一种白癜风动物模型的构建方法

摘要

本发明公开了一种白癜风动物模型的构建方法，所述白癜风动物模型按如下方法构建：用质量浓度20～60%莫诺苯宗溶液或乳化制剂，在小鼠背部涂药，涂药量以莫诺苯宗计为每平方厘米的体表面积予以5～20mg，然后在小鼠使用莫诺苯宗溶液或乳化制剂部位的皮下注射胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸溶液，隔三天一次，每次注射量以胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸质量计为10～15μg/g体重，经过21～50天的培养即造模成功；本发明提供了一种简单方便的白癜风动物模型构建方法，为白癜风的进一步实验研究提供了研究基础。

权利要求

1.一种白癜风动物模型的构建方法，其特征在于：所述白癜风动物模型按如下方法构建：用质量浓度20～60%莫诺苯宗溶液或乳化制剂，在小鼠背部涂药，涂药量以莫诺苯宗计为每平方厘米的体表面积予以5～20mg，然后在小鼠使用莫诺苯宗溶液或乳化制剂部位的皮下注射胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸溶液，隔三天一次，每次注射量以胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸质量计为10～15μg/g体重，经过21～50天的培养即造模成功；所述胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸溶液是将胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸用pH值为7.4的PBS缓冲液配置成胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸溶液。

2.如权利要求1所述的白癜风动物模型的构建方法，其特征在于：所述莫诺苯宗乳化制剂为水包油型莫诺苯宗乳膏。

3.如权利要求2所述的白癜风动物模型的构建方法，其特征在于所述水包油型莫诺苯宗乳膏质量组成为：莫诺苯宗200～600g、硬脂酸27g、十八醇27g、液体石蜡54.15g、月桂氮卓酮6.075g、三乙醇胺2.1g、甘油104.325g、羟苯乙酯0.3g、乙二胺四乙酸二钠0.3g，蒸馏水补足至1000g。

4.如权利要求2所述白癜风动物模型的构建方法，其特征在于：所述水包油型莫诺苯宗乳膏的质量浓度为35～40%。

5.如权利要求3所述白癜风动物模型的构建方法，其特征在于：所述水包油型莫诺苯宗乳膏按如下方法配制：按配方量，将乙二胺四乙酸二钠、甘油、羟苯乙酯、三乙醇胺加入蒸馏水中，在水浴上加热，搅匀，制成水相，80℃保温；取莫诺苯宗、硬脂酸、十八醇、月桂氮卓酮与液体石蜡混合，加热，搅匀，制成油相，80℃保温；随即将水相慢慢加入油相中，立即同方向搅拌至凝，即得莫诺苯宗水包油型乳膏。

6.如权利要求1所述白癜风动物模型的构建方法，其特征在于：所述胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸溶液的浓度为1mg/ml。

7.如权利要求1所述的白癜风动物模型的构建方法，其特征在于：所述白癜风动物模型按如下方法构建：用质量浓度20～60%水包油型莫诺苯宗乳膏在小鼠背部涂药，每日一次，每次涂药量以莫诺苯宗质量计为每平方厘米的体表面积予以5～15mg，然后在小鼠使用莫诺苯宗乳膏部位的皮下注射胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸溶液，每隔三天一次，每次注射量以胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸质量计为每克小鼠体重予以10μg，经过21～50天的培养即造模成功；所述胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸溶液是将胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸用pH值为7.4的PBS缓冲液配置成1mg/ml溶液。

说明书

一种白癜风动物模型的构建方法

（一）技术领域

[0001] 本发明涉及利用莫诺苯宗联合胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸(cytosine-phophate-guanine oligodeoxynucleotide，CpG ODN)诱导小鼠白癜风模型的构建方法。（二）背景技术

[0002] 白癜风是一种皮肤T细胞介导的自身免疫性疾病，以为局部或泛发性色素脱失为主要表现。近年来白癜风发病率逐年上升，其病因尚未明确，发病机制学说众多，如自身免疫学说、黑素细胞自身破坏学说、神经化学因子学说、黑素细胞生长因子缺乏学说、遗传因素等。很多学者在白癜风实验研究方面做了大量的工作，取得了很大进展，建立合理的白癜风动物模型有助于我们更加深入研究白癜风的发病机制和防治措施。

