一种建立DOX调控的猪体细胞诱导重编程体系的方法转让专利
申请号 : CN201410179808.0
文献号 : CN103923877B
文献日 : 2016-04-27
发明人 : 王华岩 , 段安琴 , 于童 , 王宁
申请人 : 西北农林科技大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种建立DOX调控的猪体细胞诱导重编程体系的方法,其特征在于:该方法包括:步骤1)猪胎儿成纤维细胞的原代分离培养;
步骤2)将上述猪胎儿成纤维细胞重编程为第一代iPS;
步骤3)第一代iPS分化为猪第二代成纤维细胞;
步骤4)第二代成纤维细胞重编程为第二代iPS,具体实现方法为:
4.1)将第二代成纤维细胞在+DOX的iPS培养条件下培养5d;
4.2)0.25%胰酶消化计数重铺于饲养层细胞上,2d后出现克隆;
4.3)在体视显微镜下,将单个克隆挑出,撕成几份接于有饲养层细胞的48孔板,使其6
扩增至 2×10冻存于液氮中;
所述步骤1)的具体实现方式是:
1.1)从猪场取含有28d胎猪的子宫;
1.2)将胎猪与子宫分离,将胎猪放于含双抗的PBS(-)中;
1.3)将胎猪与羊膜及胎盘分离,将胎猪放于含双抗的PBS(-)中;
1.4)去除上述步骤1.3)中的头、尾、四肢及内脏,将组织在双抗的PBS(-)中清洗数次,去除血液;
1.5)将上述步骤1.4)中的组织放置于玻璃皿内,添加少许双抗的PBS(-),尽量将组织块剪碎;将组织块贴于新皿中,放置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中,待组织块边缘略微有点干,添加PEF培养液,于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱培养;培养液成分为DMEM+ 10% FBS+0.1 ㎎/ml青霉素+0.05 ㎎/ml链霉素;
1.6)上述步骤1.5)培养48h时换液,待迁出成纤维细胞达50%时,0.25%胰酶消化,经
200目滤器过滤去除组织块,细胞计数传代或冻存。
2.根据权利要求1所述建立DOX调控的猪体细胞诱导重编程体系的方法,其特征在于:所述步骤2)的具体实现方式是:
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2.1)以1.5×10接种293T于100mm培养皿,使其24h后密度达到70%-80%;
2.2)提前0.5h为293T换293T培养液;按12 ugTetO-FUW-OSKM/FUW-M2rtTA、8 ug pSPAX2、4 ugpMD2.G添加质粒,添加无菌水至总体积1093.75ul,添加156.25 ul CaCl2混匀;添加
1250 ul2×HBS,用1mL移液枪快速吹吸60次,静置8min后逐滴加入100mm培养皿内,混匀,放置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中;
2.3)转染后12h为293T换293T培养液,同时准备PEF细胞;转染后48h、72h收集毒液,经0.45uM滤器过滤后添加凝聚胺 8ug/ml,直接感染PEF细胞;感染后12h换液,为了增加感染效率可以进行二次感染;
2.4)将上述步骤2.3)0.25%胰酶消化计数重铺,诱导15d左右,将单克隆挑出,接于饲养层细胞或基质胶上;每两天用四型胶原酶传代。
3.根据权利要求2所述建立DOX诱导猪体细胞重编程的方法,其特征在于:所述步骤
3)的具体实现方式是:
3.1)将上述步骤2.4)的克隆用0.25%胰酶消化为单细胞,接于悬浮培养皿内培养4d;
3.2)将3.1)接于普通细胞培养皿贴壁继续培养9d;
3.3)将3.3)用PEF培养液培养,用0.25%胰酶消化传代四次,得到第二代成纤维细胞。
4.根据权利要求2~3所述建立DOX调控的猪体细胞诱导重编程体系的方法,其特征在于:所述猪胎儿成纤维细胞培养液和293T培养液含有DMEM+10% FBS+1%青链霉素的培养液;诱导时和饲养层细胞上对应的iPS培养液是含有DMEM+ 15% FBS + 1 mM L-谷胺酰胺+ 0.1mM非必需氨基酸+ 0.1mMβ-巯基乙醇+ 0.1 mg/mL青霉素+0.05 mg/mL链霉素+10ng/mL LIF+10ng/mLBMP4+2uMSB31542+3uMChir99021+10ng/mL bFGF的培养液;基质胶上对应的iPS培养液为TeSR-E8+10ng/mL LIF+10ng/mL BMP4+2uM SB31542+3uMChir99021;DOX浓度为4ug/mL。
