一种荧光标记多重PCR艰难梭菌检测试剂盒

摘要

本发明提供了一种艰难梭菌菌株鉴定及毒素基因分析的荧光标记多重PCR检测试剂盒，该试剂盒包括6对用于检测艰难梭菌菌株的荧光标记引物，所述特异性引物由艰难梭菌种特异性的磷酸丙糖异构酶（triosephosphate isomerase，tpi）基因、毒素A基因（tcdA）、毒素B（tcd B），tcdC基因（tcdC）、二元毒素A（cdtA）和二元毒素B（cdtB）的特异性引物组成。扩增结果用毛细管电泳检测。依照该方法，可以较快速的鉴定艰难梭菌的有无以及确定毒素分型。

权利要求

1.一种荧光标记多重PCR艰难梭菌检测试剂盒，其特征在于，包括有用于扩增艰难梭菌的以下基因座的引物：tpi、tcdA、tcd B、tcdC、cdtA和cdtB；所述的引物序列是：tpi，SEQ ID NO.1～2；tcdA，SEQ ID NO.3～4；tcdB，SEQ ID NO.5～6；tcdC，SEQ ID NO.7～8；

cdtA，SEQ ID NO.9～10；cdtB，SEQ ID NO.11～12。

2.根据权利要求1所述的荧光标记多重PCR艰难梭菌检测试剂盒，其特征在于，各个引物在扩增体系中的浓度是：SEQ ID NO.1～2、0.80 μM；SEQ ID NO.3～4、0.60 μM；SEQ ID NO.5～6、0.50 μM；SEQ ID NO.7～8、1.0 μM；SEQ ID NO.9～10、1.1 μM；SEQ ID NO.11～12、0.85 μM。

3.根据权利要求1所述的荧光标记多重PCR艰难梭菌检测试剂盒，其特征在于：每个基因座所对应的2条引物中，至少有1条是经过荧光标记的。

4.根据权利要求1所述的荧光标记多重PCR艰难梭菌检测试剂盒，其特征在于：每个基因座所对应的2条引物中，至少有1条是经过荧光标记的，是采用FAM、HEX、TAMRA或ROX中的任意一种进行标记。

5.根据权利要求2所述的荧光标记多重PCR艰难梭菌检测试剂盒，其特征在于，试剂盒的组成如下：反应混合物 10.0 μL、基因组DNA 0.1～10μl、引物混合物5 μL、热启动Taq酶0.5 μL、sdH2O补足至25.0μL；所述的反应混合物中含有MgCl2 7.5mM，Tris-HCl 缓冲液125mM，KCl 125mM，dNTPs 7.5mM ，BSA 2mg/ml。

说明书

一种荧光标记多重PCR艰难梭菌检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及包括，用于检测艰难梭菌（Clostridium difficile）菌株或有毒艰难梭菌菌株的试剂盒，及检测鉴定样品中的艰难梭菌有无及毒素分型的方法。

背景技术

[0002] 艰难梭菌（Clostridium difficile）为革兰阳性产芽孢厌氧杆菌。艰难梭菌本身没有侵袭性，部分产毒细菌通过分泌毒素A、毒素B以及二元毒素引起抗生素相关性腹泻、结肠炎甚至致死性假膜性肠炎，统称为艰难梭菌感染（Clostridium difficile infection,CDI）。医院获得感染性腹泻所明确的病原中，以艰难梭菌最为常见；在抗生素相关性腹泻病因中，艰难梭菌亦占20%～30%；而假膜性肠炎则几乎100%由艰难梭菌所致。在美国，艰难梭菌感染是引起医院感染性腹泻的第一位原因。

[0003] 尽管长期以来一直将这种微生物当作一种能引起严重后果的不常见感染的病原菌，但最近几年，艰难梭菌感染的特征已发生了变化。过去五年来，有很多关于艰难梭菌导致的疾病发生率、疾病的严重程度以及致死率等增加的报道。这种流行病学的改变与出现了一种新的高毒力的艰难梭菌菌株有关，这种菌株被称为艰难梭菌NAP1（North American pulsed-field type1）、PCR核糖型027（polymerase chain reaction ribotype027）流行菌株，该菌株拥有以前常见艰难梭菌所没有的一些特征，如毒素TcdA和TcdB的产生量增加，携带产生第三种毒素，又叫二元毒素（binary toxin）的基因，并出现tcd C基因中18个碱基对缺失。对喹诺酮类抗生素的耐药性增加。由于NAPI／027菌株毒素A、B的产量分别较普通菌株高16倍及23倍，因此引起严重的艰难梭菌相关性疾病。

