一种聚联乙炔变色囊泡及其用于β-葡萄糖醛酸酶活性分析的应用

摘要

本发明公开了一种聚联乙炔变色囊泡及用于β-葡萄糖醛酸酶活性分析的应用，该聚联乙炔变色囊泡是由两种联乙炔单体聚合而成，可以用于聚联乙囊泡用于分析β-葡萄糖醛酸酶活性和构建高通量筛选酶抑制剂，在分析β-葡萄糖醛酸酶活性时，酶能够特异性的水解聚联乙炔微囊表面的糖苷基团，引发沿3-硝基-4-羟基苄醇连接链的自分解反应，从而引起聚联乙炔微囊发生变色，并产生荧光，通过分析颜色变化程度和荧光增强程度，即可实现对β-葡萄糖醛酸酶活性的实时检测。能够实现肉眼直接观察结果，并且具有简单、快速、灵敏度高等特点。同时，本发明可与高通量的微孔板模式兼容，可实现对β-葡萄糖醛酸酶抑制剂的高通量筛选。

权利要求

1.一种聚联乙炔变色囊泡，其特征在于，由两种联乙炔单体聚合而成，所述两种联乙炔单体分别为：

1)结构如式Ⅰ的10,12-二十五二炔羧酸；

2)结构如式Ⅱ的对10,12-二十五二炔羧酸的羧基端进行共价修饰后得到的带有β-D-葡萄糖醛酸糖苷配体和能够发生自分解反应的3-硝基-4-羟基苄醇连接链的新单体；

所述的聚联乙炔变色囊泡的制备方法，将式Ⅰ和式Ⅱ所示的联乙炔单体按照摩尔比7:3的量溶解于氯仿中，在旋转蒸发仪中除去所有溶剂，然后加入去离子水80℃超声20分钟，用

0.4μm的滤膜过滤后，4℃避光保存，在使用前用254nm的紫外灯照射15分钟进行光聚合，得到聚联乙炔变色囊泡。

2.权利要求1所述的聚联乙炔变色囊泡用于分析β-葡萄糖醛酸酶活性和构建高通量筛选酶抑制剂的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，在进行抑制剂筛选时，将不同浓度的β-葡萄糖醛酸酶抑制剂与β-葡萄糖醛酸酶混合后，加入到聚联乙炔囊泡溶液中，由于不同浓度抑制剂对酶活性的抑制效果不同，导致引起的聚联乙炔囊泡的变色程度和荧光增强程度不同，在分析抑制剂浓度与颜色变化程度以及荧光增强程度之间的关系后，可以得到在酶活性被抑制一半时所需的抑制剂的浓度，即IC50值。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，在进行β-葡萄糖醛酸酶活性分析时，利用酶能够特异性的水解囊泡表面的β-D-葡萄糖醛酸苷，引发分子内沿3-硝基-4-羟基苄醇连接链的自发消除反应，并使得连接链上的氨基裸露，引起微囊之间的静电相互吸引，从而导致微囊共轭结构构象的变化，产生变色和荧光增强，通过实时分析颜色变化程度，实现对β-葡萄糖醛酸酶的实时检测。

说明书

一种聚联乙炔变色囊泡及其用于β-葡萄糖醛酸酶活性分析的

应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物化学分析领域，具体涉及一种聚联乙炔变色囊泡及其用于β-葡萄糖醛酸酶活性分析的应用。

背景技术

[0002] 聚联乙炔（PDA）是由单体含联乙炔结构的化合物聚合形成，作为一类重要的共轭聚合物，PDA具有以下几个优点：1）PDA的单体可以由254nm紫外灯或γ射线引发聚合，由二乙炔进行1,4加成形成烯-炔共轭骨架，不需要催化剂或引发剂，使得PDA的制备非常简单而环保。2）PDA单体在未聚合前为无色，当聚合后变为蓝色，在640nm处出现最强吸收，受到外界环境的刺激后，聚合物颜色能够由蓝变为红色，在550nm处出现最强吸收，这一颜色的转变可以通过肉眼感知，使得PDA在比色传感中的具有独特的优势。3）PDAs的蓝色状态是没有荧光的，而其红色状态显红色荧光，因此，可以用于构建以荧光为基础的传感系统。人们利用以上特点开发出了大量基于PDA的囊泡和薄膜传感系统用于检测生物和化学中重要的分子。目前，人们利用PDA囊泡的变色和荧光特性实现了对病毒、蛋白质、细菌等多种分析物的检测。