[0003] 莫诺苯宗的脱色作用主要是通过酪氨酸酶与活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的相互作用完成。起初通过黑素小体自噬作用和酪氨酸酶的泛素化作用，提呈黑素小体相关抗原并在表面产生MHC（主要组织相容性复合物）Ⅰ和II分子，直接诱导+ +CD8T和CD4T反应，形成黑素细胞特异性抗体，这一现象在白癜风患者体内可观察到。此外，低水平表达的ROS可以加快外源性抗原分泌物的排泄，从而促进树突细胞提呈黑素细+
胞特异性抗原，形成CD8T细胞自身抗原；莫诺本宗接触皮肤后形成的醌半抗原可能激活自身免疫反应，NLRP3的病毒相关性抗原触发炎症反应，并且在局部有树突细胞和角质形成细胞，这种自身免疫反应激活DCs分泌TLR-7和TLR-9及角质形成细胞分泌TLR-9。ROS可能间接促进来自莫诺苯宗暴露细胞的ATP释放，进一步促进局部DC刺激病毒感染相关抗原引起NLRP3炎症反应，这些促炎症反应的细胞因子激活NK细胞作用。半抗原特异性CD8+T细胞通过杀灭处于表面的莫诺本宗暴露的黑素细胞，这些黑素细胞分解碎片并被吞噬细胞摄取，从而增加血清中抗原特异性抗体形成免疫复合物，通过溶解莫诺本宗暴露细胞和释放相关细胞因子，引起远处出现免疫反应。

[0004] CpG就是其中的一种新型佐剂，是人工合成的以未甲基化的CpG二核苷酸为核心的寡核苷酸序列，CpG除对非特异性免疫有影响外，还能提高共免疫抗原的特异性免疫应答，不仅提高细胞毒性T细胞反应，而且能提高免疫球蛋白的产量，因而已引起人们的广泛关注。CpG可能直接活化B细胞和巨噬细胞，诱导它们分泌IL-6、IL-12和TNF-a等细胞因子，这些细胞因子激活B、T细胞或受Thl型细胞因子的作用，使机体特异性细胞与体液免疫反应同时增强。基于以上，我们通过莫诺苯宗联合CPG诱导小鼠产生白癜风具有可行性。（三）发明内容

[0005] 本发明目的是提供一种新的白癜风动物模型，特别是利用莫诺苯宗和胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸构建白癜风动物模型。

[0006] 本发明采用的技术方案是：

[0007] 本发明提供一种白癜风动物模型的构建方法，所述白癜风动物模型按如下方法构建：用质量浓度20～60%莫诺苯宗乳膏溶液或乳化制剂（所述溶液或乳化制剂是指能够溶解莫诺苯宗且对皮肤无其他副作用的介质），在小鼠背部涂药，每日一次，涂药量以莫诺苯宗质量计为每平方厘米的体表面积予以5-20mg（优选5～15mg），然后在小鼠使用莫诺苯宗溶液或乳化制剂部位的皮下注射胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸溶液（CPG），隔三天一次，每次注射量以胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸质量计为每克小鼠体重予以10～15μg，经过21～50天的培养即造模成功；所述CPG溶液是将CPG用pH值为7.4的PBS缓冲液配置成CPG溶液。

[0008] 进一步，优选所述莫诺苯宗乳化制剂为水包油型莫诺苯宗乳膏。

[0009] 进一步，所述水包油型莫诺苯宗乳膏质量组成为：莫诺苯宗200～600g，硬脂酸27g，十八醇27g，液体石蜡54.15g，月桂氮卓酮6.075g，三乙醇胺2.1g，甘油104.325g，羟苯乙酯0.3g，乙二胺四乙酸二钠0.3g，蒸馏水补足至1000g。

[0010] 进一步，所述水包油型莫诺苯宗乳膏的质量浓度优选为35～40%，更优选40%。

[0011] 本发明所述水包油型莫诺苯宗乳膏按如下方法配制：按配方量，将乙二胺四乙酸二钠、甘油、羟苯乙酯、三乙醇胺加入适量水中，在水浴上加热至80℃左右，搅匀，制成水相，80℃保温，备用；取莫诺苯宗、硬脂酸、十八醇、月桂氮卓酮与液体石蜡混合，加热至80℃，搅匀，制成油相，80℃保温。随即将水相慢慢加入油相中，立即快速搅拌至凝，即得水包油型莫诺苯宗乳膏。