[0004] 艰难梭菌检测有直接粪便毒素测定包括细胞毒素测定（CTA）、酶免疫测定以及。CTA中毒素B的检测被认为是艰难梭菌检测的金标准。但该试验需要48～72h，并且实验条件要求较高，其结果的可靠性在不同的实验室之间变化也很大。

[0005] 荧光定量检测的方法检测因其快速、灵敏逐渐成为艰难梭菌检测的主流检测技术。初步统计，美国食品和药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）认证的定量检测产品有BD公司的Gene-Ohm检测系统，Gen-Probe公司的proGastro检测系统，Cepheid公司的Xpert检测系统，Great Basin公司的Portrait检测系统，Focus DX公司的Simplexa检测系统。这些检测系统除Xpert都只检测艰难梭菌毒素B（tcd B）基因。并且Cepheid公司的Xpert检测系统同时检测毒素B（tcdB）,tcdC基因缺失（tcd C deletion），二元毒素（Binary Toxin）。

[0006] 中国专利申请201310108285.6提供的方案在检测单基因时灵敏度可以做到1个拷贝，但是没有给出如何进行多重PCR扩增的技术启示。

[0007] 中国专利申请201310316848.0提供的检测系统可同时检测四个基因座，艰难梭菌毒素A（tcdA）、毒素B（tcdB）、二元毒素A（cdtA）和二元毒素B（cdtB），灵敏度最低为3pg/μl。可见复扩的定量PCR灵敏度比单重检测的要低。

发明内容

[0008] 本发明的目的是：提供一种可以同时检测艰难梭菌菌种特异性的磷酸丙糖异构酶（triosephosphate isomerase，tpi）基因、毒素A基因（tcdA）、毒素B（tcd B）、tcdC基因（tcdC）、二元毒素A（cdtA）和二元毒素B（cdtB）的复合扩增试剂盒，需要其具有分型准确、检测限低的优点。

[0009] 技术方案：

[0010] 一种荧光标记多重PCR艰难梭菌检测试剂盒，包括有用于扩增艰难梭菌的磷酸丙糖异构酶（triosephosphate-isomerase，tpi）基因、毒素A基因（tcdA）、毒素B基因（tcd B）、tcdC基因（tcdC）、二元毒素A基因（cdtA）和二元毒素B基因（cdtB）所对应的引物。

[0011] 磷酸丙糖异构酶是艰难梭菌菌种特异性蛋白，通过检测磷酸丙糖异构酶（triosephosphate-isomerase，tpi）基因的有无鉴定样本中是否含有艰难梭菌。设计特异性引物分别扩增毒素A基因（tcdA）、毒素B基因（tcd B）、tcdC基因（tcdC）、二元毒素A基因（cdtA）和二元毒素B基因（cdtB），检测艰难梭菌是否含毒素A基因、毒素B基因、二元毒素A基因（cdtA）、二元毒素B基因（cdtB）以及cdtC基因是否纯在缺失，实现鉴别艰难梭菌的毒素类型。特别的是，本发明通过加入对tpi基因座的检测，可以对艰难梭菌进行特异性的检测，有利于防止传统的基因座检测中可能出现的误判断，另外，通过加入对tcdC基因座的检测可以检测样本中菌株是否会含有C毒素的基因。

[0012] 上述的引物优选以及引物在扩增体系中的优选浓度如表1所示：

[0013] 表1优选引物序列及浓度

[0014]

[0015]

[0016] 上述的每个基因座所对应的2条引物中，至少有1条是经过荧光标记的，优选采用FAM、HEX、TAMRA或ROX等中的任意一种进行标记。

[0017] 上述的试剂盒的优选扩增体系如表2所示。

[0018] 表2PCR加样体系

[0019]组分 体积
Reaction Mix 10.0μL
基因组DNA 0.1～10μl含量为0.5pg～0.5ng
引物混合物 5μL
热启动Taq酶（5U/μL） 0.5μL
sdH2O 补足至25.0μL

[0020] 其中所述的Reaction Mix中含有MgCl27.5mM，Tris-HCl buffer125mM，KCl125mM，dNTPs7.5mM，BSA2mg/ml。其中基因组DNA样品可以是菌液，也可以是提取DNA。

[0021] 本发明的另一个目的是提供了一种基于上述试剂盒的荧光标记多重PCR艰难梭菌检测方法，包括如下步骤：

[0022] 第1步、提取目标DNA样本；

[0023] 第2步、采用试剂盒的扩增体系对DNA样本进行多重PCR扩增；

[0024] 第3步、对扩增产物进行电泳，并对结果进行分析。

[0025] 上述的PCR扩增中的优选扩增参数如表3所示：

[0026] 表3热循环仪的扩增程序

[0027]

