灰葡萄孢菌分泌型蛋白激发子BcGS1及其应用

摘要

本发明涉及一种能够提高植物抗性及防御性的灰葡萄孢菌分泌蛋白激发子及其基因序列和该蛋白及其基因的用途。该蛋白激发子BcGS1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。可以用于提高植物抗性和诱导植物防御反应。所述植物优选为烟草或番茄。该蛋白激发子可以明显的提高植物的抗性，浓度低，起效快，作用时间长。BcGS1为提高植物的抗病性提供了新的途径，因而在农业生产上具有广阔的应用前景。

权利要求

1.灰葡萄孢菌分泌型蛋白激发子BcGS1在提高植物对烟草TMV和灰葡萄孢菌的抗性中的应用，其中，所述灰葡萄孢菌分泌型蛋白激发子BcGS1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为烟草、番茄或黄瓜。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：当用于诱导减少烟草花叶病毒对烟草的危害时，所述BcGS1的诱导浓度为20μg/mL；当用于提高番茄、黄瓜对灰葡萄孢菌的抗性时，所述BcGS1的诱导浓度为10μg/mL。

说明书

灰葡萄孢菌分泌型蛋白激发子BcGS1及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种能提高植物抗性和诱导植物防御反应的来自于灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea)分泌型蛋白激发子的氨基酸序列及编码该蛋白质的核苷酸序列极其应用。

背景技术

[0002] 灰霉病是由灰葡萄孢引发的一种真菌病害，可危害果树、蔬菜、花卉等200多种植物，尤其在大棚种植的蔬菜上引起果实腐烂，损失比较严重。灰葡萄孢菌在分类地位上隶属半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、葡萄孢属真菌。目前对植物病害的防治主要采取化学防治和选育抗病品种。但是它们往往存在着无法摒除的弊端。上世纪随着生物技术的发展，植物诱导抗性受到关注，激发子作为诱导植物抗性的主要因子，愈发受到关注。因此从该病原菌中寻找出具有新活性，新功能的有效物质已成为国内外科学家关注的热点。

[0003] 灰葡萄孢菌产生的激发子是一种重要的效应分子。它通过识别并作用植物细胞表面或亚细胞组分的受体分子来传递病原菌的激发子信号，启动植物的防卫系统，诱导植物的局部组织产生过敏性细胞坏死，并通过局部细胞信号物质的系统传递使植物最终产生系统获得抗性。

[0004] 目前国内外已从灰葡萄孢菌中分离出许多能够引起植物抗病反应的活性成分。如2001年V.Repka,等从灰葡萄孢菌中分离了一种激发子，该激发子是一种粗制的细胞壁制剂，主要成分是蛋白质和糖，它可以引起植物的氧化爆发和病程相关蛋白的积累，提高苯丙烷途径相关酶的活性（V.Repka.等，Vitis，2001,40（4）：205-212）；2011年Mohamed El Oirdi等从灰葡萄孢菌中分离了一种胞外多糖，通过SA信号转导途径可以有效地诱导番茄对灰霉病的抗性（Mohamed El Oirdi.等,The Plant Cell,2011,23:2405–2421）。

[0005] 申请人也从灰葡萄孢菌中先后分离了两种蛋白激发子PebC1和PebC2，它们的分子量分别为36kD和14kD。其中PebC1能显著促进小麦幼苗生长、提高小麦抗旱性、诱导番茄对灰霉病的系统抗性。PebC1基因全长639bp，编码212个氨基酸，PebC1处理后的番茄体内苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）活性显著增强（ZhangYunhua等，Microbiological Research，2010，(165)，142-151）。

[0006] 所有已公开发表的文献表明，灰葡萄孢菌确实可以产生引起植物的防御反应，提高植物抗性的激发子，其性质和种类各不相同，但蛋白质序列和基因序列报道较少，所以寻找新的蛋白激发子，对揭示灰葡萄孢菌与植物互作机理以及激发子提高植物免疫抗性是非常重要的。