[0012] 进一步，优选所述胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸溶液的浓度为1mg/ml。

[0013] 更进一步，本发明所述白癜风动物模型推荐按如下方法构建：用质量浓度20～60%水包油型莫诺苯宗乳膏在小鼠背部涂药，每日一次，每次涂药量以莫诺苯宗质量计为每平方厘米的体表面积予以5-15mg（更优选10mg），然后在小鼠使用莫诺苯宗乳膏部位的皮下注射胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸溶液，每隔三天一次，每次注射量以胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸质量计为每克小鼠体重予以10μg，经过21～50天的培养即造模成功；所述胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸溶液是将胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸用pH值为7.4的PBS缓冲液配置成1mg/ml溶液。

[0014] 本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种简单方便的白癜风动物模型构建方法，为白癜风的进一步实验研究提供了研究基础。（四）附图说明

[0015] 图1为实施例1中小鼠毛发脱色变化照片，a为III组鼠用药部位脱色斑（圆圈处），躯干的非用药部位脱色斑（箭头处），b为III组小鼠尾部脱色斑（箭头处），c为Ⅰ组，d为Ⅰ组、II组、III组和IV组脱色发生率图，d为Ⅰ组、II组、III组和IV组脱色面积评分图。

[0016] 图2为实施例1共聚焦激光扫描显微镜（RCM）观察小鼠用药部位黑色素及黑素细胞，a为Ⅰ组（箭头指示折光强），b为II组（箭头指示折光弱）、c为III组（箭头指示折光弱）和d为IV组（箭头指示折光弱）。

[0017] 图3为实施例1小鼠脱色部位组织的HE染色照片，a为Ⅰ组，b为II组、c为III组和d为IV组。

[0018] 图4为实施例1小鼠脱色部位CD8+T细胞的浸润情况，a为Ⅰ组，b为II组、c为III组和d为IV组。

[0019] 图5为小鼠血清中IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-13变化情况，a为IFN-γ变化情况，b为IL-6变化情况，c为IL-13变化情况，d为TNF-α变化情况。

[0020] 图6为实施例2中小鼠毛发脱色变化照片，a为III组鼠用药部位脱色斑（圆圈处），躯干的非用药部位脱色斑（箭头处），b为III组小鼠尾部脱色斑（箭头处），c为Ⅰ组。

[0021] 图7为实施例2共聚焦激光扫描显微镜（RCM）观察小鼠用药部位黑色素及黑素细胞，a为Ⅰ组，b为II组，c为III组。

[0022] 图8为实施例2小鼠脱色部位CD8+T细胞的浸润情况，a为Ⅰ组，b为II组，c为III组。（五）具体实施方式

[0023] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

[0024] 实施例1：

[0025] 一、试剂及材料：

[0026] C57BL/6小鼠，雌性，体质量(15±2)g，购于上海斯莱克实验动物有限公司[生产许可证号SCXK（沪）2012-0002]。

[0027] 质量浓度40%莫诺苯宗乳膏质量组成：莫诺苯宗400g，硬脂酸27g，十八醇27g，液体石蜡54.15g，月桂氮卓酮6.075g，三乙醇胺2.1g，甘油104.325g，蒸馏水378.75g，羟苯乙酯0.3g，乙二胺四乙酸二钠0.3g。

[0028] 质量浓度20%莫诺苯宗乳膏质量组成为：莫诺苯宗200g，硬脂酸27g，十八醇27g，液体石蜡54.15g，月桂氮卓酮6.075g，三乙醇胺2.1g，甘油104.325g，蒸馏水578.75g，羟苯乙酯0.3g，乙二胺四乙酸二钠0.3g。

[0029] 质量浓度60%莫诺苯宗乳膏质量组成为：莫诺苯宗600g，硬脂酸27g，十八醇27g，液体石蜡54.15g，月桂氮卓酮6.075g，三乙醇胺2.1g，甘油104.325g，蒸馏水178.75g，羟苯乙酯0.3g，乙二胺四乙酸二钠0.3g。

[0030] 水包油乳膏基质质量组成：硬脂酸27g，十八醇27g，液体石蜡54.15g，月桂氮卓酮6.075g，三乙醇胺2.1g，甘油104.325g，蒸馏水178.75g，羟苯乙酯0.3g，乙二胺四乙酸二钠
0.3g。

