％流速上样，上样量3mg蛋白/ml填料；

[0156] ②冲洗：以缓冲液A400mL/min±10％流速冲洗3个柱体积；

[0157] ③梯度洗脱：以缓冲液A及缓冲液B以90mL/min±10％的流速洗脱梯度洗脱6个柱体积(梯度从0％至40％)，收集洗脱峰1、2、3；

[0158] (2)分子筛层析：

[0159] ①将离子交换层析收集峰2用Superdex75柱(直径200mm，高60cm)以120mL/min±10％的流速上样，上样体积为柱体积的5％；

[0160] ②以缓冲液A以120mL/min±10％的流速洗脱，收集洗脱峰4和洗脱峰5，洗脱峰5即N-末端mono-PEG20000-rhG-CSF。

[0161] 将所得流分进行浓缩至5mg/mL，HPLC检测，检测结果见表3，检测图谱见图8。体外活性测定结果见表4。

[0162] 实施例6：mPEG20000-rhG-CSF的制备(参照文献3公开方法)

[0163] ①超滤浓缩rhG-CSF溶液，更换缓冲体系为0.1M磷酸盐缓冲液(pH8.5)，得到浓度5mg/mL的rhG-CSF溶液1000mL；

[0164] ②加入1.66g二甲基马来酸酐，冰浴保持反应体系温度为0℃，维持反应30min；

[0165] ③在反应体系中加入52.6g20kDa的甲氧聚乙二醇丙醛，搅拌溶解，升温至37℃，加入0.16gNaBH3CN，反应1小时；以0.1M HCl调节上述反应混合物至pH6.0，37℃持续30分钟；

[0166] ④将反应产物上样，经10mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)平衡过的SP Seppharose Big Beads离子柱，以10mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)、0～0.45M氯化钠线性梯度洗脱6柱体积，收集主峰为mPEG20000-rhG-CSF。经过Superdex75柱去盐，并更换缓冲液为10mM乙酸钠(pH4.0)，收集流分，将所得流分进行浓缩至5mg/mL，检测，检测结果见表3，HPLC检测图谱见图9。体外活性测定结果见表4。

[0167] 表3：实施例1～6样品检测结果

[0168]

[0169] 结论：

[0170] 现有技术文献1所得mPEG20000-rhG-CSF粗品N-末端mono-mPEG20000-rhG-CSF的HPLC纯度为70％左右，所含杂质主要为di-mPEG20000-rhG-CSF、rhG-CSF和mPEG20000，其中，di-mPEG20000-rhG-CSF含量为25％左右，rhG-CSF为5％左右，mPEG20000含量非常高(未反应的PEG均在其中)，这里不再列出；文献3所得mPEG20000-rhG-CSF产品中N-末端mono-mPEG20000-rhG-CSF的HPLC纯度较高，约为95％，但rhG-CSF含量较高，约为5％，mPEG20000含量较低，为1％左右。现有技术所得mPEG20000-rhG-CSF产品含有的残余量杂质，如外源性DNA及宿主菌蛋白等，它们均为从rhG-CSF原液中所带来杂质，其中，外源性DNA≤10ng/剂量，宿主菌蛋白≤0.02％。

[0171] 本 发 明 的mPEG20000-rhG-CSF 药 物 活 性 组 合 物 中 组 分 I N- 末 端mono-mPEG20000-rhG-CSF的HPLC纯度均≥95.0％；组分II主要包含di-mPEG20000-rhG-CSF和rhG-CSF，其中，di-mPEG20000-rhG-CSF含 量＜ 5.0％，rhG-CSF含 量 ＜3.0 ％，且di-mPEG20000-rhG-CSF和rhG-CSF总含量＜5.0％；组分III为mPEG20000，含量＜5.0％。

[0172] 优选地，组分I纯度≥96.0％，组分II为di-mPEG20000-rhG-CSF、和/或rhG-CSF，且含量均≤4.0％，组分III为mPEG，含量≤4.0％。

[0173] 更优选地，组分I纯度≥97.0％；组分II为di-mPEG20000-rhG-CSF、和/或rhG-CSF，且0＜di-mPEG-rhG-CSF含量≤3.0％，0＜rhG-CSF含量≤2.0％；组分III为mPEG，含量≤3.0％。

[0174] 进一步优选地，组分I纯度≥98.0％；组分II为di-mPEG20000-rhG-CSF、和/或rhG-CSF，且0＜di-mPEG-rhG-CSF含量≤2.0％，0＜rhG-CSF含量≤1.0％；组分III为mPEG，0≤含量≤2.0％。