发明内容

[0007] 本发明所解决的技术问题是提供一种能够提高植物抗性及防御性的灰葡萄孢菌分泌蛋白激发子及其基因序列和该蛋白及其基因的用途。

[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

[0009] 一种灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）分泌型蛋白激发子BcGS1，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。

[0010] 本发明的蛋白激发子BcGS1可以用于提高植物抗性和诱导植物防御反应。所述植物为双子叶植物，优选为烟草、番茄、黄瓜。当用于诱导减少烟草花叶病毒对烟草的危害时，所述BcGS1的诱导浓度为20μg/mL；当用于诱导番茄或黄瓜提高对灰葡萄孢菌的抗性时，所述BcGS1的诱导浓度为10μg/mL。

[0011] 一种BcGS1基因，核苷酸序列为下列所述之一：

[0012] （1）编码如SEQ ID NO:2所示蛋白质的多核苷酸序列；

[0013] （2）与上述多核苷酸序列根据碱基互补配对原则互补的多核苷酸序列。

[0014] 所述的BcGS1基因，其多核苷酸序列优选如SEQ ID NO:1所示。也可以是编码如SEQ IDNO:2所示蛋白质的氨基酸的密码子的其他组合形式。所述BcGS1基因可用于转化表达，表达载体优选pMD18-T simple，重组载体可用大肠杆菌Rossetta（DE3）表达。得到分子量约83KD的融合表达蛋白（His-BcGS1），可以诱导烟草、番茄等同类植物产生抗性反应，提高抗性能力。减少烟草花叶病毒对烟草的危害，减轻灰葡萄孢菌对番茄的危害。

[0015] 本发明所述的蛋白激发子，可以是来自灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的培养液、培养液的上清液或菌体的蛋白质。也可以是通过基因工程手段表达转化的重组蛋白。具有相同的效果。

[0016] 本发明的优点为，该蛋白激发子可以明显的提高植物的抗性，浓度低，起效快，作用时间长。BcGS1为提高植物的抗病性提供了新的途径，因而在农业生产上具有广阔的应用前景。

[0017] 微生物保藏信息

[0018] 编号CGMCC No.7057，命名Botrytis cinerea，2013年1月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，电话[phone]。

附图说明

[0019] 图1为蛋白激发子BcGS1肽段的氨基酸序列。

具体实施方式

[0020] 为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明：

[0021] 实施例1灰葡萄孢菌的培养及发酵液制备

[0022] 将灰葡萄孢菌（编号CGMCC No.7057，命名Botrytis cinerea，2013年1月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会），接种于PDA【取去皮马铃薯200克，切成块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升，加葡萄糖20克，琼脂15克，溶化后分装，121℃灭菌30分钟】平板，25℃培养1周，挑取菌落边缘处接种于200mL盛有察式【磷酸二氢钾0.6g，硝酸钾0.7g，七水硫酸镁0.25g，三水磷酸氢二钾0.125g，硝酸钙0.3g，硼酸1mg，一水硫酸锰1.5mg，七水硫酸锌4mg，二水钼酸钠0.1mg，碘化钾
20μg，五水硫酸铜20μg，六水氯化钴20μg，FeNa2EDTA8mg，烟酸1mg,吡哆醇1mg,泛酸钙（calciumpanthotenate）1mg，盐酸硫胺素1mg，天冬酰胺1g，葡萄糖20g,加去离子水至1L】液体培养基的500mL三角瓶中，25℃、180r/min培养6天，得到灰葡萄孢菌的发酵液。

[0023] 实施例2粗蛋白激发子的制备和检测

[0024] 取实施例1中所得的发酵液，在4℃、5000rpm条件下离心1h（或13000rpm，30min），收集上清液，用0.45mm的滤膜（Whatman）抽滤两次，直至没有菌体。加入硫酸铵粉末,使所述上清液中硫酸铵终浓度为80%来沉淀目标蛋白质，4℃透析48h，最后将获得的胞外总TM蛋白质溶解到超纯水中，蛋白质终浓度为100μg/mL。蛋白质含量用BCA protein assay kit（Thermo Scientific）经GF-M2000型酶标仪（山东高密彩虹分析仪器有限公司）在波长590nm处测定。