[0031] CPG：生工生物工程（上海）股份有限公司

[0032] 兔抗鼠CD8单克隆抗体：ZSGB-BIO公司；

[0033] FITC标记羊抗兔二抗：ZSGB-BIO公司；

[0034] IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-13ELISA试剂盒：MULTISENCES公司；

[0035] 皮肤共聚焦激光扫描显微镜（reflectance confocal microscopy，RCM），美国Lucid公司，VIVASCOPE1500型，波长830nm，最大输出16.0mw；

[0036] 免疫荧光共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy，CLSM）：日本OLYMPUS公司，Fluo View FV1000型。

[0037] 二、实验步骤

[0038] （1）水包油型莫诺苯宗乳膏按如下方法配制：按配方量，将乙二胺四乙酸二钠、甘油、羟苯乙酯、三乙醇胺加入适量水中，在水浴上加热至80℃左右，搅匀，制成水相，80℃保温，备用；取莫诺苯宗、硬脂酸、十八醇、月桂氮卓酮与液体石蜡混合，加热至80℃，搅匀，制成油相，80℃保温。随即将水相慢慢加入油相中，立即快速搅拌至凝，即得水包油型莫诺苯宗乳膏。

[0039] CPG溶液：将CPG用pH值为7.4的PBS缓冲液配制成1mg/ml溶液。

[0040] （2）分组：C57BL/6小鼠40只，随机分为阴性对照组（Ⅰ组）、20wt%莫诺苯宗乳膏组（II组）、40wt%莫诺苯宗乳膏组（III组）、60wt%莫诺苯宗乳膏组（IV组）4个组，每组10只，脱去小鼠背部黑色毛2cm×2cm，涂药。Ⅰ组每天涂抹水包油乳膏基质，II组每天涂抹20wt%莫诺苯宗乳膏，III组每天涂抹40wt%莫诺苯宗乳膏，IV组每天涂抹60wt%莫诺苯宗乳膏。Ⅰ组、II组、III组和IV组每天涂抹一次乳膏，每次莫诺苯宗乳膏涂抹量为每平方厘米的体表面积予25mg，II组、III组和IV组涂药后在小鼠使用莫诺苯宗乳膏部位的皮下注射1mg/ml的CPG溶液，隔三天一次，1mg/ml的CPG溶液每次注射量为每克小鼠体重予以
10μl。各组小鼠用药50天，完成模型的构建。停药后连续15天肉眼观察小鼠毛发颜色和脱色面积变化，通过RCM观察皮肤脱色。

[0041] （3）毛发脱色评估：每日肉眼观察毛发脱色，并进行积分记录。将脱色部位分为用药部位和非用药部位，每个部位总分为5分，每只小鼠共10分。小鼠毛发脱色评分标准为：0分毛发无脱色：1分毛发有脱色＞0-10%；2分毛发脱色面积＞10-25%；3分毛发脱色面积＞25-50%；4分毛发脱色面积＞50-75%：5分毛发脱色面积＞75-100%。

[0042] （4）皮肤脱色观察：激光共聚焦显微镜（RCM）使用的是一种波长为830nm的二极管激光，它的最大能力不超过35mW。物镜的放大倍数为30倍。实时观察建模前后小鼠正常区和脱色区皮肤处在同一层面进行观察皮肤内黑素细胞，并拍照。

[0043] （5）石蜡切片及HE染色:取小鼠非用药部位脱色区域的皮肤，放入4%福尔马林溶液固定，然后按照如下步骤进行：①酒精梯度脱水：体积浓度75%乙醇水溶液、体积浓度85%乙醇水溶液、体积浓度95%乙醇水溶液、无水乙醇a、无水乙醇b，各45min。②透明：二甲苯a、二甲苯b，各30min。③浸蜡与包埋：将透明后的组织块放入60℃的液体石蜡中浸泡40min，然后用包埋机包埋，包埋时将组织断面朝下。④切片：厚度4μm，展片，捞片，烤片（60℃，8h）。⑤脱蜡：二甲苯a、二甲苯b，各5min。⑥水化：无水乙醇、体积浓度95%乙醇水溶液、体积浓度75%乙醇水溶液，各2min。⑦水洗：自来水浸泡5min，苏木素染色2min。⑧缓慢自来水洗2min。⑨分化：1%盐酸酒精，30s，⑩自来水洗5min。伊红染色5min。 脱水：体积浓度75%乙醇水溶液、体积浓度95%乙醇水溶液、无水乙醇a、无水乙醇b，各1min。
透明：二甲苯2min。 晾干后，树脂封片。