5.根据权利要求4所述建立DOX调控的猪体细胞诱导重编程体系的方法,其特征在于:所述步骤2.3)中PEF细胞选取2~5代处于对数增长期的细胞。
6.根据权利要求5所述建立DOX调控的猪体细胞诱导重编程体系的方法,其特征在于:所述步骤2.4)或4.3)中,诱导形成的克隆采用机械法将其从原代细胞皿中挑出,继而将其撕成小片,将其接于饲养层细胞或基质胶上。
7.根据权利要求6所述建立DOX调控的猪体细胞诱导重编程体系的方法,其特征在于:所述步骤2.4)或4.3)中,克隆扩增过程中,经常观察克隆,及时将分化的克隆挑出。
8.根据权利要求3所述建立DOX调控的猪体细胞诱导重编程体系的方法,其特征在于:所述步骤3.1)用四型胶原酶将克隆悬起,接着用胰酶消化成单个细胞。
说明书 :
一种建立DOX调控的猪体细胞诱导重编程体系的方法
技术领域
背景技术
多能干细胞,具有自我更新能力和三胚层分化能力,但由于涉及胚胎伦理问题制约了其应
用。成体干细胞也可以应用于细胞治疗,但其有限的分化能力很大程度的限制了成体干细
胞的应用。而诱导多能干细胞的出现很好的解决了上述问题。
导出了小鼠多能干细胞,该细胞具有小鼠ES的特征,将其命名为诱导多能干细胞(induced
pluripotent stem cells,iPS)[Takahashi K, Tanabe K, et al. Cell [J]. Induction
of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors,
2007, 131(5):861-872]。随后,人、大鼠、猕猴、牛、羊、猪、马、兔等物种也建立了iPS细胞
系。
实验室将猪体细胞感染多种高滴度的逆转录病毒或慢病毒载体,诱导形成了iPS,但这样
的iPS具有不同的基因型,为进一步研究带来了干扰。同时,多种慢病毒或逆转录病毒载
体拷贝数的随机整合,导致了重编程效率低,仅0.001%-0.1%。而这样诱导形成的iPS通
常拥有15个拷贝数甚至更多的插入[Wernig M, Meissner A,et al. Nature [J]. In
vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state, 2007,
448(7151):318-324],揭示重编程过程需要高滴度或一定化学计量的转录因子表达。这种
多病毒载体随机高拷贝插入和重编程的随机性使机制研究及用小分子替代转录因子的研
究更具难度。
发明内容
四串联,解决了四因子随机插入拷贝数不一的问题,研究人员可以使用第二代成纤维细胞
在DOX条件下直接诱导细胞重编程,不用重新导入外源基因,不用考虑病毒感染效率。
度培养箱中,待组织边缘略微有点干时,添加PEF培养液,于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱培
养。
156.25 CaCl2混匀;添加1250 2×HBS,用1mL移液枪快速吹吸60次,静置8min后
逐滴加入100mm培养皿内,混匀,放置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中;
感染12h后换液,为了增加感染效率可以进行二次感染;
上;用四型胶原酶传代扩增。
LIF+10ng/mL BMP4+2 SB031542+3 Chir99021+10ng/mL bFGF的培养液。Matrigel
上对应的培养液为(TeSR-E8+)TeSR-E8+10ng/mL LIF+10ng/mL BMP4+2 SB031542+3
Chir99021。
备及减少制备病毒过程中潜在的危害,建立一种快速、有效、安全的猪体细胞重编程方法。
分化形成第二代成纤维细胞。而这种第二代成纤维细胞,在添加DOX的iPS培养液就可以
高效的重编程为iPS。第一代iPS、第二代成纤维细胞及第二代iPS的外源基因插入一致。