[0025] 生物活性的监测：以生长2个月，具有5-7片真叶的烟草为材料，以清水为对照。粗蛋白溶液浓度稀释到50μg/mL，利用1mL不带针头的注射器，将50uL溶液从叶子背面分别注射进叶片中去。经过24h观察是否有坏死斑形成。

[0026] 结果：注射粗蛋白激发子的叶片，注射部位4h后出现水渍斑，6h后注射处叶片呈透明状，12h后可见典型的过敏反应，有坏死斑形成。对照并无任何反应，和正常叶片一样。

[0027] 实施例3蛋白激发子的分离纯化及生物活性测定

[0028] 使用AKTA explore 10（GE Healthcare）蛋白质纯化仪对所得的总蛋白质进行进一步纯化。实施例2中所述粗蛋白经冷冻干燥后，溶于20mM HEPES（PH7.0）缓冲液。样品通过HiTrapTMDEAE FF阴离子交换柱（GE Healthcare），用NaCl进行梯度洗脱（5%，20%，30%，50%，100)，应用的蛋白浓度为50μg/mL，结果表明，穿透峰中的蛋白质可以强烈的引起烟草的过敏反应，经12％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为单一条带，说明蛋白质纯度高。该蛋白质表观分子量为80kD（pI＝4.72），将此蛋白激发子命名为BcGS1（Protein Elicitor of Botrytiscinerea）。用实例2同样方法测试对不同浓度BcGS1（1μg/mL，5μg/mL,10μg/mL,20μg/mL,50μg/mL）进行检测，20μg/mL能够引起典型过敏性反应，最低能引起过敏反应的蛋白浓度为10μg/mL。

[0029] 结果：分离纯化的BcGS1可以使烟草形成过敏反应的坏死斑。

[0030] H2O2沉积

[0031] 叶片处理方法如实例2，BcGS1浓度为20μg/mL，时间为24h。取处理的叶片用蒸馏水洗净后将其置于2mL管中,取适量DAB（3,3’-Diaminbenzidine）（Sigma）染液(1mg.mL-1,pH3.8),用NaOH调pH值至5.8,分别加入预处理的植物组织,室温避光保存8小时。随后去除各管中染液,加入95%乙醇,沸水浴数分钟,去除各管液体,再加入无水乙醇并沸水浴直至叶片绿色完全脱去为止,再次吸出各管液体,将去浸泡在70%甘油中，赶出细胞间气泡显微镜观察。

[0032] 结果：在BcGS1处理的叶片部位有明显的褐色沉积物质出现，并且处理部位的气孔上的保卫细胞也出现红褐色沉淀。

[0033] 实施例4蛋白激发子BcGS1肽段序列的获得

[0034] 纯化的BcGS1蛋白质经双向电泳检测，切取蛋白质单点分别经10ng/μl测序级修饰胰蛋白质酶（Sequencing Grade Modified Trypsin，Promega）30℃、pH7.5酶解30min～1h，ESI-MS/MS为英国Micromass公司的Q-TOF2正交加速电喷雾串联质谱仪。配备纳升喷雾源。所有测定均在正离子方式下进行。质谱仪用Glu-fib的串联质谱碎片校正，质量准确度小于0.1Da。雾化气为氮气，碰撞气体为氩气。源温80℃，锥孔电压50V。TOF加速电压9.1kV。MCP检测器电压为2150V。毛细管电压800V。获得该蛋白质的多个肽段序列，这些序列和NCBI中gi154316440所编码的氨基酸序列相匹配（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/gi%7C154316440）。如图1所示，图1中用下划线表示的为一致的肽段序列。

