一种黄酒用双功能酶交联酶聚集体的制备与应用，属于酶制剂、酿酒添加剂技术领域。本发明从普罗威登斯菌（Providencia sp.）JNB815中提取具有降解尿素和氨基甲酸乙酯(EC)活性的游离脲酶粗酶液,证明该游离脲酶为具有脲酶和氨基甲酸乙酯降解酶活性的双功能酶。这种双功能酶利用无载体固定化技术制成交联酶聚集体，该交联酶聚集体应用于黄酒中，可同时去除其中的尿素和氨基甲酸乙酯。该交联酶聚集体对尿素的去除率初次使用可达85.35%，使用6次后尿素去除率仍能达69.30%。对EC的去除率最高可达46.27%，经交联酶聚集体处理后的黄酒，其挥发性风味物质无明显变化。
1.一种黄酒用双功能酶交联酶聚集体的制备方法，其特征在于步骤为：（1）游离脲酶提取：
菌种普罗维登斯菌（Providencia sp.）JNB815；该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.8326；
种子培养：种子培养基组成以g/L计：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，KH2PO4
2，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，用NaOH调pH 7.0，用纯水配制；接种量3%，37℃摇床培养8-12 h，转速150 rpm；
发酵培养：发酵培养基组成以g/L计：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏5，酵母膏5，KH2PO4
2，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，四水硫酸锰0.05，六水硫酸镍0.05，HCl调pH5.5，用纯水配制；
接种量5%，37℃摇床培养20-24 h，转速150 rpm；
以上菌种经种子培养、发酵培养后，所得发酵液在4℃、8000rpm离心5 min后，弃去上清液，所得菌体用去离子水洗涤两次，再用pH4.5、50mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液洗涤一次，8000r/min离心5min后获得全细胞；将获得的全细胞用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释到原发酵液体积的1/10，重新悬浮菌体，搅匀，进行超声波破碎；超声波破碎条件为
300W、15min，破碎时间3s、间隔时间3s，处理量35mL；破碎液在4℃、10000rpm离心20min，收集上清液，即得到游离脲酶粗酶液；
a、乙醇分级沉淀：将步骤（1）中由（Providencia sp.）JNB815所提取的游离脲酶粗酶液，依次采用质量浓度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%及90%的乙醇分级沉淀，-1
10000r/min离心20min，所得沉淀复溶于pH6.8、25mmol·L 磷酸钠缓冲液中，测定上清液的酶活并绘制醇沉曲线；
b、DEAE-FF离子交换层析：DEAE-FF层析柱预先以pH6.8、25mmol·L 磷酸钠缓冲液平-1衡完全，将5mL醇沉得到的酶液上样，用所述磷酸钠缓冲液配制的0～1.0 mol·L 的NaCl-1溶液进行梯度洗脱，流速1.0 mL·min ，收集蛋白峰，测定各峰脲酶和EC降解酶酶活，合并有酶活部分，4℃保存备用；
c、Superdex 200凝胶过滤层析：以pH6.8、25mmol·L 磷酸钠缓冲液平衡Superdex
200层析柱2～3个柱体积，完全平衡后，将1mL步骤b收集的酶液加到层析柱上，以磷酸钠缓冲液进行洗脱，收集、合并有酶活部分，超滤浓缩得到纯化后的游离脲酶，4℃保存备用；
（3）交联酶聚集体的制备：步骤（2）c所得游离脲酶用质量浓度为10%的乙醇去除杂质后，采用终浓度为60%的乙醇进行沉淀，所得沉淀复溶于5mL含60%乙醇的pH4.5、50mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，加入反应体系总体积的质量体积分数0.3%的京尼平，室温-1下进行交联2.5h，混合溶液放置到4℃冰箱中生成交联酶聚集体CLEAs；在10000 r·min离心20min后弃上清，沉淀用超纯水洗涤两次，离心获得交联酶聚集体CLEAs，于4℃冰箱中贮存。