[0003] 自分解消除反应是指，在由复杂结构组成的化合物中，当某个基团被破坏或移除时，整个化合物结构发生分子内自发电子转移，从而引起整个结构的消除反应，使得化合物由复杂结构分解为数个简单的结构。

[0004] β-葡萄糖醛酸酶是一种酸性水解酶，广泛存在于生物体内，能够催化水解含有β-D-葡萄糖醛酸苷化合物。目前，该酶已被作为肿瘤的标记物，肿瘤前药物治疗的转化酶，以及基因运输载体的追踪酶而得到了广泛的研究。同时，该酶在体内的表达含量与多种疾病相关，如关节炎、细菌和病毒感染、癌症等。近几年，人们开发了荧光成像、核磁共振成像及放射元素成像法来研究该酶在体内外的活性，然而这些方法都需要昂贵的仪器作为支撑，且操作步骤繁琐，成本高，不利于酶活性研究和相关的酶抑制剂筛选。因此，开发简单、快速的方法来分析该酶活性依然非常必要。

发明内容

[0005] 为了实现对酶活性的快速分析，本发明的目的在于，提供一种聚联乙炔变色囊泡及其用于β-葡萄糖醛酸酶活性分析的应用。

[0006] 为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

[0007] 一种聚联乙炔变色囊泡，其特征在于，由两种联乙炔单体聚合而成，所述两种联乙炔单体分别为：

[0008] 1）结构如式（Ⅰ）的10,12-二十五二炔羧酸（PCDA）；

[0009] 2）结构如式（Ⅱ）的对10,12-二十五二炔羧酸的羧基端进行共价修饰后得到的带有β-D-葡萄糖醛酸糖苷配体和能够发生自分解反应的3-硝基-4-羟基苄醇连接链的新单体（PCDA-GlcA）：

[0010]

[0011] 上述聚联乙炔变色囊泡的制备方法是：将式（Ⅰ）和式（Ⅱ）所示的联乙炔单体按照摩尔比7:3的量溶解于氯仿中，在旋转蒸发仪中除去所有溶剂，然后加入去离子水80℃超声20分钟，用0.4μm的滤膜过滤后，4℃避光保存，在使用前用254nm的紫外灯照射15分钟进行光聚合，得到聚联乙炔变色囊泡。

[0012] 采用本发明的聚乙炔变色囊泡，用于分析β-葡萄糖醛酸酶活性和构建高通量筛选酶抑制剂，其中：

[0013] 在分析β-葡萄糖醛酸酶活性时，利用酶能够特异性的水解囊泡表面的β-D-葡萄糖醛酸苷，引发分子内沿3-硝基-4-羟基苄醇连接链的自分解消除反应，并使得连接链上的氨基裸露，引起微囊之间的静电相互吸引，从而导致微囊共轭结构构象的变化，产生变色和荧光增强，通过实时分析颜色变化程度，实现对β-葡萄糖醛酸酶的实时检测。

[0014] 所制备的聚联乙炔囊泡在分析β-葡萄糖醛酸酶活性时能够与高通量的微孔板模式兼容的特点，可以构建成为高通量筛选酶抑制剂。

[0015] 在构建酶抑制剂筛选时，将不同浓度的β-葡萄糖醛酸酶抑制剂与β-葡萄糖醛酸酶混合后，加入到聚联乙炔囊泡溶液中，由于不同浓度抑制剂对酶活性的抑制效果不同，导致引起的聚联乙炔囊泡的变色程度和荧光增强程度不同，在分析抑制剂浓度与颜色变化程度以及荧光增强程度之间的关系后，可以得到在酶活性被抑制一半时所需的抑制剂的浓度，即IC50值。

