一株硝酸盐还原菌及其应用

摘要

一株硝酸盐还原菌及其应用，本发明涉及一株硝酸盐还原菌及其应用。本发明的目的是要解决采油过程中聚合物注入粘度损失大，粘度保留率较低的问题。本发明的一株硝酸盐还原菌为Alccligenes sp.JNS05，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉市武汉大学，保藏日期是2013年11月14日，保藏号为CCTCCNo.M2013573。本发明的应用是指在抑制采油聚合物粘度损失上的应用。本发明Alccligenes sp.JNS05与聚合物工作液的配伍效果良好，每个试验组的粘度值均比相应对照组的粘度高，平均高出约5％。本发明应用于油田开发领域。

权利要求

1.一株硝酸盐还原菌，其特征在于它为Alccligenes sp.JNS05，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉市武汉大学，保藏日期是2013年11月14日，保藏编号为CCTCC No.M2013573。

2.如权利要求1所述的一株硝酸盐还原菌的应用，其特征在于Alccligenes sp.JNS05在抑制采油聚合物粘度损失上的应用。

说明书

一株硝酸盐还原菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株硝酸盐还原菌及其应用。

背景技术

[0002] 目前，聚合物是油田三次采油的主要驱采介质，大庆油田2011年聚驱产油量突破1300万吨，超过油田总产量的三分之一。所以，保证聚驱的开采效果对油田的高产稳产具有显著的意义。随着聚合物驱油技术的攻关研究不断深入和聚合物驱矿场应用规模的不断扩大，现场逐渐暴露出聚合物注入过程中粘度损失大，粘度保留率较低等问题。这些问题造成聚合物注入地层后的粘度与设计要求有一定的差距，降低驱采效率，这给油田带来经济损失，并影响油田的开发效果。2012年，大庆油田组织了粘损普查，统计结果表明，整个注聚系统中的粘损可分四部分，分别是：配置站粘损、母液管线粘损、注入站粘损和单井管线粘损，其中又以注入站粘损和管线粘损为主要部分，两者合计约占总粘损的77％。

[0003] 为满足油田对开发抑制聚驱粘损新技术的需求，急需开发能够有效抑制有害细菌并降低注聚粘度损失的制剂。

发明内容

[0004] 本发明的目的是要解决采油过程中聚合物注入粘度损失大，粘度保留率较低的问题，提供了一株硝酸盐还原菌及其应用。

[0005] 本发明的一株硝酸盐还原菌为Alccligenes sp.JNS05，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉市武汉大学，保藏日期是2013年11月14日，保藏编号为CCTCC No.M2013573。

[0006] 本发明的一株硝酸盐还原菌的应用是指在抑制采油聚合物粘度损失上的应用。

[0007] 本发明以大庆油田采油三厂配注污水为环境样品富集培养Alccligenes sp.JNS05，菌落为淡黄色不透明、边缘光滑。Alccligenes sp.JNS05的总DNA提取采用标准方法。PCR扩增16S rRNA基因，采取16S rRNA基因的通用引物F27:5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'和R1492:5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR扩增产物经纯化后直接进行双向测序。16S rRNA基因序列提交NCBI(National Center for Biotechnology Information)上的BLAST程序分析，鉴定为Alccligenes sp.，并命名为Alccligenes sp.JNS05。

[0008] 本发明Alccligenes sp.JNS05与聚合物工作液的配伍效果良好，每个试验组的粘度值均比相应对照组的粘度高，平均高出约5％，而且随着聚合物工作液浓度的增加，Alccligenes sp.JNS05作用效果更加明显。注入Alccligenes sp.JNS05菌液后可降低聚合物在配注系统中的粘度损失，提高注入井井口粘度值。

[0009] 本发明具有以下优点：

[0010] (1)本发明能够与有害细菌共同存在于微生物膜中，可以直接与有害细菌接触，从而提高作用效能；

[0011] (2)本发明有效成分能够充分适应管道内的厌氧环境，不会随着管线的延长而逐渐消耗，从而能够在整个管道线程内发挥效能；

[0012] (3)本发明的Alccligenes sp.JNS05为本源性环境物质，使用过程中不会造成二次环境污染。

附图说明

[0013] 图1为基于本发明Alccligenes sp.JNS05的16S rDNA基因构建的系统发育树；

[0014] 图2为试验1中Alccligenes sp.JNS05抑制SRB试验结果，其中1为空白对照样品，2为试验样品；

[0015] 图3为试验2中聚驱微生物粘损抑制剂与聚合物工作液的配伍试验结果；

[0016] 图4为试验3中对各注入井井口硫离子含量变化监测数据图；其中“●”为注入Alccligenes sp.JNS05前监测数据，“○”为注入Alccligenes sp.JNS05后监测数据；