2.根据权利要求1所述黄酒用双功能酶交联酶聚集体的制备方法，其特征在于游离脲酶的纯化：a、乙醇分级沉淀：乙醇终浓度在10%-60%之间时，收集的沉淀具有脲酶和氨基甲酸乙酯降解酶的活性；
b、DEAE-FF离子交换层析时，在0.35 mol·L 、0.55 mol·L 时各出现一个洗脱峰，洗-1脱浓度0.35 mol·L 时出现的洗脱峰具有脲酶和EC酶酶活；
c、Superdex 200凝胶层析时，在洗脱体积为7.2 mL时出现一个大峰，具有脲酶和氨基甲酸乙酯降解酶这两种活性。
3.用权利要求1所述方法制备得到的黄酒用双功能酶交联酶聚集体的应用，其特征在-1于：取市售黄酒溶液，装于反应容器中，加入25 mg·L 交联酶聚集体，每反应6 h为一批-1次，以10000 r·min 离心20 min回收CLEAs，并加入同种新批次黄酒进行处理，重复多次，测定每次所回收的CLEAs质量和黄酒的尿素去除率，反应6批次后CLEAs湿重仅减少0.18 g，没有明显变化；说明交联酶聚集体的稳定性较好，在使用过程中没有发生酶的泄漏或溶解现象。
4.根据权利要求3所述黄酒用双功能酶交联酶聚集体的应用，其特征在于：所述交联酶聚集体对尿素的去除率初次使用可达85.35%，使用6次后尿素去除率仍能达69.30%；对EC的去除率最高达46.27%，重复使用性较好；经交联酶聚集体处理后的黄酒，其挥发性风味物质无明显变化。
一种黄酒用双功能酶交联酶聚集体的制备与应用
技术领域
[0001] 一种黄酒用双功能酶的纯化及交联酶聚集体的制备与应用，属于酶制剂、酿酒添加剂技术领域。
背景技术
[0002] 随着我国人民生活水平的提高，酒类饮料等发酵食品的消费量日趋上升。在发酵生产酒精饮料的过程中，有许多不需要的副产品，尿素就是其中之一，尿素在酸性条件下、高温灭菌、蒸馏过程或长时间储存过程中，容易和乙醇形成氨基甲酸乙酯。
[0003] 氨基甲酸乙酯（EC），是2A类致癌性的物质，微量存在于大部分发酵食品和酒精饮料中。国外许多国家（加拿大、美国、日本、欧盟等）和组织已经对发酵食品和酒精饮料中氨基甲酸乙酯作了限量要求，因此我国对各种不同产品中氨基甲酸乙酯的含量进行检测势在必行。
[0004] 我国黄酒中90%以上的氨基甲酸乙酯是来源于酒中所含尿素与乙醇的反应：。因此利用脲酶将饮料酒中的尿素及时除去，对于控制酒中氨基甲酸乙酯的生成具有重要意义。采用酒用酸性脲酶处理煎酒前的黄酒，可除去黄酒中大部分尿素，减少生成EC的可能性，而EC降解酶则能直接有效的分解成品黄酒中已经产生的EC。已有研究报道肠杆菌Enterobacter sp. R-SYB082能产生一种酸性脲酶同功酶，可实现同时去除黄酒中底物尿素及产物EC。
[0005] 交联酶聚集体由荷兰Delft大学Sheldon小组提出。采用物理方法沉淀酶蛋白，得到酶聚集体，再用交联剂交联，制备交联酶聚集体。其活性和稳定性可与交联酶晶体技术相媲美，制备过程不需要复杂耗时的结晶、纯化步骤，是一种低成本、易操作、高活性和稳定性的新型酶固定化方法。具有对酶纯度要求低、无需载体、单位体积活性高、空间效率高等优点。本发明采用（Providencia sp.） JNB815中提取的游离酶制成交联酶聚集体，能够同时降解黄酒中的尿素和氨基甲酸乙酯，对黄酒中EC的控制具有双重效果。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一种黄酒用双功能酶的纯化工艺及交联酶聚集体的制备与应用方法。
[0007] 本发明的技术方案，一种天然材料复合体系固定化酒用双功能酶的制备方法，将从（Providencia sp.）JNB815菌体细胞破碎液中提取的游离酶，经乙醇分级沉淀、DEAE-FF离子交换层析、Superdex 200凝胶层析进行纯化和SDS-PAGE凝胶电泳验证，初步证明为同一种具有两种酶活性的双功能酶。游离酶经乙醇沉淀和京尼平交联，制成交联酶聚集体。
[0008] 1.其工艺为：
[0009] （1）游离脲酶提取：
[0010] 菌种普罗威登斯菌（Providencia sp.）JNB815；该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.8326。
[0011] 种子培养：种子培养基组成以g/L计：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，KH2PO4 2，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，用NaOH调pH 7.0，用纯水配制；接种量3%，37℃摇床培养8-12 h，转速150 rpm；