并且经免疫细胞化学、RT-PCR鉴定表明,所得到的猪iPS 表达多能干细胞标志基因Oct-4、
Sox2、SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60、Sal4和Esrrb,不表达TRA-1-81;碱性磷酸酶活性检测呈
阳性;RT-PCR分析表明具有分化为三胚层来源的各种细胞的潜能。
明可为猪重编程机制研究提供新的工具细胞来源。
附图说明
具体实施方式
把镊子将羊水膜及胎盘与胎猪分离,将胎猪放入新的含双抗的PBS(—)中,多洗几遍,将血
液洗净。将洗净的胎猪去除头、尾、四肢及内脏,即只取躯干,将组织上的血液去除干净。在
新的培养皿内添加少量PBS(—),将组织块尽量剪碎,将组织块贴于新的培养皿内,将其放
置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中,待组织边缘略微有点干时,添加PEF培养液,于37℃、
5%CO2饱和湿度培养箱培养。48h换液,代组织块迁出大量细胞,用0.25%胰酶消化,用200
目滤器过滤去除组织块,细胞计数传代或冻存。
0.5h给293T换新鲜10%DMEM 培养液。按12 TetO-FUW-OSKM/FUW-M2rtTA、8 pSPAX2、
4 pMD2.G添加质粒,添加无菌水至总体积1093.75 ,添加156.25 CaCl2混匀;添
加1250 2×HBS,用1mL移液枪快速吹吸60次,静置8min后逐滴加入100mm培养皿内,
混匀,置于显微镜下可观察到磷酸钙颗粒悬浮于培养液中,放置于37℃、5%CO2饱和湿度培
养箱中。12h为293T换10mL培养液,于转染后48h、72h收集毒液,经0.45 滤器过滤,
与DMEM按3:1混匀,添加polybrene (8 ),直接感染猪胎儿成纤维细胞;感染12h后
换液,为了增强感染效率换液后12h可以进行第二次感染。感染后的细胞在+DOX(4ug/mL)
的iPS培养液里培养。参见图2,15d左右,感染后的细胞会出现典型的iPS克隆,克隆边界
清晰,呈鼓起,核质比大。
胺酰胺+0.1mM非必需氨基酸+0.1mMβ-巯基乙醇+ 0.1 mg/mL青霉素+0.05 mg/mL链
霉素+10ng/mLLIF+10ng/mLBMP4+2 SB031542+3 Chir99021+10ng/mL bFGF;培养于
Matrigel上的克隆,所用培养液为(TeSR-E8+)TeSR-E8+10ng/mL LIF+10ng/mL BMP4+2
SB031542+3 Chir99021克隆在Matrigel条件下比在feeder上生长快速,但易分化,需
要及时将分化的克隆刮除,否则更多的克隆将会分化。碱性磷酸酶检测呈阳性,参见图4,经
PCR检测表明,外源基因TetO-FUW-OSKM和FUW-M2rtTA均插入成功;经RT-PCR检测表明,
外源基因Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc均表达。
养皿内培养4d,期间两天换一次培养液,每12h吹一次贴于皿底的细胞,减少细胞贴壁。换
液时,将皿内培养液全部收集到15mL离心管内,放置于培养箱1h,去除上清,将沉淀接于悬
浮培养皿继续培养。
5
细胞核质比明显变大。培养5d时,用0.25%胰酶消化,计数以1×10重铺于35mm培养皿
feeder上,在+DOX的iPS培养条件下培养2d出现克隆。克隆用四型胶原酶消化传代。经
免疫细胞化学、RT-PCR鉴定表明,所得到的猪iPS 表达多能干细胞标志基因Oct-4、Sox2、
SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60、Sal4和Esrrb,不表达TRA-1-81;碱性磷酸酶活性检测呈阳性;
RT-PCR分析表明具有分化为三胚层来源的各种细胞的潜能。
mLLIF+10ng/mlBMP4+2 SB031542+3 Chir99021+10ng/mL bFGF的培养液。Matrigel
上对应的培养液(TeSR-E8+)为TeSR-E8+10ng/mLLIF+10ng/mL BMP4+2 SB031542+3
Chir99021。
+
用TerS-E8培养液。
检测呈阳性;RT-PCR分析表明具有分化为三胚层来源的各种细胞的潜能。