[0017] 图5为试验3中对各注入井井口总铁离子含量变化监测数据图；其中“●”为注入Alccligenes sp.JNS05前监测数据，“○”为注入Alccligenes sp.JNS05后监测数据；

[0018] 图6为试验3中对北1-310-P23注入井井口聚合物物性检测统计图；其中“-▲-”为粘度值，“-■-”为浓度值；

[0019] 图7为试验3中对北1-311-P26注入井井口聚合物物性检测统计图；其中“-▲-”为粘度值；，“-■-”为浓度值；

[0020] 图8为试验3中对北1-312-P27注入井井口聚合物物性检测统计图；其中“-▲-”为粘度值，“-■-”为浓度值；

[0021] 图9为试验3中对北2-353-P25注入井井口聚合物物性检测统计图；其中“-▲-”为粘度值，“-■-”为浓度值；

[0022] 图10为试验3中对北2-360-SP22注入井井口聚合物物性检测统计图；其中“-▲-”为粘度值，“-■-”为浓度值；

[0023] 图11为试验3中对北2-361-P21注入井井口聚合物物性检测统计图；其中“-▲-”为粘度值，“-■-”为浓度值；

[0024] 图12为试验3中对北2-361-P29注入井井口聚合物物性检测统计图；其中“-▲-”为粘度值，“-■-”为浓度值；

[0025] 图13为试验3中对北2-362-P22注入井井口聚合物物性检测统计图；其中“-▲-”为粘度值，“-■-”为浓度值。

具体实施方式

[0026] 具体实施方式一：本实施方式的一株硝酸盐还原菌为Alccligenes sp.JNS05，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉市武汉大学，保藏日期是2013年11月14日，保藏号为CCTCC No.M2013573。

[0027] 本实施方式以大庆油田采油三厂配注污水为环境样品富集培养Alccligenes sp.JNS05，菌落为淡黄色不透明、边缘光滑。Alccligenes sp.JNS05的总DNA提取采用标准方法。PCR扩增16S rRNA基因，采取16S rRNA基因的通用引物F27：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'和引物R1492:5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR扩增产物经纯化后直接进行双向测序。16S rRNA基因序列提交NCBI(National Center for Biotechnology Information)上的BLAST程序分析，鉴定为Alccligenes sp.，并分类命名为Alccligenes sp.JNS05。

[0028] 本实施方式Alccligenes sp.JNS05与聚合物工作液的配伍效果良好，每个试验组的粘度值均比相应对照组的粘度高，平均高出约5％，而且随着聚合物工作液浓度的增加，Alccligenes sp.JNS05作用效果更加明显。注入Alccligenes sp.JNS05菌液后可大幅降低聚合物在配注系统中的粘度损失，提高注入井井口粘度值。

[0029] 具体实施方式二：本实施方式的一株硝酸盐还原菌的应用是指Alccligenes sp.JNS05在抑制采油聚合物粘度损失上的应用。

[0030] 本实施方式Alccligenes sp.JNS05的用法为：向用于驱油的聚合物溶液中加入聚合物溶液体积的0.025％的Alccligenes sp.JNS05培养液，每24h投加一次。

[0031] 本实施方式中的Alccligenes sp.JNS05培养液是指Alccligenes sp.JNS05在培养基中培养至OD620＝1.8得到的培养液。

[0032] 本实施方式具有以下优点：

[0033] (1)本实施方式能够与有害细菌共同存在于微生物膜中，可以直接与有害细菌接触，从而提高作用效能；

[0034] (2)本实施方式有效成分能够充分适应管道内的厌氧环境，不会随着管线的延长而逐渐消耗，从而能够在整个管道线程内发挥效能；

[0035] (3)本实施方式的Alccligenes sp.JNS05为本源性环境物质，使用过程中不会造成二次环境污染。

[0036] 具体实施方式三：本实施方式Alccligenes sp.JNS05的筛选方法为：以大庆油田采油三厂配注污水为环境样品富集培养硝酸盐还原菌，首先采集50ml采油三厂的配注污水样品，加入选择培养基30℃培养，静置培养72h后，将富集培养液转移至固体选择培养基上进行平板分离筛选。将单菌落再转移至液体选择性培养基中，采用格里斯试剂和二苯胺试剂对所获取的菌株进行硝酸盐还原性能检测以筛选阳性克隆。经过三轮筛选后，获得阳性硝酸盐还原菌单菌株JNS05。

[0037] 本实施方式的选择培养基的配方为：NaCl 7.0g/L；MgSO4·H2O 0.68g/L；CaCl2·H2O 0.24g/L；NH4Cl 0.02g/L；KH2PO4,0.027；NaC2H3O2·3H2O 0.68g/L；NaNO31.0g/L；NaHCO31.9g/L。