[0044] （6）免疫荧光共聚焦激光扫描显微镜检测技术具体步骤：①用药部位及其周围的皮肤组织蜡块在切片机上切为厚度为4μm的薄片，挂片烤干后，切片常规脱蜡、水化。②蒸馏水冲洗2min×3次，PBS（pH值为7.4）浸泡5min。③石蜡切片置于微波炉中95℃微波抗原热修复30min。蒸馏水冲洗2min×2次，PBS（pH值为7.4）冲洗2min×2次。擦去样品周围液体。④10%正常山羊血清封闭，室温孵育30min，倾去血清，勿洗。⑤滴加兔抗鼠CD8单克隆抗体（zsgb-bio公司），4℃过夜。PBS冲洗，5min×3次。⑥滴加FITC标记羊抗兔的二抗（zsgb-bio公司）。室温反应2h。PBS冲洗，5min×3次。90%甘油封片。尽量用薄的盖玻片。用FluoView FV1000型免疫荧光共聚焦激光扫描显微镜检测CD8+T细胞的荧光定量表达，采用单一绿色荧光通道观察，在488nm波长以上扫描观察。观察并由计算机自带扫+描分析软件测定，每张切片选取荧光表达最强的5个视野（200×）中单位面积CD8T细胞的荧光强度。

[0045] （7）血清细胞因子检测：眼眶采血，分离血清，ELISA法分别测定IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-13，按说明书严格操作。

[0046] （8）统计学分析方法

[0047] 数据测定结果以均数±标准差 表示，t检验进行统计学分析。P＜0.05为有显著性差异。

[0048] 三、实验结果

[0049] 1.小鼠毛发脱色情况

[0050] 1.1经莫诺苯宗乳膏外用和CPG皮下注射，在用药部位最先出现斑点状的脱色，随着用药时间延长，脱色逐渐扩大。随之在非用药部位（如面部，耳，尾及躯干的非用药部位）出现针尖样脱色，并融合扩大(见图1中a-b)。IV组小鼠在实验第4天用药部位出现少量红斑丘疹；实验第7天在用药部位出现斑点状脱色斑，且皮疹增加；实验第20天因用药部位炎症反应严重，渗出多，被迫终止用药。其余各组小鼠用药50天，停药继续观察15天，小鼠毛发脱色部位颜色和面积变化。

[0051] Ⅰ组小鼠予以水包油乳膏基质外用50天，未出现脱色斑(见图1中c)。

[0052] 1.2各组小鼠脱色的发生率和时间

[0053] II组、III组和IV组全部小鼠用药部位出现脱色，随着浓度的增加在非用药部位的脱色发生率也随之增加（见图1中d）。

[0054] II组、III组和IV组小鼠的用药部位最早出现脱色的时间分别为实验第18、10和7天出现脱色，且这三组小鼠的用药部位出现脱色的平均时间取整数为20、12和10天。II组、III组和IV组小鼠的非用药部位出现脱色的开始时间分别为实验第35，19和15天出现脱色，出现脱色的平均时间取整数为40、21和19天。

[0055] 1.3各组小鼠脱色面积和稳定性

[0056] II组、III组和IV组小鼠脱色面积评分用药部位非用药部位也随着浓度增加而增加（见图1中e）。

[0057] 且停药15天发现II组小鼠大部分脱色不稳定，该组小鼠均出现复色。III组小鼠大部分脱色稳定，未出现复色，其中有5只小鼠躯干的非用药部位脱色面积有扩大迹象。IV组小鼠在实验第20天皮疹严重，被迫停药，至实验第65天脱色区域未出现复色现象，皮疹完全消退。

[0058] 从上可知，IV组因其浓度过高，引起用药部位出现红斑丘疹，因此我们认为40%莫诺苯宗乳膏联合1mg/mlCPG是最佳的造模浓度。

[0059] 2.RCM观察皮肤脱色

[0060] 观察皮肤的黑色素及黑素细胞显示：Ⅰ组小鼠皮肤可见色素正常，色素分布均匀，折光强(见图2中a)；II、III和IV组小鼠非用药区的脱色部位皮肤RCM表现可见色素缺失，折光弱，三组见无明显差异(见图2中b-d)。