[0028] 电泳优选采用多道或单道毛细管电泳。

[0029] 有益效果

[0030] 本发明的有益效果在于：提供了一种鉴定艰难梭菌有无，并且对毒素A，毒素B，二元毒素A及二元毒素等毒素的有素和tcdC基因是否缺失同时进行检测的试剂盒及分析方法。在一次扩增、检测中给出更多的信息。实际样本检测验证，本发明经大量试验和优化，通过对引物的设计和对扩增体系和参数的调整，可对低至26个拷贝的艰难梭菌准确分型。

附图说明

[0031] 附图1a是实施例2中样本稀释6次的扩增结果图，第一行扩增峰为毒素扩增峰，依次为缺18bp的tcdC扩增峰，tpi基因扩增峰，tcdA基因扩增峰，cdtA基因扩增峰，tcdB扩增峰，cdtB扩增峰，扩增峰高均在8000以上；第二行峰为分子量marker AGCU SIZ-500的峰，由无锡中德美联生物技术有限公司生产及销售，以siz荧光标记，从75bp到500bp，分别是75，100，139，150，160，200，250，300，340，350，400，450，490，500，共14个片段。

[0032] 附图1b是实施例2中样本稀释17次的扩增结果图，缺18bp的tcdC，tpi基因，tcdA基因，cdtA基因，tcdB扩增，cdtB扩增都有扩增，峰高在7000左右。

[0033] 附图1c是实施例2中样本稀释19次的扩增结果图，缺18bp的tcdC，tpi基因，tcdA基因，cdtA基因，tcdB扩增，cdtB扩增都有扩增，峰高在3000左右。此时的模板浓度为54.2fg/μl，25μl扩增体系加样2μl，扩增体系中模板总量为108.4fg，相当于26个艰难梭菌基因组拷贝。附图1d是实施例2中样本稀释20次的扩增结果图，缺18bp的tcdC，tpi基因，tcdA基因，cdtA基因，tcdB扩增，cdtB扩增都有扩增，峰高在1000左右。除这些理论上应该出的峰，tcdC出现不缺失的扩增峰（标记为nor）。推测随着模板量的减少，引物随机扩增、或者是扩增滑脱导致的非特异扩增。至此稀释浓度，扩增结果开始变的不可靠。

[0034] 附图1e是实施例2中样本稀释21次的扩增结果图，tcdC出现两个扩增峰，cdtB扩增丢失，其余扩增峰高在100左右。

[0035] 附图1f是实施例2中样本稀释22次的扩增结果图，除tpi、cdtA峰高高于50，其余基因扩增峰高都低于50。

[0036] 附图2a是实施例3中一类样本的扩增检测图，第一行峰为检测扩增峰，tcdA，tcdB，tcdC，tpi，tcdA及tcdB无扩增，第二行为分子量marker SIZ500。

[0037] 附图2b是实施例3中另一类样本的扩增检测图，第一行峰为检测扩增峰，tpi有扩增，tcdA，tcdB，tcdC，tcdA，tcdB无扩增；第二行为分子量marker，SIZ500。

[0038] 附图2c是实施例3中另一类样本的扩增检测图：第一行峰为检测扩增峰，tcdA，tcdB，tcdC及tpi有扩增，其中tcdC为正常大小，标注为NOR；tcdA，tcdB无扩增；第二行为分子量marker，SIZ500。

[0039] 附图2d是实施例3中另一类样本的扩增检测图：第一行峰为检测扩增峰，tpi，tcdA，tcdB，tcdC，tcdA及tcdB有扩增，其中tcdC为缺失18bp的等位基因级（标注为-1）；第二行为分子量marker，SIZ500。

具体实施方式

[0040] 下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0041] 实施例1试剂盒的设计

[0042] 从NCBI genebank中下载引物设计模板序列，如表4。

[0043] 表4模板序列表

[0044]基因座 序列Genebank号 位置
tpi AM180355.1 3706953-3707696
tcdA JQ809335.1 1-8133
tcdB AF217292.1 1-7512
ctdC HQ596359.1 1-1006
cdtA AF271719.1 1-1392
cdtB AF271719.1 1445-4075

[0045] 每个基因座序列在genebank中比对，选择其中最保守的区域设计引物。

[0046] 以TcdA的引物设计为例，将引物设计模板JQ809335.1全序列在NCBI blast比对，确定了nt4000-6000序列特异性较高，以这部分序列为引物设计模板设计了4对引物组，如下表。