[0038] 对筛选得到的Alccligenes sp.JNS05进行分子鉴定，按以下步骤进行：

[0039] 一、采用CTAB(Cetyltrimethylammonium bromide)方法提取JNS05菌株的总DNA；

[0040] 二、序列扩增和测定

[0041] 用于PCR扩增的引物序列：

[0042] F27:5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'

[0043] R1492:5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'

[0044] 扩增体系为：ddH2O 14μl，10×buffer 2μl，F27引物.5μl，R1492引物0.5μl，JNS05基因组DNA 0.5μl，浓度为0.25mM的dNTP 2μl，Taq酶0.5μl。

[0045] PCR扩增程序：95℃，5min；95℃0.5min，56℃0.5min，72℃1.5min，循环30次；72℃延伸10min。

[0046] PCR产物经纯化后由宝生物工程(大连)有限公司进行测序，经测序，待鉴定的样品16S rDNA片段大小为1492bp(如序列表Seq ID No：3所示)。将此序列与NCBI数据库中的数据进行序列同源性比对，发现该菌株与Alcaligenes faecalis的亲缘关系最近。

[0047] 三、发育树构建

[0048] 利用Blast功能，将所得到的样品16S rDNA序列与GenBank数据库进行比较。下载GenBank上相似菌类的序列，利用Clustal X对基因序列进行比对，辅以SEAVIEW手工校正，采用MEGA5构建形态发育树(如图1所示)，分析样品的系统发育位置，菌种与Alcaligenes faecalis亲缘关系密切，位于同一进化分支上。

[0049] 对本实施方式的Alccligenes sp.JNS05抑制采油聚合物粘度损失的功能性验证：

[0050] 试验1、实验室检测Alccligenes sp.JNS05的抑制粘损的能力

[0051] 应用试验地点为大庆油田采油三厂某聚驱注入站，所注聚合物母液为中分聚合3 3
物，母液浓度为5000mg/L。母液注入量为265m/d，配注污水注入量为1005m/d。

[0052] 向驱油的注入液中加入占驱油的注入液体积0.025％的Alccligenes sp.JNS05培养液。

[0053] 将两份相同的配注污水分别注入到两个厌氧培养瓶中，其中一个加入0.025％倍体积的Alccligenes sp.JNS05培养液，另一份作为空白对照。两份样品均置于30℃条件下培养5天。采用绝迹稀释法检测两份样品中的硫酸盐还原菌数量，结果表明没加Alccligenes sp.JNS05培养液的样品变黑，说明硫酸盐还原菌大量繁殖。

[0054] 试验中使用该注入站内的配聚污水，将浓度为5000mg/L左右的中分聚合物母液稀释为大庆油田常采用的1000mg、1200mg/L以及1500mg/L三个浓度。将样品分为两组，一组加入0.025％体积的Alccligenes sp.JNS05培养液，另一组作为空白对照组，不同时段同时检测两组样品的粘度值，结果如图2所示，由图2可知空白对照样品中出现大量黑色悬浮物，而加入Alccligenes sp.JNS05培养液的试验样品中黑色物质较少。同时0.025％倍体积的加入量可排除菌株培养基的作用。这表明Alccligenes sp.JNS05培养液对污水中的SRB的代谢具有显著的抑制效果，实现了SRB的无害化。

[0055] 试验2、降低聚合物粘度损失室内矿场试验

[0056] 在矿场试验开展前，对所选取的检测对象井及注入泵进行取样调查，检测聚合物溶液的浓度值及粘度值，以了解所选站址的实际生产状态。试验采用聚合物母液泵后注入方式，Alccligenes sp.JNS05培养液通过计量注入泵注入到聚合物母液管线中，与聚合物母液相混合后与配注污水经静混器混合后一同输送至注入井井口。试验期间Alccligenes sp.JNS05培养液的注入量为120L/d。

[0057] 注入液中聚合物溶度检测方法采用Q/SY DQ20928-2003标准推荐的次氯酸钠法，具体步骤方法见Q/SY DQ20928-2003文件。

[0058] 注入液粘度测量采用美国BROOFIELD公司的LCDVC型数显粘度仪测量。

[0059] 硫酸盐还原菌检测，采用Q/SY DQ0605-2006推荐的绝迹稀释法。

[0060] 硫化物检测，将已放置过的水样在0.45μm微孔滤膜上抽滤,用去离子水将试管洗净，洗涤的水也经滤膜抽滤,最后用去离子水冲洗沉淀三次，将沉淀连同滤膜一起转入25.0mL刻度试管中,加入0.1mol/L，NaOH 0.5mL，30％H2O20.5mL用去离子水加置刻度，放置
4h抽滤，将滤液注入ZIC-III型离子色谱仪。同时作空白，根据峰高定量。