[0035] 实施例5蛋白质激发子BcGS1编码基因的克隆

[0036] 根据质谱测序结果和密码子的简并性设计4对引物，经筛选验证最终选定引物：

[0037] BcGS1-正向5’-ATGGCTTCTTCTCTGCTTTCCTC-3（如SEQ ID NO:3所示）和BcGS1-反向5’-TTACCAGCTACCACTAACAGTAGCAGT-3（如SEQ ID NO:4所示），并以灰葡萄孢菌株抽提的mRNA为模板，选用HiFi反转录聚合酶进行PT-PCR（94°C3min；94°C30s，55°C30s，72°C2min，35cycles；72°C10min；4°C∝）,扩增出2019bp的DNA片段，其中包括2019bp的完整开放阅读框，将其命名为BcGS1基因，该基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

[0038] 实施例6BcGS1基因的原核表达和纯化

[0039] （1）表达载体的构建

[0040] 设计蛋白激发子基因BcGS1的特异性引物，引入带有酶切保护碱基的酶切位点，正向引物：5’-GAATTCATGGCTTCTTCTCTGCTTTCCTC-3’,（下划线为EcoR I的酶切序列）,反向引物：5’-GCGGCCGCTTACCAGCTACCACTAACAGTAGCAGT-3’,（下划线为NotI的酶切序列），扩增全长BcGS1基因（94°C3min；94°C30s，55°C30s，72°C2min，35cycles；72°C10min；4°C∝)。先将BcGS1基因目的片段克隆到pMD18-T simple载体，经EcoR I和Not I酶切后，将BcGS1片段克隆到pET-28a(+)载体(Novagen)的Eco RI/Not I位点，热激转化到大肠杆菌Trans10(Transgene),挑取阳性克隆，摇菌并提取质粒，酶切并测序验证。

[0041] （2）诱导表达

[0042] 将步骤（1）中所获得表达载体用热激发转化到大肠杆菌Rossetta(DE3)中。质粒提取及转化表达宿主菌株的方法同（1），验证正确后，进行表达。将验证正确的重组表达菌株过夜活化，同时取pET28a空质粒的菌株作为对照。分别取1mL过夜培养液加入到含有100μg/mLKan的100mL LB液体培养基中（1%接种量），37℃，200r/min振荡培养2～3h培养至OD600为0.6～0.8。加入诱导剂IPTG（终浓度为0.1mmol/L），22.5℃，220r/min继续振荡培养24h，诱导表达目的蛋白。高速离心，收集菌体加入缓冲液。经超声破碎菌体后，
4℃高速离心，收集上清。取20μL上清液，加入5μL5×SDS上样缓冲液（变性）重悬菌体，沸水浴中加热10min，13000r/min离心10min，取上清进行SDS-PAGE检测，考马斯亮兰R250染色，观察表达情况。

[0043] 结果：经过SDS-PAGE检测，获得一个分子量约83KD的融合表达蛋白（His-BcGS1），与预测分子量大小一致。

[0044] （3）重组蛋白的纯化

[0045] 利用 explorer10蛋白纯化仪进行重组蛋白的纯化。选用Hitrapchelating Column柱进行亲和层析，先用清洗缓冲液平衡亲和柱；取步骤（2）离心后的重组蛋白液5mL进样，流速为1mL/min，淋洗至基线后，洗脱缓冲液进行洗脱；收集的各洗脱峰，在大量体积的Tris-HCL缓冲液(PH7.4)中4℃透析过夜，随后进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮兰染色检测蛋白的纯度。

[0046] 生物活性测定：采用实施例2中方法测定重组蛋白激发子对烟草的活性。

[0047] 结果：获得纯化的约83KD的融合表达蛋白（His-BcGS1重组蛋白）[0048] 实施例7重组蛋白(His-BcGS1)在烟草上引起的防御反应

[0049] （1）重组蛋白(His-BcGS1)在烟草上引起的HR反应

[0050] 用1mL不带针头的注射器，将约50uL,50μg/mL融合表达蛋白(His-BcGS1)，从叶子背面注入不同的烟草叶片中。以相同浓度的pET-28a(+)空质粒表达蛋白（缓冲液为20MmTris-HCL,pH7.4）作为对照，24h后观察叶片上的反应。

