一种表达猪端粒酶反转酶转座子载体及其构建方法与在建立猪永生化细胞系中的应用

摘要

本发明的一种表达猪端粒酶反转酶转座子载体的构建方法与在建立猪永生化细胞系中的应用属于生物技术研究领域，包括猪蛋白翻译延伸因子1a启动子的克隆与转录活性检测、SB转座子表达载体构建及其外源基因整合、猪端粒酶反转录酶cDNA克隆、活性检测以及猪成纤维永生化细胞系建立。与其他方法相比，用本发明转座子载体建立的猪永生化细胞系为非转化正常细胞，不含抗性基因、病毒基因和癌基因，适用于细胞生理功能研究、猪病毒分离培养和疫苗生产。

权利要求

1.一种表达猪端粒酶反转酶的转座子载体，是由SB转座子载体pT2/HB载体骨架、SB转座子重复序列IR/DR、猪蛋白翻译延伸因子1a(EF-1a)启动子、猪端粒酶反转酶(TERT)cDNA和生长激素基因polyA序列组成。

2.权利要求1所述的表达猪端粒酶反转酶的转座子载体在猪永生化细胞系建立中的应用。

3.权利要求1所述的表达猪TERT转座子载体的构建方法，其步骤如下：(1)用聚合酶链式反应扩增猪EF-1a启动子和生长激素基因polyA序列，插入SB转座子载体pT2/HB，获得稳定表达载体pTEG；

(2)用反转录PCR扩增猪TERT cDNA，插入pTEG载体获得重组转座子载体pTEG-TERT。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)是：用猪EF-1a启动子驱动永生化基因稳定表达；步骤(2)是：以猪TERT cDNA作为猪源细胞的永生化基因，以SB转座子介导永生化基因整合。

5.权利要求2所述的表达猪TERT转座子载体在猪永生化细胞系建立中的应用，其具体方法如下：(1)用转座子载体pTEG-TERT和转座酶载体pSB16共转染猪原代细胞，用有限稀释法获得单细胞克隆；

(2)用PCR分别检测细胞克隆的抗性基因和猪TERT基因表达盒，排除重组载体随机整合的细胞克隆，保留转座子介导猪TERT基因表达盒整合的细胞克隆；

(3)对目的细胞克隆进行反复传代，获得永生化细胞系；

所述的转座子载体pTEG-TERT通过下述方法获得：

(1)用聚合酶链式反应扩增猪EF-1a启动子和生长激素基因polyA序列，插入SB转座子载体pT2/HB，获得稳定表达载体pTEG；

(2)用反转录PCR扩增猪TERT cDNA，插入pTEG载体获得重组转座子载体pTEG-TERT。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(1)是：猪TERT永生化的细胞为非转化正常细胞；步骤(2)是：筛选的细胞克隆不含抗性基因和病毒序列。

说明书

一种表达猪端粒酶反转酶转座子载体及其构建方法与在建

立猪永生化细胞系中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术研究领域，具体涉及一种表达猪端粒酶反转录酶转座子载体的构建及其在建立猪永生化细胞系中的应用。

背景技术

[0002] 正常组织来源的原代细胞可在体外培养条件生长和分裂，但不仅来源有限、制备困难，而且反复传代后就会发生衰老和死亡，使得细胞培养技术的应用受到限制。细胞系可以克服原代细胞的缺点，也是细胞生物学特性研究、病毒分离培养和疫苗生产必不可少的工具，但目前国内外猪细胞系种类极为有限。