[0061] 总铁离子检测使用邻菲罗啉分光光度法。

[0062] 试验结果如图3所示。从图中可以看出，Alccligenes sp.JNS05与聚合物工作液的配伍效果良好，每个试验组的粘度值均比相应对照组的粘度高，平均高出约5％，而且随着聚合物工作液浓度的增加，Alccligenes sp.JNS05作用效果更加明显。此外，模拟试验中聚合物溶液需要在大于4h才会出现粘度损失现象，这是因为有害细菌主要分布在输水管壁上，在污水中的含量较低，导致单位时间内模拟样品的粘损程度要远小于实际注聚系统中的粘损。

[0063] 试验3、Alccligenes sp.JNS05降低聚合物粘度损失应用试验

[0064] 在采油三厂某注入站开展利用Alccligenes sp.JNS05降低聚合物粘度损失的应用试验。10月13日-10月16日，监测各试验注入井的注入液物性的日常变化，10月17日-24日注入Alccligenes sp.JNS0515L/d，注入浓度约为4.8×104CFU/ml，同时检测各注入井井口的粘度、浓度值等聚合物物性变化和硫化物、总铁离子等有害物质的含量变化，[0065] 试验期间注入井口硫化物及总铁离子含量的变化情况如图4和图5所示。在试验开展前，注入井井口的硫化物、总铁离子含量基本与管线长度正相关，这表明井口的硫化物、总铁离子主要在管线内部产生。但个别注入井，如北2-361-P21注入井，井口硫化物、总铁离子含量水平显著高于相似管长的其他注入井，这表明该注入井所属的注入管线中存在着SRB的局部富集。在注入Alccligenes sp.JNS05培养液后，各注入井井口注入液中的硫化物、总铁离子的含量均有显著下降，且含量与管线长度不相关，这表明注入管线内部的SRB受到显著抑制，注入井井口的硫化物、总铁离子主要来自于配注污水中。

[0066] 进一步分析发现如图6～13所示，其中有四口试验注入井的注入浓度上升，其中北1-310-P23注入井平均注入浓度由1388mg/L上升至1652mg/L，上升19％，平均粘度值则由
15.3cP上升至24.8cP，上升62％；北2-353-P25注入井平均注入浓度由1270mg/L上升至
1432mg/L，上升12.7％，平均粘度值则由11.8cP上升至16.8cP，上升42.4％；北2-360-SP22注入井平均注入浓度由1436mg/L上升至1704mg/L，上升18.7％，平均粘度值则由15.7cP上升至25.5cP，上升62.4％；北2-361-P29注入井平均注入浓度由1571mg/L上升至1783mg/L，上升13.5％，平均粘度值则由17.6cP上升至19.8cP，上升69.3％。两口试验注入井的注入浓度下降，如北1-311-P26注入井平均注入浓度由1602mg/L下降至1475mg/L，下降7.9％，平均粘度值则由18cP下降至17.7cP，下降1.7％；北2-361-P21注入井平均注入浓度由1581mg/L下降至1485mg/L，下降6.1％，平均粘度值则由16.7cP上升至17cP，上升1.8％；两口注入井的注入浓度维持稳定，如北1-312-P27注入井的平均注入浓度维持在1600mg/L左右，注入粘度则由17.6cP上升至21.4cP，上升21.6％；北2-362-P22注入井平均注入浓度维持在
2020mg/L，注入粘度则由33.3cP上升至38.2cP，上升14.7％。综上可知，扣除注入浓度变化的影响外，各注入井的粘度值均有上升，尤其是北2-361-P21注入井和北2-362-P22注入井，前者在注入浓度降低6.1％的条件下，仍能维持注入浓度稳定，甚至略有上升；而后者则在维持注入浓度稳定的条件下，注入粘度大幅上升14.7％。这表明，注入Alccligenes sp.JNS05培养液后可大幅降低聚合物在配注系统中的粘度损失，提高注入井井口粘度值。

[0067] 试验1～试验3中的Alccligenes sp.JNS05的培养基的配方为：NaCl 7.0g/L；MgSO4·H2O 0.68g/L；CaCl2·H2O 0.24g/L；NH4Cl 0.02g/L；KH2PO4,0.027；NaC2H3O2·3H2O 
0.68g/L；NaNO31.0g/L；NaHCO31.9g/L。

[0068] 试验1～试验3中的Alccligenes sp.JNS05培养液是指Alccligenes sp.JNS05在培养基中培养至OD620＝1.8得到的培养液。

[0069] 通过上述试验可知，Alccligenes sp.JNS05与聚合物工作液的配伍效果良好，而且随着聚合物工作液浓度的增加，菌株JNS05作用效果更加明显。注入Alccligenes sp.JNS05培养液后可大幅降低聚合物在配注系统中的粘度损失，提高注入井井口粘度值。