[0016] 本发明构建的聚联乙炔变色囊泡在对β-葡萄糖醛酸酶进行活性分析时，其检测信号可直接转换为颜色变化，并且伴随有荧光增强现象，方法简单快速，灵敏度高，且能能够直观反应酶催化反应进程。同时，本发明提供了一种筛选β-葡萄糖醛酸酶抑制剂的方法，能够在微孔板中高通量进行酶的潜在抑制剂筛选，具有一定的推广应用价值。

附图说明

[0017] 图1是制备的聚联乙炔变色囊泡检测β-葡萄糖醛酸酶活性的原理示意图。

[0018] 图2是向制备的聚联乙炔囊泡中加入β-葡萄糖醛酸酶后吸收光谱随时间的变化图。

[0019] 图3是向制备的聚联乙炔囊泡中加入β-葡萄糖醛酸酶后荧光光谱随时间的变化图。

[0020] 图4是不同浓度β-葡萄糖醛酸酶加入制备的聚联乙炔囊泡中时CR响应值随时间的变化图。

[0021] 图5是不同浓度β-葡萄糖醛酸酶加入制备的聚联乙炔囊泡中时560nm处荧光强度随时间的变化图。

[0022] 图6是向制备的聚联乙炔变色微囊中加入β-葡萄糖醛酸酶和不同浓度抑制剂后孵育1小时候结果示意图（其中，A：颜色变化图；B：荧光变化图）。

[0023] 图7是通过测定吸收变化计算得到的抑制剂浓度与抑制效率的关系图。

[0024] 图8是通过测定荧光强度变化计算得到的抑制剂浓度与抑制效率的关系图。

[0025] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

具体实施方式

[0026] 参见附图，本实施例给出一种聚联乙炔变色囊泡，由两种联乙炔单体聚合而成，所述两种联乙炔单体分别为：

[0027] 1）结构如式（Ⅰ）的10,12-二十五二炔羧酸（PCDA）；

[0028] 2）结构如式（Ⅱ）的对10,12-二十五二炔羧酸的羧基端进行共价修饰后得到的带有β-D-葡萄糖醛酸糖苷配体和能够发生自分解反应的3-硝基-4-羟基苄醇连接链的新单体（PCDA-GlcA）；

[0029]

[0030] 具体制备过程如下：

[0031] 一、合成带有β-D-葡萄糖醛酸糖苷配体联乙炔单体

[0032] 合成分为三部分，分别为：

[0033] （1）带自分解链的糖苷配体的合成

[0034] 以三-O-乙酰基-α-D-溴代葡萄糖醛酸甲酯为原料和成带自分解链的糖苷配体，具体步骤如下：

[0035] 1）将三-O-乙酰基-α-D-溴代葡萄糖醛酸甲酯（1.53g，3.84mmol）溶解于50mL无水乙腈当中，在氮气保护下，向溶液中加入3-硝基-4-羟基苯甲醛（1.29g，7.70mmol）和氧化银（1.8g，7.76mmol），室温搅拌4小时，反应液经过滤、浓缩后，将残余物溶解于50mL乙酸乙酯，用饱和碳酸氢钠水溶液洗6次，无水硫酸镁干燥，浓缩得米黄色固体。

[0036] 2）将步骤1）得到的米黄色固体（1.12g，2.33mmol）溶解于含10mL异丙醇和50mL氯仿的混合溶剂中，向溶液中加入硅胶（5g）和硼氢化钠（0.12g，3.17mmol），混合液在0℃下搅拌反应45分钟后，倒入100mL冰水当中，过滤除去固体，有机相经无水硫酸镁干燥后得白色固体。

[0037] 3）将步骤2）得到的白色固体（0.5g，1.03mmol）溶于10mL无水二氯甲烷当中，在氮气保护下，向其中加入N,N’-羰基二咪唑（0.34g，2.07mmol）和4-二甲氨基吡啶（0.025g，0.21mmol），混合液在室温下搅拌3小时后，分别用水、饱和碳酸氢钠水溶液，以及盐水洗涤，有机相经无水硫酸镁干燥后，浓缩得白色固体，即合成了带自分解链的糖苷配体。