[0003] 细胞永生化是指体外培养的细胞在自发突变或环境因素影响下从衰老危机中逃离，从而获得无限增殖能力的过程，但动物细胞自发永生化的几率很低，人细胞自发永生化更为罕见。将外源永生化基因导入细胞，可以增加细胞永生化的几率，进而建立永生化细胞株。常用的细胞永生化基因主要有EB病毒、SV40病毒、人乳头瘤病毒的细胞转化基因，Myc等原癌基因，以及抑癌基因突变体等；常用的基因导入方法主要有电穿孔法、磷酸钙沉淀法、脂质体转染法以及重组逆转录病毒、腺病毒、慢病毒转导法等。然而，上述方法导入的外源基因与细胞基因组整合是随机的，基因插入及其表达产物有可能干扰细胞的正常生理功能，如失去分化能力和改变分化特性等。另外，上述方法获得的转化细胞不是正常细胞，其表型和核型等有可能发生变化，而且建立的细胞系多不具有无限增殖能力，有的仅度过了M1期而延长了细胞的寿命。

[0004] 端粒和端粒酶的发现为细胞永生化提供了新的思路。端粒是真核细胞染色体末端的特殊结构，对维持细胞染色体稳定和完全复制具有重要作用。正常体细胞的端粒随细胞分裂而逐渐缩短，最终导致细胞衰老和死亡，因此端粒长度与细胞寿命密切相关。端粒酶是一种特殊的逆转录酶，能以自身RNA为模板合成和延伸端粒DNA，以补偿细胞分裂导致的染色体缩短。端粒酶由端粒酶RNA、相关蛋白和反转录酶(TERT)三部分组成，但正常情况下成年体细胞的端粒酶活性处于抑制状态，而外源TERT基因导入能稳定原代细胞的端粒长度和使细胞永生化。与传统的永生化基因转染相比，用端粒酶基因转染产生的永生化细胞是正常细胞而非转化细胞，仍然保持正常细胞的生长速率、核型、接触生长抑制性、血清依赖性等生理特性，而且不具有致癌性和软琼脂克隆形成能力。另外，TERT介导的永生化细胞已度过了M期，与胚胎细胞一样是真正意义上的永生化细胞，有的能在体外传100代以上。

[0005] 目前普遍用于动物细胞永生化的是人源TERT基因，对动物细胞是外源基因，其永生化效率也可能有别于动物源TERT。另外，基因导入方法主要有表达质粒转染法和重组病毒转导法，前者含抗性基因且需要长时间筛选，后者多不能有效整合外源基因，逆转录病毒和慢病毒虽能介导外源基因整合，但基因整合不仅是随机的，而且插入的病毒序列存在生物安全隐患。本发明用猪蛋白翻译延伸因子1a(EF-1a)启动子，以猪TERT cDNA为永生化基因，用转座子介导永生化基因整合，建立的永生化细胞系不仅能维持正常细胞生理功能，而且不含抗性基因、病毒序列和癌基因，可用于猪细胞生物学特性研究、病毒分离培养和疫苗生产。

发明内容

[0006] 本发明的转座子载体由SB转座子重复序列、猪EF-1a启动子、猪TERT cDNA和生长激素基因polyA序列组成，经与转座酶载体共转染细胞证明，该载体能有效介导猪TERT基因与细胞基因组的整合和稳定表达。

[0007] 本发明所述转座子载体用下列方法构建：

[0008] (1)用聚合酶链式反应扩增猪EF-1a启动子和生长激素基因polyA序列，插入SB转座子载体pT2/HB，获得稳定表达载体pTEG；

[0009] (2)用反转录PCR扩增猪TERT cDNA，插入pTEG载体获得重组载体pTEG-TERT。

[0010] 其中步骤(1)是：用猪EF-1a启动子驱动永生化基因稳定表达；步骤(2)是：以猪TERT cDNA作为猪源细胞的永生化基因，以SB转座子介导永生化基因整合。