[0012] 发酵培养：发酵培养基组成以g/L计：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏5，酵母膏5，KH2PO4 2，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，四水硫酸锰0.05，六水硫酸镍0.05，HCl调pH5.5，用纯水配制；接种量5%，37℃摇床培养20-24 h，转速150 rpm；
[0013] 以上菌种经种子培养、发酵培养后，所得发酵液在4℃、8000rpm离心5 min后，弃去上清液，所得菌体用去离子水洗涤两次，再用pH4.5、50mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液洗涤一次，8000r/min离心5min后获得全细胞；将获得的全细胞用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释到原发酵液体积的1/10，重新悬浮菌体，搅匀，进行超声波破碎；超声波破碎条件为300W、15min，破碎时间3s、间隔时间3s，处理量35mL；破碎液在4℃、10000rpm离心20min，收集上清液，即得到游离脲酶粗酶液；
[0014] （2）游离脲酶的纯化：
[0015] a、乙醇分级沉淀：将步骤（1）中由（Providencia sp.）JNB815所提取的游离脲酶粗酶液，依次采用质量浓度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%及90%的乙醇分级沉淀，-110000r/min离心20min，所得沉淀复溶于pH6.8、25mmol·L 磷酸钠缓冲液中，测定上清液的酶活并绘制醇沉曲线；
[0016] b、DEAE-FF离子交换层析：DEAE-FF层析柱预先以pH6.8、25mmol·L-1磷酸钠缓冲-1液平衡完全，将5mL醇沉得到的酶液上样，用所述磷酸钠缓冲液配制的0～1.0 mol·L 的-1
NaCl溶液进行梯度洗脱，流速1.0 mL·min ，收集蛋白峰，测定各峰脲酶和EC降解酶酶活，合并有酶活部分，4℃保存备用；
[0017] c、Superdex 200凝胶过滤层析：以pH6.8、25mmol·L-1磷酸钠缓冲液平衡Superdex 200层析柱2～3个柱体积，完全平衡后，将1mL步骤b收集的酶液加到层析柱上，以磷酸钠缓冲液进行洗脱，收集、合并有酶活部分，超滤浓缩得到纯化后的游离脲酶，4℃保存备用；
[0018] （3）交联酶聚体的制备：步骤（2）c所得游离脲酶用质量浓度为10%的乙醇去除杂质后，采用终浓度为60%的乙醇进行沉淀，所得沉淀复溶于5ml含60%乙醇的pH4.5、50mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，加入反应体系总体积的0.3%（m/v）的京尼平（Genipin，分子式C11H14O5），室温下进行交联2.5h，混合溶液放置到4℃冰箱中生成交联酶-1
聚集体CLEAs；在10000 r·min 离心20min后弃上清，沉淀用超纯水洗涤两次，离心获得交联酶聚集体CLEAs，于4℃冰箱中贮存。
[0019] 2.纯化酶的性质：采用10%的乙醇去杂后，收集乙醇终浓度在10%-60%之间的沉-1淀具有脲酶和氨基甲酸乙酯降解酶的活性。DEAE-FF离子交换层析时，在0.35 mol·L 、-1 -1
0.55 mol·L 时各出现一个洗脱峰，洗脱浓度0.35 mol·L 时出现的洗脱峰具有脲酶和EC酶酶活。Superdex 200凝胶层析时，在洗脱体积为7.2 mL左右出现一个大峰，具有脲酶和氨基甲酸乙酯降解酶这两种活性。该洗脱体积对应Superdex 200凝胶柱的外水体积。以上三步纯化的过程中，两种酶的活性峰重叠，分子量一致。由SDS-PAGE电泳可以看出，经过乙醇分级沉淀，分离效果较为明显，去除了部分杂质；DEAE-FF分离后，去除了两三种杂蛋白，各条带分界清晰，能看到若干主要条带；经由Superdex 200分离最终得到的活性峰纯化倍数较高，目的条带数为2条，推测可能为同一种酶的两种不同大小的亚基。
[0020] 游离酶酶活测定方法：采用靛酚蓝反应(Berthelot reaction)比色法。
[0021] 酶活力定义：在常压，37℃，pH4.5条件下，每分钟分解底物尿素或氨基甲酸乙酯产生1µmol氨为一个酶活力单位。其中，尿素降解酶和EC降解酶活力的测定分别采用尿素和EC为底物。