[0038] （2）氨基修饰的联乙炔分子合成

[0039] 具体步骤如下：

[0040] 1）将10，12-二十五二炔羧酸（PCDA，0.5g，1.33mmol）溶解于20mL无水二氯甲烷当中，向该溶液当中加入N-羟基琥珀酰亚胺（0.3g，1.56mmol）和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）（0.17g，1.5mmol），混合液在室温下搅拌2小时后进行浓缩，浓缩液用20mL乙酸乙酯萃取，并用去离子水洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥后，浓缩的白色固体。

[0041] 2）将步骤1）中的白色固体（0.5g，1.06mmol）溶解于20mL二氯甲烷当中，并向其中缓慢加入2,2’-(亚乙基二氧)双乙胺（0.8mL，5.4mmol），得到的混合液在室温下搅拌3小时后，除去溶剂，残余物溶解于30mL二氯甲烷，用去离子水洗涤，无水硫酸镁干燥，并用硅胶柱纯化（洗脱剂为体积比9:1的二氯甲烷-甲醇），得分子式为[CH3-(CH2)11-C≡C-C≡-(CH2)8-CONH-(CH2O)2-NH2]的氨基化产物，产物为白色固体。

[0042] （3）带有β-D-葡萄糖醛酸糖苷配体联乙炔单体的合成

[0043] 具体步骤如下：

[0044] 1）将（1）中得到的终产物（0.5g，0.86mmol）溶解于7mL无水二氯甲烷中，在氮气保护下，向其中缓慢滴加三氟甲基磺酸甲酯（90μL，0.8mmol），所得混合液在0℃下搅拌反应30分钟，然后向其中加入4mL乙醚，并在-20℃下使生成的产物沉淀，所得沉淀经过滤，乙醚洗涤之后，干燥。将所得固体重新溶解于5mL无水二氯甲烷中，在氮气下，向其中加入（2）中得到的氨基化的联乙炔（0.4g，0.79mmol），冰浴下，向其中加入110μL三乙胺（0.79mmol），混合液在0℃下反应4小时后，使其恢复至室温，再反应2小时。混合液用饱和食盐水洗涤、无水硫酸镁干燥，浓缩。所得固体用硅胶柱（洗脱剂为体积比9:1的二氯甲烷-甲醇）纯化，得浅黄色固体。

[0045] 2）将步骤1）中所得固体（0.2g，0.2mmol）溶于5mL无水甲醇中，在冰浴下，向其中加入28μL含30%甲醇钠（质量百分数）的甲醇，该溶液在室温下反应搅拌反应2小时后，反应用5μL乙酸淬灭。浓缩后，产物用硅胶柱（洗脱剂为体积比60:35:5的二氯甲烷-甲醇-水）纯化，得亮黄色固体，即为目标联乙炔单体PCDA-GlcA。

[0046] 二、制备聚联乙炔变色囊泡

[0047] 将PCDA和PCDA-GlcA按照摩尔比7：3溶解于氯仿中，混合后在旋转蒸发仪上减压除去所有溶剂，加入10mL去离子水，使得混合物浓度最终为1mmol/L，80℃下超声分散20分钟，得到半透明澄清溶液，用0.4μm滤膜过滤后，4℃避光保存。使用时，将其取出，室温下用254nm的紫外灯光照射15分钟，即得所需变色囊泡。

[0048] 三、制备的聚联乙炔变色囊泡检测β-葡萄糖醛酸酶活性

[0049] 检测步骤如下：取0.6mL制备的变色囊泡溶液置入5mL离心管中，加入0.1mL浓度为1mg/mL的β-葡萄糖醛酸酶溶液，用pH为7.4的磷酸盐缓冲（PBS）稀释至2.4mL，在35℃的条件下进行孵育，观察囊泡随时间的颜色变化。同时，每隔十分钟用紫外-可见吸收光谱和荧光光谱记录吸收曲线变化和荧光增长程度。

[0050] 如图2所示，随着孵育时间增加，吸收曲线上蓝相吸收（λ≈645nm）逐渐降低，而红相吸收（λ≈545nm）逐渐增强。同时，此过程伴随荧光逐渐增强现象，其最大发射波长越为560nm。