[0011] 本发明还公开了所述的表达猪端粒酶反转酶的转座子载体在猪永生化细胞系建立中的应用。其具体方法如下：

[0012] (1)用转座子载体pTEG-TERT和转座酶载体pSB16共转染猪原代细胞，用有限稀释法获得单细胞克隆；

[0013] (2)用PCR分别检测细胞克隆的抗性基因和猪TERT基因表达盒，排除重组载体随机整合的细胞克隆，保留转座子介导猪TERT基因表达盒整合的细胞克隆；

[0014] (3)对目的细胞克隆进行反复传代，获得永生化细胞系。

[0015] 进一步地，公开了上述转座子载体在建立猪成纤维永生化细胞系中的应用。本发明中采用了以下方法对转座子载体进行验证：

[0016] (1)用聚合酶链式反应(PCR)扩增猪EF-1a启动子和生长激素基因polyA，插入SB转座子载体pT2/HB，获得稳定表达载体pTEG。

[0017] (2)将PCR扩增绿色荧光蛋白(GFP)报告基因序列插入pTEG载体，用重组载体pTEG-GFP转染猪源细胞，根据荧光阳性细胞数及荧光强度判定猪EF-1a启动子的转录活性。

[0018] (3)将重组载体pTEG-GFP与SB转座酶载体共转染猪源细胞，反复传代后进行荧光观察，根据稳定表达GFP细胞克隆数判定转座子介导的外源基因整合效率。

[0019] (4)将反转录PCR克隆的猪TERT cDNA插入pTEG载体，用重组载体pTEG-TERT与转座酶载体共转染猪成纤维细胞，反复传代后获得永生化细胞系。

[0020] 与现有的其他方法相比，用本发明转座子载体建立的猪永生化细胞系不仅能维持正常细胞的生理功能，而且不含抗性基因、病毒序列和癌基因，能用于猪细胞生物学特性研究、病毒分离培养和疫苗生产。附图说明：

[0021] 图1为转座子载体pTEG的结构示意图。IR/DR为SB转座子左(L)、右(R)反向重复序列，pEF-1a为猪蛋白翻译延伸因子1a启动子，BGH pA为生长激素基因polyA序列，NotI和XbaI为外源基因插入位点。

[0022] 图2为转座子介导TERT基因整合细胞克隆的鉴定。Amp代表载体上的氨苄青霉素抗性基因，TERT为外源端粒酶反转录酶基因。

[0023] 图3为原代和永生化猪成纤维细胞的表面分子鉴定。CD29为泛细胞表面标志，Vim(波形蛋白)为成纤维细胞表面标志，CK18(角蛋白18)为上皮细胞表面标志。

[0024] 图4为猪成纤维细胞的端粒酶活性检测结果。G代表传代次数。

具体实施方式

[0025] 生物材料来源：

[0026] 1.pcDNA3载体：从美国Invitrogen公司引进，本实验室保存。

[0027] 2.PK-15细胞：从美国ATCC引进(ATCC CCL-33)，本实验室保存。

[0028] 3.pMD18-T载体：从KaTaRa公司引进。

[0029] 4.pT2/HB转座子载体和pSB16转座酶载体:从美国Addgene公司引进。文献：Cui Z,Geurts AM,Liu G,Kaufman CD,and Hackett PB.Structure-function analysis of the inverted terminal repeats of the sleeping beauty transposon.J Mol Biol.2002，318:1221–1235.

[0030] 5.pEGFP-N1载体：从美国BD Biosciences Clontech公司引进。文献：Prasher DC,Eckenrode VK,Ward WW,et al.Primary structure of the aequorea victoria green fluorescent protein.Gene,1992,111(2):229-233.

[0031] 6.DH5a大肠杆菌：从美国BD Biosciences Clontech公司引进，本实验室保存。

[0032] 7.六周龄姜曲海仔猪：由江苏省畜牧兽医职业技术学院种猪场提供。

[0033] 具体操作步骤如下：

[0034] 1.转座子载体构建：

[0035] (1)根据pcDNA3载体中生长激素polyA序列(GenBank accession No:AY738222)合成1对引物：

[0036] 正向 引物:5-TATCTAGACTAGAGCTCGCTGATCAGCC-3(引 入XbaI位点 )(SEQ ID NO.1)；

[0037] 反向引物:5-TAAGATCTTCCCCAGCATGCCTGCTATTG-3(引入BglII位点)(SEQ ID NO.2)。

[0038] 以pcDNA3为模板，按照Ex TaqTM polymerase(KaTaRa公司)说明书进行PCR扩增，将PCR产物插入pMD-18T载体，序列测定结果显示：扩增产物的核苷酸序列与发表序列(GenBank accession No:AY738222)完全一致。