[0047] 表5TcdA初始设计的引物

[0048]引物
由上海生工合成，单对引物做退火温度梯度扩增，每对引物其中一条以FAM荧光标记。

[0049] 采用的样本艰难梭菌菌株155是由浙江省疾控中心筛选的菌株，并确定了全基因组序列，基因组全长为4.2MB，单拷贝基因组重量为4.2fg。经过测序列验证，该菌株含二元毒素A和B、毒素A和毒素B及存在tcdC18bp缺失。在该菌株上本发明涉及的6个基因组序列与genebank公开的序列的同源性达到100%。

[0050] 扩增所用的样本是浙江省疾控中心提供的28.4ng/μl（每μl含6.8×106拷贝基因组DNA）155菌株DNA模板。进行PCR扩增时的扩增体系如表6。

[0051] 表6PCR加样体系

[0052]组分 体积
Reaction Mix 10.0μL
基因组DNA 0.1～10μL含量为0.5pg～0.5ng
引物混合物 5μL
热启动Taq酶（5U/μL） 0.5μL
sdH2O 补足至25.0μL

[0053] 其中所述的Reaction Mix中含有MgCl27.5mM，Tris-HCl buffer125mM，KCl125mM，dNTPs7.5mM，BSA2mg/ml。

[0054] 再进行PCR扩增热循环：

[0055] （l）将PCR扩增管置于热循环仪上；

[0056] （2）选择表7的程序进行扩增；

[0057] （3）扩增后的样品应避光保存；

[0058] 表7温度梯度扩增程序

[0059]

[0060] 其中延伸温度分别为54℃，56℃，58℃，60℃，62℃，64℃。其余步骤温度相同。做梯度测试。

[0061] 接下来，再进行扩增产物在遗传分析仪上荧光检测。

[0062] 由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCU Marker SIZ-500组成上样混合物〔（0.5μlAGCU Marker SIZ-500(制备方法参照专利CN101307226中披露的本公司自主研发的siz500荧光标记内标，总共13条荧光标记片段：75bp、100bp、139bp、150bp、160bp、200bp、250bp、300bp、340bp、350bp、400bp、450bp、500bp)）×（进样数）＋（12μl去离子甲酰胺）×（进样数）〕。将12.5μl上样混合物与PCR产物混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析；用片段分析软件GeneMapper分析步骤C中遗传分析仪检测收集的数据。电泳采用多道或单道毛细管电泳。

[0063] 经实验测试，引物组3、4在62℃、64℃扩增容易丢失；引物组2在56℃以下有非特异扩增；引物组1在部分样本扩增效率低，经测序验证，发现导致这一问题的原因是1R引物距3撇端第3个碱基所对应的样本序列上存在t>c的突变。

[0064] 经过大量的试验摸索，发现通过引物5（即SEQ ID NO.3～4较好地克服上述的扩增问题，如表8所示）

[0065] 表8优选的TcdA初始设计的引物

[0066]

[0067]

[0068] 最后确定引物5进入复合扩增测试。类似地，还需要对其它的基因座所对应的引物进行设计和试验，再通过复合扩增测试进行引物设计、浓度和扩增参数的再次调整。

[0069] 经过大量的引物的序列及浓度重新调整之后，最终确定了引物序列及引物浓度，如表9，复合扩增引物测试的加样体系如表10，扩增参数如表11。引物扩增效率高，相互之间无非特异扩增。扩增产物的大小与预期一致，经过将扩增产物切胶后测序，与目标序列一致。验证了该试剂盒的准确性。

[0070] 表9优选引物序列及浓度

[0071]

[0072] 表10PCR加样体系

[0073]组分 体积
Reaction Mix 10.0μL
基因组DNA 0.1～10μl含量为0.5pg～0.5ng
引物混合物 5μL
热启动Taq酶（5U/μL） 0.5μL
sdH2O 补足至25.0μL

[0074] 表11热循环仪的扩增程序

[0075]

[0076] 实施例2系统灵敏度测试

[0077] 艰难梭菌菌株155是由浙江省疾控中心筛选的菌株，并确定了全基因组序列，基因组全长为4.2MB，单拷贝基因组重量为4.2fg。该菌株含二元毒素A和B、毒素A和毒素B及存在tcdC18bp缺失。6

[0078] 将浙江省疾控中心提供的28.4ng/μl（每μl含6.8×10拷贝基因组DNA）155菌株DNA，以二倍稀释法稀释，连续稀释22次，第一次稀释后的浓度为14.2ng/μl(每微升6
拷贝数3.4×10)；第22次稀释的浓度为6.8fg/μl，每μl约含1.6拷贝基因组。以这22个稀释后的模板为扩增模板，检测体系的检测限(灵敏度)。