[0061] 3.组织病理

[0062] 3.1HE染色显示：Ⅰ组小鼠在真皮浅层有少量淋巴细胞浸润（见图3中a）；II、III和IV组小鼠在真皮浅层有较多淋巴细胞浸润（见图3中b-d）。

[0063] 3.2免疫荧光显示：Ⅰ组小鼠在真皮浅层有少量CD8+T细胞浸润（见图4中a）；II、+III和IV组小鼠在真皮浅层有较多CD8T细胞浸润（见图4中b-d）。

[0064] 以上结果表明，莫诺苯宗联合CPG处理诱导皮肤局部出现CD8+T细胞浸润，且CD8+T细胞浸润的程度与莫诺苯宗的处理浓度呈正相关。造模的三个组小鼠在皮肤局部出现淋巴+细胞尤其是CD8T细胞浸润，提示出现脱色是因细胞免疫反应的结果，这与人类白癜风特点一致。

[0065] 4.细胞因子

[0066] 实验结束取血，对照组血清中TNF-α的含量(13.657±2.739)，II组为(56.89±7.61)，III组为(130.75±8.56)，IV组为(189.83±9.71)，三个模型组较对照组有明显差异，P＜0.05。对照组血清中IFN-γ的含量(63.257±4.660)，II组为(158.32±10.63)，III组为(234.85±14.61)，IV组为(285.18±12.17)，三个模型组较对照组有明显差异，P＜0.05。对照组血清中IL-6的含量(73.54±6.93)，II组为(132.17±8.29)，III组为(341.82±10.53)，IV组为(401.27±9.87)，三个模型组较对照组有明显差异，P＜0.05。对照组血清中IL-13的含量(2.27±0.53)，II组为(19.52±3.16)，III组为(38.03±4.18)，IV组为(45.31±3.37)，三个模型组较对照组有明显差异，P＜0.05。（见图5）

[0067] 以上结果表明，莫诺苯宗联合CPG处理诱导皮肤后血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-13均有不同程度的升高，且与莫诺苯宗的处理浓度呈正相关。提示出现脱色是通过细胞免疫和细胞因子共同作用的结果，这与人类白癜风特点一致。

[0068] 实施例2：

[0069] 一、试剂及材料：

[0070] C57BL/6小鼠，雌性，体质量(15±2)g，购于上海斯莱克实验动物有限公司[生产许可证号SCXK（沪）2012-0002]。

[0071] 莫诺苯宗乳膏配方及制备同实施例1。

[0072] CPG：生工生物工程（上海）股份有限公司；

[0073] 兔抗鼠CD8单克隆抗体：ZSGB-BIO公司；

[0074] FITC标记羊抗兔二抗：ZSGB-BIO公司；

[0075] IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-13ELISA试剂盒：MULTISENCES公司；

[0076] 0.05%卤米松：香港澳美制药厂；

[0077] 皮肤共聚焦激光扫描显微镜（reflectance confocal microscopy，RCM），美国Lucid公司，VIVASCOPE1500型，波长830nm，最大输出16.0mw；

[0078] 免疫荧光共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy，CLSM）：日本OLYMPUS公司，Fluo View FV1000型。

[0079] 二、实验步骤

[0080] （1）水包油型莫诺苯宗乳膏按如下方法配制同实施例1；1mg/ml CPG溶液的配制同实施例1，水包油乳膏基质同实施例1。

[0081] （2）分组：C57BL/6小鼠30只，随机分为阴性对照组（Ⅰ组）、模型组（II组）、卤米松组（III组）3个组，每组10只，脱去小鼠背部黑色毛2cm×2cm，涂药。Ⅰ组每天涂抹水包油乳膏基质，II组每天涂抹40wt%莫诺苯宗乳膏，III组每天分别涂抹40wt%莫诺苯宗乳膏和0.05%卤米松。Ⅰ组和II组每天涂抹一次，水包油乳膏基质、莫诺苯宗乳膏每次涂抹量为每平方厘米的体表面积予以25mg，III组每天涂抹一次，40wt%莫诺苯宗乳膏和0.05%卤米松每次涂抹量均为每平方厘米的体表面积予以25mg，II组和III组在小鼠使用莫诺苯宗乳膏部位的皮下注射1mg/ml CPG溶液，隔三天一次，每次注射量为10μl/g体重。各组小鼠用药50天，完成模型的构建。停药后连续15天肉眼观察小鼠毛发颜色和脱色面积变化，通过RCM观察皮肤脱色。