[0039] (2)根据猪EF-1a启动子序列(GenBank accession No:FM995601)设计1对引物：

[0040] 正向引物：5-TAGATATCCAAGGGCGGTGGAGAAGCCC-3(引入EcoRV位点)(SEQ ID NO.3)；

[0041] 反向引物：5-TAGCGGCCGCTCACGACACCTAAGACGACA-3(引入NotI位点)(SEQ ID NO.4)。

[0042] 按照Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(KaTaRa公司)说明书，从TMPK-15细胞提取基因组DNA。按照Ex Taq polymerase(KaTaRa公司)说明书进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分析结果显示：扩增产物为预期的1273bp；将扩增产物克隆入pMD18-T载体进行序列测定,结果显示：克隆的猪EF-1a启动子序列(SEQ ID NO.21)与发表序列(GenBank accession No:FM995601)相比仅第20位碱基(T/C)有差异，无插入或缺失突变。

[0043] (3)用限制酶XbaI和BglII消化生长激素polyA序列PCR扩增产物，电泳分离后用DNA凝胶回收试剂盒(Fermentas公司)回收目的片段，插入SB转座子载体pT2/HB的XbaI/BglII位点；用限制酶EcoRV和NotI将猪EF-1a启动子从测序载体上切下，插入含polyA序列pT2/HB载体的EcoRV/NotI位点，获得新转座子载体命名为pTEG(图1)。

[0044] 2.猪EF-1a启动子的转录活性比较

[0045] (1)根据pEGFP-N1载体中绿色荧光蛋白基因序列(GenBank accession No:U55762)设计1对引物：

[0046] 正向引物：5-TAGCGGCCGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3(引入NotI位点)(SEQ ID NO.5)；

[0047] 反向引物:5-ATGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3(引入NotI位点)(SEQ ID NO.6)。

[0048] 以pEGFP-N1载体为模板，按照Ex TaqTM polymerase(KaTaRa公司)说明书进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分析结果显示：扩增产物为预期的736bp。用限制酶NotI消化PCR扩增产物，按照DNA凝胶回收试剂盒(Fermentas公司)说明书回收目的片段，插入pTEG载体的NotI位点，序列测定结果显示：克隆基因的核苷酸序列与发表序列(GenBank accession No:U55762)完全一致。

[0049] (2)分别将空质粒pTEG、重组质粒pTEG-GFP和对照质粒pEGFP-N1转化DH5a大肠杆菌，按照质粒小提试剂盒(AXYGEN公司)说明书分别提取质粒DNA。用含10％犊牛血清(Hyclone公司)的DMDM培养液(GIBCO公司)，在6孔板培养PK-15至细胞密度为90％，按照Lipofectamine2000(Invitrogen公司)说明书进行基因转染，转染后24小时进行荧光显微镜观察。结果显示：pTEG转染细胞为荧光检测阴性，pTEG-GFP和pEGFP-N1转染细胞培养中均有荧光阳性细胞，且荧光强度相当，表明猪EF-1a启动子的转录活性与pEGFP-N1载体中的人巨细胞病毒早期强启动子相当。