[0079] 引物采用如表9所示，每对引物其中一条以FAM荧光标记，按表12的加样体系加样，按表13的扩增程序进行扩增。

[0080] 表12PCR加样体系

[0081]组分 体积
Reaction Mix 10.0μL
基因组DNA 2μl
引物混合物 5μL
热启动Taq酶（5U/μL） 0.5μL
sdH2O 补足至25.0μL

[0082] 其中所述的Reaction Mix中含有MgCl27.5mM，Tris-HCl buffer125mM，KCl125mM，dNTPs7.5mM，BSA2mg/ml。

[0083] 表13PCR扩增程序

[0084]

[0085] 扩增结果按实施例1中的电泳检测、数据分析方法进行分析，每个稀释浓度重复3管扩增。

[0086] 随着稀释倍数的增多，扩增峰逐步降低。第20次稀释时，tcdC出现非特异扩增，第21次稀释时，扩增峰高低于200，出现扩增丢失。部分扩增分析结果如附图1a-1f。（附图是电泳结果经美国AB公司genemapper IDX软件分析之后的图谱。）

[0087] 附图1a是稀释6次的扩增结果，第一行扩增峰为毒素扩增峰，依次为缺18bp的tcdC扩增峰，tpi基因扩增峰，tcdA基因扩增峰，cdtA基因扩增峰，tcdB扩增峰，cdtB扩增峰，扩增峰高均在8000以上；第二行峰为分子量marker AGCU SIZ-500的峰，由无锡中德美联生物技术有限公司生产及销售，以siz荧光标记，从75bp到500bp，分别是75，100，139，150，160，200，250，300，340，350，400，450，490，500，共14个片段。

[0088] 附图1b是稀释17次的扩增结果，缺18bp的tcdC，tpi基因，tcdA基因，cdtA基因，tcdB扩增，cdtB扩增都有扩增，峰高在7000左右。

[0089] 附图1c是稀释19次的扩增结果，缺18bp的tcdC，tpi基因，tcdA基因，cdtA基因，tcdB扩增，cdtB扩增都有扩增，峰高在3000左右。此时的模板浓度为54.2fg/μl，25μl扩增体系加样2μl，扩增体系中模板总量为108.4fg，相当于26个艰难梭菌基因组拷贝。

[0090] 附图1d是稀释20次的扩增结果,缺18bp的tcdC，tpi基因，tcdA基因，cdtA基因，tcdB扩增，cdtB扩增都有扩增，峰高在1000左右。除这些理论上应该出的峰，tcdC出现不缺失的扩增峰（标记为nor）。推测随着模板量的减少，引物随机扩增、或者是扩增滑脱导致的非特异扩增。至此稀释浓度，扩增结果开始变的不可靠。

[0091] 附图1e是稀释21次的扩增结果，tcdC出现两个扩增峰，cdtB扩增丢失，其余扩增峰高在100左右。

[0092] 附图1f是稀释22次的扩增结果，除tpi、cdtA峰高高于50，其余基因扩增峰高都低于50。

[0093] 为保证检测结果的可靠，设定检测灵敏度为25μl体系，模板108.4fg，相当于26个艰难梭菌基因组拷贝。

[0094] 实施例3

[0095] 13个粪便样本由浙江疾控中心惠赠，先期在浙江省疾控中心以菌种培养法、单重定量PCR检测，鉴定分析过菌株。

[0096] 粪便基因组的提取是以Qiagen公司的QIAamp DNA stool Mini Kit试剂盒，按操作说明进行，模板经定量浓度在0.5～2ng/μl。

[0097] 13个粪便基因组DNA按实施例1最终确定的的引物组、扩增体系、扩增程序扩增，并且如实施例1的检测方法检测。软件分析峰高高于200rfu，认为相应的基因有扩增。反之，分析结果峰高低于200rfu，认为无扩增，即不含相应的基因。

[0098] 13个样本，经本方案检测分为四种类型：3个样本无扩增峰，不含艰难梭菌(扩增检测图如附图2a)；4个样本仅tpi有扩增峰，毒素相关基因无扩增，证明不含毒素(扩增图如附图2b)；5个样本毒素A，毒素B，tpi有扩增，tcdC有扩增并且无碱基缺失，为含毒素A、毒素B的艰难梭菌(扩增图如附图2c)；1个样本毒素A，毒素B，二元毒素A、二元毒素B，tpi有扩增，tcdC有扩增并且有18个碱基缺失(扩增图如2d)。四种型的检测结果如附图2a～2d，无特异性扩增。检测结果与菌种培养、单重定量PCR检测结果一致，将扩增产物切胶后进行测序验证，与公开序列的同源性达到100%。