[0022] 交联酶聚集体酶活测定方法：取0.1 g交联酶聚集体分别浸入一定体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制的pH4.5的3%的尿素或EC溶液中，在37℃恒温水浴箱中保温20 -1min后，10000 r·min 离心取其上清，余下的测定步骤与游离酶活力测定步骤相同。酶活力定义同游离酶。
[0023] 蛋白质含量的测定：采用考马斯亮蓝染色法，以牛血清白蛋白作为标准蛋白质。
[0024] 尿素含量的测定方法：二乙酰一肟法。
[0025] EC含量的测定方法：采用气相色谱质谱联用法。
[0026] 黄酒中风味物质的测定：采用顶空-固相微萃取-气质联用技术。
[0027] 3、制备得到的黄酒用双功能酶交联酶聚集体的应用：取市售黄酒溶液，装于反应-1 -1容器中，加入25 mg·L 交联酶聚集体，每反应6 h为一批次，以10000 r·min 离心20 min回收CLEAs，并加入同种新批次黄酒进行处理，重复多次，测定每次所回收的CLEAs质量和黄酒的尿素去除率，反应6批次后CLEAs湿重仅减少0.18 g，没有明显变化；说明交联酶聚集体的稳定性较好，在使用过程中没有发生酶的泄漏或溶解现象。
[0028] 所述交联酶聚集体对尿素的去除率初次使用可达85.35%，使用6次后尿素去除率仍能达69.30%；对EC的去除率最高达46.27%，重复使用性较好；经交联酶聚集体处理后的黄酒，其挥发性风味物质无明显变化。
[0029] 本发明的有益效果：该双功能酶制成交联酶聚集体后，能在酒中稳定发挥作用。在黄酒中加入交联酶聚集体后对尿素的去除率初次使用可达85.35%，使用6次后尿素去除率仍能达69.30%。对EC的去除率最高可达46.27%，且交联酶聚集体便于回收，可重复利用多次。本发明可以不改变原酿造酒的工艺条件，不改变酒的风味，在勾兑，澄清酒的过程中，添加交联酶聚集体，就可以降低尿素和EC含量。且相对于其他的固定化方法来说，成本较低，是一种较为理想的同时去除酒中尿素和EC的方法。
[0030] 生物材料样品保藏：一株产酸性脲酶和EC降解酶的菌株，分类命名为普罗威登斯菌（Providencia sp.）JNB815，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路l号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No.8326，保藏日期为2013年10月12日。
附图说明
[0031] 图1醇沉曲线。
[0032] 图2脲酶的DEAE-FF离子交换层析图谱。
[0033] 图3脲酶的Superdex 200凝胶层析图谱。
[0034] 图4 SDS-PAGE电泳图。1、Marker；2、粗酶；3、醇沉；4、DEAE；5、Superdex 200。
[0035] 图5 CLEAs应用于膜反应器中的工艺流程图。
[0036] 图6黄酒的挥发性风味物质图谱。（a图表示原黄酒，b图表示交联酶聚集体处理后的黄酒）。
具体实施方式
[0037] 实施例1
[0038] 游离酶提取：保藏编号为：CGMCC No.8326的普罗威登斯菌（Providencia sp.）JNB815菌种经过种子培养和发酵培养获得一定量菌体，将发酵液4℃、8000rpm离心5 min后，弃上清，所得菌体用去离子水洗涤两次，pH4.5、50mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液洗涤一次，离心获得全细胞；将获得的全细胞用pH4.5、50mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释到原发酵液体积的1/10，重新悬浮菌体，搅匀，进行超声波破碎，超声波破碎条件为300 W、15 min，破碎时间3 s、间隔时间3 s，处理量35 mL；破碎液在4℃、10000 rpm离心
20 min，收集上清液，即为游离脲酶粗酶液；
[0039] 将（Providencia sp.） JNB815所提取的游离脲酶，经乙醇分级沉淀、DEAE-FF离子交换层析、Superdex 200凝胶过滤层析。尿酶和氨基甲酸乙酯降解酶的醇沉分级范围相同，活性峰重叠。初步证明具有这两种活性的酶为同一种双功能酶。具体步骤为：
[0040] 乙醇分级沉淀：将由（Providencia sp.）JNB815所提取的游离脲酶，依次采用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%及90%的乙醇分级沉淀，离心，所得沉淀复溶于pH6.8、-1