[0082] （3）毛发脱色评估：每日肉眼观察毛发脱色，并进行积分记录。将脱色部位分为用药部位和非用药部位，每个部位总分为5分，每只小鼠共10分。小鼠毛发脱色评分标准为：0分毛发无脱色：1分毛发有脱色＞0-10%；2分毛发脱色面积＞10-25%；3分毛发脱色面积＞25-50%；4分毛发脱色面积＞50-75%：5分毛发脱色面积＞75-100%。

[0083] （4）皮肤脱色观察：激光共聚焦显微镜（RCM）使用的是一种波长为830nm的二极管激光，它的最大能力不超过35mW。物镜的放大倍数为30倍。实时观察建模前后小鼠正常区和脱色区皮肤处在同一层面进行观察皮肤内黑素细胞，并拍照。

[0084] （5）免疫荧光共聚焦激光扫描显微镜检测技术具体步骤同实施例1。

[0085] （6）统计学分析方法同实施例1。

[0086] 三、实验结果

[0087] 1.模型组小鼠脱色情况用药部位在实验第10天开始出现脱色毛发点状簇集，第13天全部小鼠的用药部位出现脱色，且脱色范围逐渐扩大，至第17天形成片状(见图6中a，红色圆圈)，用药50天，皮损扩大并部分融合；躯干的非用药部位在实验第19天开始出现毛发脱色(见图6中a，箭头)。至实验第50天，有7只小鼠在躯干部位有脱色，并7只尾巴部位出现粟粒大的脱色(见图6中b)，5只耳朵上呈现针尖样脱色；停药后连续观察15天，小鼠毛发脱色部位的颜色和面积变化。结果显示小鼠脱色稳定。

[0088] 2.阴性对照组小鼠脱色情况阴性对照组小鼠予以莫诺苯宗乳膏的基质外用50天后，未出现脱色(见图6中c)。

[0089] 3.卤米松对脱色的发生率、时间和面积评分的影响

[0090] II组、III组全部小鼠用药部位出现脱色，其非用药部位脱色的发生率分别为70%、30%。

[0091] III组小鼠的用药部位最早出现脱色的时间分别为实验第21天出现脱色，而II组在实验第10天开始出现脱色。且这组小鼠的用药部位出现脱色的平均时间取整数为23天，较模型组明显推迟。III组小鼠的非用药部位出现脱色的开始时间分别为实验第35天出现脱色，而II组在实验第19天开始出现脱色。且这组小鼠的非用药部位出现脱色的平均时间取整数为38天，较模型组明显推迟。

[0092] III组小鼠的用药部位脱色面积评分为2.03±0.63，模型组3.45±0.17，模型组、III组小鼠非用药部位的脱色面积评分分别为1.9±0.12和1.05±0.32，小鼠脱色面积评分可知卤米松治疗后脱色面积明显减小。

[0093] 从脱色的发生率、时间和面积评分可见，卤米松治疗后可降低小鼠白癜风的发生发展，延迟脱色的时间，脱色面积明显缩小。

[0094] 4.RCM观察皮肤脱色

[0095] 观察皮肤的黑色素及黑素细胞显示：Ⅰ组小鼠RCM显示色素正常，色素分布均匀，折光强(见图7中a)；II组小鼠RCM显示色素缺失，折光弱(见图7中b)。III组小鼠RCM显示树突状，折光明亮的黑素细胞(见图7中c)；

[0096] 以上结果可知，经过卤米松治疗后出现较多的树突状，折光明亮的黑素细胞，这一特点与临床治疗白癜风有效患者的皮损表现一致。

[0097] 5.皮肤组织的病理学改变

[0098] 免疫荧光显示：Ⅰ组在真皮浅层有CD8+T细胞有极少量浸润（见图8中a），II组+ +CD8T细胞浸润明显（见图8中b），III组CD8T细胞浸润较模型组略有减少（见图8中c）。

[0099] 从CD8+T细胞在真表皮浸润的情况可知，经卤米松治疗后CD8+T细胞浸润明显减少，这一特点符合临床白癜风治疗特点。