[0050] 3.转座子介导的外源基因整合效率检测

[0051] 按照常规方法制备猪肾成纤维细胞，用含10％犊牛血清(Hyclone公司)的DMDM培养液(GIBCO公司)，在6孔板培养至细胞密度为90％。按照Lipofectamine2000(Invitrogen公司)说明书，分别用pTEG-GFP进行单独转染和与转座酶载体pSB16进行共转染，对转染细胞进行反复传代后进行荧光显微镜观察。结果显示：在传到第7代时，pTEG-GFP与pSB16共转染细胞培养中的荧光阳性细胞显著多于pTEG-GFP单独转染，表明SB转座子系统能有效介导外源基因与猪成纤维细胞基因组的整合。

[0052] 4.表达猪端粒酶反转录酶转座子载体的构建

[0053] (1)根据发表的猪TERT cDNA序列(NM_001244300)设计1对引物：

[0054] 正 向引 物：5-TATCTAGAATGCCGCGCGCGCCCCGGTG-3(引 入XbaI位 点 )(SEQ ID NO.7)；

[0055] 反 向引 物：5-ATTCTAGATCAGTCCAGGATGGTCCGGA-3(引 入XbaI位 点 )(SEQ ID NO.8)。

[0056] 按照RNAiso Plus(KaTaRa公 司)说明 书，从PK-15细 胞提 取RNA，按 照TMReverse Transcriptase M-MLV(Bio-Rad公司)说明书进行反转录，按照LA Taq polymerase(KaTaRa公司)说明书进行PCR扩增。结果显示：克隆的猪TERT cDNA为预期的3396bp。将PCR产物克隆入pMD-18T载体进行序列测定，用DNAStar软件将核苷酸序列推导成氨基酸序列，与已发表的猪TERT氨基酸序列(NM_001244300)进行比对分析。结果显示：克隆的猪TERT cDNA编码1131个氨基酸，其推导的氨基酸序列(SEQ ID NO.22)与发表序列的同源性95.5％，无插入或缺失突变。

[0057] (2)用限制酶XbaI将猪TERT cDNA从pMD-18T载体上切下，插入转座子载体pTEG的XbaI位点，用限制酶XbaI消化重组质粒pTEG-TERT，电泳分析结果显示：载体和插入片段大小与预期符合。

[0058] 5.基因转染与永生化细胞克隆筛选

[0059] (1)用含10％犊牛血清的DMDM培养液，在6孔板培养至猪肾成纤维细胞至密度为90％，按照5:1比例将转座子载体pTEG-TERT与转座酶载体pSB16混合，按照Lipofectamine2000(Invitrogen公司)说明书进行基因转染。细胞培养2-3天后，按照文献(徐志凯.实用单克隆抗体技术.西安:陕西科学技术出版社,1991)用有限稀释法进行细胞克隆化。

[0060] (2)转染细胞培养两周后，选择10个单克隆细胞生长孔，用胰酶消化法分散细胞进行扩大培养，按照Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(KaTaRa公司)说明书提取细胞基因组DNA，按照RNAiso Plus(KaTaRa公司)说明书提取细胞RNA。根据pTEG-TERT载体上氨苄青霉素抗性基因序列(GenBank:KJ146689.1)设计1对引物：

[0061] 正向引物：5-TCCGTGTCGCCCTTATTC-3(SEQ ID NO.9)；

[0062] 反向引物：5-AAGCGGTTAGCTCCTTCG-3(SEQ ID NO.10)。

[0063] 根据pTEG-TERT载体上TERT基因序列(GenBank:NM_001244300)设计1对引物：

[0064] 正向引物：5-TCCCACAGGGCTCCATTCT-3(SEQ ID NO.11)；

[0065] 反向引物：5-GGGCGTAACTGGCATAGTCG-3(SEQ ID NO.12)。

[0066] 以提取的细胞基因组DNA为模板，分别用氨苄青霉素抗性基因引物和猪TERT引TM物，按照Ex Taq polymerase(KaTaRa公司)说明书进行PCR扩增，结果显示：在检测的10个细胞克隆中，8个为氨苄青霉素抗性和TERT基因检测阳性，为重组质粒随机整合克隆；以其余两个细胞克隆的细胞RNA为模板，分别用氨苄青霉素抗性和TERT基因引物进行RT-PCR检测，结果显示：氨苄青霉素抗性基因表达为阴性，TERT基因表达为阳性，为转座子介导的TERT基因整合克隆(图2)。