[0051] 如实例3中的方法，观察重组蛋白诱导H2O2在处理叶片上的积累。

[0052] 结果：重组蛋白(His-BcGS1)能够引起烟草叶片产生HR反应；His-BcGS1使处理叶片产生H2O2积累，形成红褐色沉淀，与天然纯化的BcGS1引起的症状基本一致。

[0053] （2）重组蛋白(His-BcGS1)提高抗性相关基因转录水平

[0054] 采用半定量RT-PCR方法，对烟草抗性相关基因转录水平进行分析。取所需的样品液氮研磨成粉，按50-100mg/mL加入Trizol，室温5min静置，12000rpm离心5min，弃沉淀；按200uL氯仿/mL Trizol,震荡混匀15min放置，4℃，12000rpm离心15min，吸取上层，加入0.5mL异丙醇/mL Trizol，混匀，-20℃静置20min；离心，75%乙醇漂洗，离心去除乙醇，
5-10min晾干。加入DEPC处理水，测RNA浓度，调成相同浓度。

[0055] 第一链cDNA的合成，采用TransGen公司的TransScript Two-Step RT-PCR Kit。取500ng总RNA,按照试剂盒说明书，用TransScript RT/RI Enzyme Mix,以Anchored Oligo（dT）18为引物,42℃孵育30min，85℃加热5min使酶失活。取1uL反转录产物做PCR,β-actin为内标基因，以抗性相关基因特异引物做PCR(PR1-a基因F:5′-TGGATGCCCATAACACAGC-3′R:5′-AATCGCCACTTCCCTCAG-3′；PR1-b基因F:5′-GATGTGGGTTGATGAGAAGC-3′R:5′-CTCCAATTACCAGGTGGATC-3′；NPR1基因F:5′-ACATCAGCGGAAGCAGTAG-3′R:5′-GTCGGCGAAGTAGTCAAAC-3′，分别如SEQ ID NO:5-10所示）观察抗性相关基因的表达情况。

[0056] 结果：经过半定量RT-PCR结果可见His-BcGS1在处理烟草叶片后24小时，可以诱导抗性相关基因的转录表达。

[0057] 实例8重组蛋白(His-BcGS1)增强双子叶植物抗病性

[0058] （1）诱导减少TMV对烟草的危害

[0059] 通过预实验可知20μg/mL融合表达蛋白对烟草抗TMV有较佳效果。将50μL、纯化后的His-BcGS1(20μg/mL)溶液通过无针头的注射器，从背面注入烟草叶片中。以Tris-HCL缓冲液作对照，每处理10株，重复3次。TMV的接种方法为：取新鲜TMV病叶加0.01mol/L磷酸缓冲液（pH=7.4）研磨成匀浆，病汁液浓度为每克病叶加15mL磷酸缓冲液。
确定最佳接种时间。

[0060] 分别于重组蛋白处理后1、3、5和7d，在处理叶的上一位叶摩擦接种TMV。于接种后3天，调查枯斑数量，计算枯斑抑制率。

[0061] 抑制率(%)=[(坏死斑个数/直径-处理组坏死斑个数/直径)/坏死斑个数/直径]×100

[0062] 结果如下表。

[0063]

[0064] 表中不同字母表示在ρ＜0.01水平时的差异显著性。

[0065] 上述结果表明，重组蛋白激发子His-BcGS1可以诱导减少TMV对烟草的危害，在蛋白诱导3d后，其诱导效果更佳，对TMV的抑制率可以达到58.55%。