[0175] 进一步优选地，组分I纯度≥99.0％；组分II为di-mPEG20000-rhG-CSF、和/或rhG-CSF，且0＜di-mPEG-rhG-CSF含量≤1.0％，0＜rhG-CSF含量≤0.5％，组分III为mPEG，0≤含量≤1.0％。

[0176] 本发明的mPEG20000-rhG-CSF药物活性组合物还可能含有残余量杂质，如外源性DNA及宿主菌蛋白等，它们均为从rhG-CSF原液中所带来杂质，其中，外源性DNA≤10ng/剂量，宿主菌蛋白≤0.02％。

[0177] 表4实施例1～6样品体外活性检测结果

[0178]

[0179] 结论：本发明的mPEG20000-rhG-CSF药物活性组合物体外活性均高于现有技术产品，均＞5.0×107IU/mg，优选为5.8×107～8.3×107IU/mg。

[0180] 实施例7-9：mPEG20000-rhG-CSF注射剂

[0181] 表5实施例7～9所用原料药

[0182]实施例 原料药
7 实施例1制备的N-末端mono-mPEG20000-rhG-CSF药物活性组合物
8 实施例3制备的N-末端mono-mPEG20000-rhG-CSF药物活性组合物
9 实施例6制备的N-末端mono-mPEG20000-rhG-CSF产物

[0183] 处方组成(规格3.0mg(ml)/支)：

[0184] 表6实施例7～9稀释液配方

[0185]组分 每升用量 实际用量
醋酸钠 1.36g 1.36×Yg
聚山梨酯80 40mg 40×Yg
冰醋酸 适量 调pH3.5～4.5
山梨醇 - 5％×(批灌装支数M×规格装量)g
注射用水 最后补足体积至Y升

[0186] 备注：M表示批灌装支数。

[0187] 设所需原液体积为X(mL)、所需加入的制剂稀释液体积为Y(mL)，则[0188]

[0189] Y＝批灌装支数M×该规格装量-原液体积X(mL)

[0190] 制备方法：

[0191] ①将处方量的醋酸钠、吐温80、冰醋酸、山梨醇和注射用水配制成稀释液；

[0192] ②取处方量的mPEG20000-rhG-CSF原液，用配制好的稀释液稀释至所需浓度；

[0193] ③过滤除菌；

[0194] ④将所得注射液按注射剂规格装量分装于中性硼硅玻璃管制注射剂瓶中；

[0195] ⑤加盖药用溴化丁基橡胶塞。

[0196] 实施例10：长期毒性试验

[0197] 试验目的：比较本发明提供的mPEG20000-rhG-CSF药物活性组合物与现有技术的mPEG20000-rhG-CSF产品在长期毒性的差异。

[0198] 试验动物：Wistar大鼠，体重150～250g；每种受试药物30只，雌雄各半[0199] 试验药品：实施例7～9所制备的mPEG20000-rhG-CSF注射剂

[0200] 试验方法：对Wistar大鼠经腹腔注射给药56天，给药剂量为80μg/kg/day，相当于人临床日用体表面积等效量的5倍。在56天连续给药试验期间及21天恢复性观察期，记录受试动物的外观体征、行为活动、体重增长、进食量、血常规、白细胞分类、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(Fbg)、网织红细胞(Ret)、骨髓细胞、骨髓细胞形态、血液生化、大体解剖、脏器重量、脏器系数和其它各组织脏器病理组织学检查等有关指标。

[0201] 试验结果：

[0202] 表7实施例10试验结果

[0203]

[0204]

[0205] 由上表可以看出，本发明提供的mPEG20000-rhG-CSF药物活性组合物与现有技术的mPEG20000-rhG-CSF产品相比，安全性更高。

[0206] 实施例11：药代动力学试验

[0207] 试验目的：比较本发明提供的mPEG20000-rhG-CSF药物活性组合物与现有技术的mPEG20000-rhG-CSF产品的半衰期差异。

[0208] 试验动物：猕猴：健康；每种受试药物6只

[0209] 试验药品：实施例8和9所制备的mPEG20000-rhG-CSF注射剂

[0210] 试验方法：

[0211] 6只猕猴皮下注射10μg/kg的受试药物，用ELISA法测定动物血清中的药物浓度，浓度-时间数据经药代动力学参数计算，表明药物消除符合二房室模型，结果如下：

[0212] 试验结果：

[0213] 表8实施例11试验结果

[0214]

[0215] 药代动力学实验表明，本发明的提供的mPEG20000-rhG-CSF药物活性组合物的半衰期要长于现有技术的mPEG20000-rhG-CSF产品的半衰期。

[0216] 综上，本发明提供的mPEG20000-rhG-CSF药物活性组合物在质量均一，活性、半衰期、安全性等方面均优于现有技术的mPEG20000-rhG-CSF产品，将更适于临床用药。