[0051] 为了更直观的反应这一酶促反应过程，这里使用比色响应值（Colorimetric Response，CR%）和560nm处荧光强度对孵育时间作图，得到酶促反应的曲线变化过程。CR值可以用来衡量变色囊泡的颜色变化程度，其计算公式为：CR=[PB0-PB1]/PB0×100%，其中PB=A645/[A645+A545]，A645是囊泡在蓝相645nm处的吸收，A545是囊泡在红相545nm处的吸收，PB0是在未加入β-葡萄糖醛酸酶时的比例值，而PB1是加入酶之后不同时间点的比例值。

[0052] 如图3所示，在向囊泡溶液中加入不同浓度的β-葡萄糖醛酸酶后所作的CR值和560nm处的荧光强度随孵育时间的变化情况，可以看出，当酶浓度较低时（如0.3和0.6μmmol），CR值和荧光强度均呈现持续缓慢增长过程，而当酶浓度较高时（如1.2和2.4μmmol），CR值和荧光强度变化呈现先快后慢，最终达到平衡的过程，这种现象符合一般酶促反应的规律，说明本发明成功了实现了实时检测酶促反应过程。

[0053] 四、制备的聚联乙炔变色囊泡对酶的抑制剂筛选

[0054] 待测抑制剂溶液配制：这里选取糖质酸-1,4-内酯作为筛选对象，该物质为已知的对β-葡萄糖醛酸酶有较好抑制活性的抑制剂之一。取糖质酸-1,4-内酯溶于PBS中配制成1mmol/L的溶液，并按下述实验的要求稀释至所需浓度。

[0055] 筛选步骤如下：将1mmol/L的抑制溶液用PBS分别稀释成4μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、120μmol/L、320μmol/L、800μmol/L的溶液，取50μL各稀释的溶液于96孔板内，分别加入20μL实例1中所述的β-葡萄糖醛酸酶溶液，35℃下孵育30分钟后，分别加入50μL制备的聚联乙炔囊泡溶液，并用PBS稀释至200μL，最终得到的混合液中各抑制剂浓度分别为1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、30μmol/L、80μmol/L、200μmol/L。另外，对照组设置为：1）50μL囊泡溶液稀释至200μL，不含酶溶液和抑制剂溶液；2）50μL囊泡溶液和20μL酶溶液混合后稀释至200μL，不含抑制剂。将上述各个混合液在35℃下孵育1小时后，利用数码照相机和荧光显微镜分别采集颜色变化图和荧光变化图，其结果如图4所示。从图中可以看出，随着抑制剂浓度升高，聚联乙炔囊泡溶液颜色变化越小，同时伴随荧光越来越弱，当抑制剂浓度达到200μmol/L时，溶液颜色几乎保持蓝色不变，几乎看不到荧光，这充分说明在高浓度的抑制剂可以更充分的抑制酶活，导致酶水解速率下降，无法引起囊泡变色。

[0056] 同时，利用酶标仪测量各个混合液在645nm和545nm处的吸收后可以定量计算不同浓度抑制剂的抑制效率（IE），其计算公式为：IE=（Ra-Rb）/(R0-Rb)×100%，其中R=A545/A645，A为各个混合液在645nm或545nm处的吸收，Ra为含抑制剂的混合液其545nm和645nm出吸收的比值，Rb为不含抑制剂的对照组其545nm和645nm出吸收的比值，而R0则是不含抑制剂和酶溶液的对照组的比值，如图5所示的，为抑制剂浓度的对数对利用上述公式算得的IE值的作图曲线，从图中可以估算出抑制剂的IC50值为33μmol/L。

[0057] 图6是抑制剂浓度的对数对利用荧光强度算得的IE值的作图曲线，其计算公式为：IE=（Fa-Fb）/（F0-Fb）×100%，其中Fa为含抑制剂的混合液的荧光强度，Fb为不含抑制剂的对照组的荧光强度，F0为不含抑制剂和酶溶液的对照组的荧光强度。