[0066] （2）诱导拟南芥对灰葡萄孢菌的抗性

[0067] 用纯化后的His-BcGS1溶液（浓度分别为1μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL）喷雾处理6-8叶龄的拟南芥幼苗，以Tris-HCL缓冲液作对照，每处理10株，重复3次。诱5
导3d后喷雾接种灰葡萄孢菌孢子悬浮液（10个/mL），保湿24h，第7d进行病级调查，计算诱抗效果。

[0068]

[0069]

[0070]蛋白浓度（μg/mL） 病情指数（%） 诱导效果(%)
0 49.59±0.52A
1 32.36±0.85B 34.74
5 30.82±1.58B 37.85
10 23.08±0.96C 53.45
20 29.45±1.12B 40.61

[0071] 表中不同字母表示在ρ＜0.01水平时的差异显著性。

[0072] 上述结果表明，重组蛋白激发子His-BcGS1可以减轻灰葡萄孢菌对拟南芥的危害，在蛋白诱导3d后，10μg/mL蛋白诱导效果最好，诱抗效果可以达到53.45%。拟南芥（Arabidopsisthaliana），又名鼠耳芥、阿拉伯芥、阿拉伯草。这种小小的有花植物，是在植物科学，包括遗传学和植物发育研究中的模式生物之一。本实验说明重组蛋白激发子His-BcGS1可以减轻灰葡萄孢菌对拟南芥的危害，则基本可说明重组蛋白激发子His-BcGS1对大多数植物的抗性提高均有一定的作用。继续实验如下。

[0073] （3）诱导番茄提高对灰葡萄孢菌的抗性

[0074] 用纯化后的His-BcGS1溶液（浓度分别为1μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL）喷雾处理6-8叶龄的番茄幼苗，以Tris-HCL缓冲液作对照，每处理10株，重复3次。诱导5
3d后喷雾接种灰葡萄孢菌孢子悬浮液（10个/mL），保湿48h，第14d进行病级调查，计算诱抗效果。

[0075]

[0076]

[0077]蛋白浓度（μg/mL） 病情指数（%） 诱导效果(%)
0 45.34±0.98A

[0078]1 36.85±0.79B 18.73
5 27.25±1.84C 39.90
10 16.65±1.37D 63.28
20 19.18±1.24D 57.70

[0079] 表中不同字母表示在ρ＜0.01水平时的差异显著性。

[0080] 上述结果表明，重组蛋白激发子His-BcGS1可以减轻灰葡萄孢菌对番茄的危害，在蛋白诱导3d后，10μg/mL蛋白诱导效果最好，诱抗效果可以达到63.28%。

[0081] （4）诱导黄瓜对灰葡萄孢菌的抗性

[0082] 用纯化后的His-BcGS1溶液（浓度分别为1μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL）喷雾处理6-8叶龄的黄瓜幼苗，以Tris-HCL缓冲液作对照，每处理10株，重复3次。诱导5
3d后喷雾接种灰葡萄孢菌孢子悬浮液（10个/mL），保湿48h，第14d进行病级调查，计算诱抗效果。

[0083]

[0084]

[0085]蛋白浓度（μg/mL） 病情指数（%） 诱导效果(%)
0 54.45±1.32A
1 45.64±0.97B 16.17
5 35.74±1.64C 34.36
10 22.53±1.38D 58.62
20 25.13±1.29D 53.84

[0086] 表中不同字母表示在ρ＜0.01水平时的差异显著性。

[0087] 上述结果表明，重组蛋白激发子His-BcGS1可以减轻灰葡萄孢菌对黄瓜的危害，在蛋白诱导3d后，10μg/mL蛋白诱导效果最好，诱抗效果可以达到58.62%。

[0088] 从上述实验可以看出，重组蛋白激发子His-BcGS1对烟草、黄瓜、番茄以及拟南芥的抗性提高以及诱导防御反应均有一定作用，证明蛋白激发子BcGS1对双子叶植物很有效果。

[0089] 以上所述的实例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。