25mmol·L 磷酸钠缓冲液中，测定上清液的酶活并绘制醇沉曲线，曲线如图1所示。
[0041] DEAE-FF离子交换层析：DEAE-FF层析柱预先以25 mmol·L-1、pH6.8磷酸钠缓冲-1液平衡完全，将5 mL醇沉得到的酶液上样，用0～1.0 mol·L 的NaCl（磷酸钠平衡缓冲-1
液配制）溶液进行梯度洗脱，流速1.0 mL·min ，收集蛋白峰，测定各峰酶活，合并有酶活部分，4℃保存备用，脲酶的DEAE-FF离子交换层析图谱如图2所示。
[0042] Superdex 200凝胶过滤层析：以25 mmol·L-1磷酸钠缓冲液（pH6.8）平衡Superdex 200层析柱2～3个柱体积，完全平衡后，将1 mL DEAE-FF离子交换层析步骤收集的酶液加到层析柱上，以磷酸钠平衡缓冲液进行洗脱，收集、合并有酶活部分，超滤浓缩后4℃保存备用。脲酶的Superdex 200凝胶层析图谱如图3所示。（Providencia sp.）JNB815产酶的纯化结果如表1所示。
[0043] 表1 Providencia sp. JNB815产酶的纯化结果
[0044]
[0045] 采用10%的乙醇去杂后，收集乙醇终浓度在10%-60%之间的沉淀具有脲酶和氨基-1 -1甲酸乙酯降解酶的活性。DEAE-FF离子交换层析时，在0.35 mol·L 、0.55 mol·L 时各出-1
现一个洗脱峰，洗脱浓度0.35 mol·L 时出现的洗脱峰具有脲酶和EC酶酶活。Superdex
200凝胶层析时，在洗脱体积为7.2 mL左右出现一个大峰，具有脲酶和氨基甲酸乙酯降解酶这两种活性。该洗脱体积对应Superdex 200凝胶柱的外水体积。以上三步纯化的过程中，两种酶的活性峰重叠，分子量一致。由图4，SDS-PAGE电泳图可以看出，经过乙醇分级沉淀，分离效果较为明显，去除了部分杂质；DEAE FF分离后，去除了两三种杂蛋白，各条带分界清晰，能看到若干主要条带；经由Superdex 200分离最终得到的活性峰纯化倍数较高，目的条带数为2条。
[0046] 实施例2
[0047] 游离脲酶用10%的乙醇去除杂质后，采用终浓度为60%的乙醇进行分级沉淀，所得沉淀复溶于少量含60%乙醇的pH4.5、50mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，加入反应体系总体积的0.3%（m/v）的京尼平（Genipin，分子式C11H14O5）室温下进行交联，反应2.5h，-1混合溶液放置到4℃冰箱中生成CLEAs。10000 r·min 离心弃上清，沉淀用超纯水洗涤两次，离心获得交联酶聚集体，于4℃冰箱中贮存。
[0048] 实施例3
[0049] 向市售黄酒中加入25 mg·L-1尿素，配制成一定浓度的黄酒样品溶液，加入实施例2所得的交联酶聚集体进行处理。容器置于磁力搅拌器中，每反应6 h为一批次，10000 -1r·min 离心20 min回收CLEAs，并加入同种新批次黄酒进行处理，重复多次，测定每次所回收的CLEAs质量和黄酒的尿素去除率。反应6批次后CLEAs湿重仅减少0.18 g，没有明显变化。说明交联脲酶聚集体的稳定性较好，在使用过程中没有发生酶的泄漏或溶解现象。
第1批次和第6批次的尿素去除率分别为85.35%和69.30%，重复使用性较好。
[0050] CLEAs应用于膜反应器中的工艺流程图如图5所示。
[0051] 表2 交联脲酶聚集体在黄酒中的重复使用性
[0052]
[0053] 实施例4
[0054] 如图5所示，将实施例2所得的交联酶聚集体,分别加入不同量于反应容器中，加入相同体积的黄酒进行处理。以一定的转速搅拌，处理黄酒12 h后，反应后的黄酒样品经过微滤膜分离装置进行分离。分别测定反应前后EC浓度、尿素浓度和挥发性风味物质的变化。如表3和表4所示，随着交联脲酶聚集体加入量的增大，黄酒的尿素去除率和EC去除率有所提高。当脲酶加酶量为0.15 U·mL-1时，尿素去除率达80.49%。当EC酶加酶量为0.17 U·mL-1时，EC去除率为46.27%。由GC-MS图谱分析结果可知，经交联酶聚集体处理后的黄酒，其挥发性风味物质的种类及含量变化不明显。黄酒的挥发性风味物质图谱如图
6所示。
[0055] 表3 CLEAs对黄酒样品的尿素去除率
[0056]
[0057] 表4 CLEAs对黄酒样品的EC去除率
[0058]