[0067] 6.猪成纤维永生化细胞系鉴定

[0068] (1)形态观察：将上述两个细胞克隆进行连续传代，在传0、10、20、30、40代时进行细胞形态观察，结果显示：猪TERT基因永生化猪成纤维细胞的形态与原代成纤维细胞相同。

[0069] (2)生长特性测定：选择第0、10、20、30、40代细胞，按照文献(Chan R W,Schwab K E,and Gargett C E.Clonogenicity of human endometrial epithelial and stromal cells.Biol Reprod,2004,70(6):1738-50.)测定细胞生长曲线、群体倍增时间和克隆效率，结果显示：猪TERT基因永生化成纤维细胞与原代细胞具有相似的生长曲线；猪原代成纤维细胞的群体倍增时间和克隆效率分别为40.3小时和6.1％，第10、20、30、40代永生化细胞的群体倍增时间分别缩短0.1、3.3、4.3和4.6小时，克隆形成率分别提高1.7％、4.0％、4.8％和4.3％。

[0070] (3)细胞周期测定：选择第3代原代和第40代永生化成纤维细胞，按照文献(Peter Rabinovitch.Basics of DNA Cell Cycle Analysis.www.phoenixflow.com)，用流式细胞术测定细胞生长周期。结果显示：两种细胞均无明显的异倍体和四倍体峰，G0/G1期的峰宽比值(Co-efficiency of variation,CV)<9％，表明两种细胞具有相似的生长周期，但S期的永生化细胞数显著多于原代细胞。

[0071] (4)表面标志鉴定：选择原代和第40代永生化成纤维细胞以及猪肾PK-15细胞，按照RNAiso Plus试剂盒说明书提取细胞RNA，按照Reverse Transcriptase M-MLV说明书进行反转录。根据泛细胞表面标志猪CD29基因序列(GenBank：NM_213968.1)设计1对引物：

[0072] 正向引物：5-TTGGCTGGAGGAATGTTACAC-3(SEQ ID NO.13)；

[0073] 反向引物：5-TCACCCCATTTTTGCAGTAAG-3(SEQ ID NO.14).

[0074] 根据间充质细胞特异表面标志猪波形蛋白基因序列(GenBank：AK400847.1)设计1对引物：

[0075] 正向引物：5-CGCCAGCAGTATGAGAGTGT-3(SEQ ID NO.15)；

[0076] 反向引物：5-AGCAGGTCTTGGTATTCACGA-3(SEQ ID NO.16).

[0077] 根据上皮细胞表面标志角蛋白18(CK18)基因序列(GenBank：EU131884.1)设计1对引物：

[0078] 正向引物：5-CGTCTTGCTGCTGATGACTTC-3(SEQ ID NO.17)；

[0079] 反向引物：5-ACTGTGAGGTGACCACTGAGG-3(SEQ ID NO.18).

[0080] 分别以上述反转录产物为模板，按照LA TaqTM polymerase说明书进行PCR扩增。结果显示：上述三种细胞均为CD29表达阳性，原代和永生化猪成纤维细胞为波形蛋白表达阳性，CK18表达阴性；而猪肾PK-15细胞为CK18表达阳性，波形蛋白表达阴性(图3)。这些结果表明猪永生化成纤维细胞保持原代成纤维细胞的特征性标志。

[0081] (6)TERT表达检测：分别取第0、3、5、8、10代原代和第0、10、20、30、40代永生化成纤维细胞，按照RNAiso Plus试剂盒说明书提取细胞RNA，按照Reverse Transcriptase M-MLV说明书进行反转录，根据猪TERT基因序列(GenBank:NM_001244300)设计1对引物：

[0082] 正向引物：5-AGACGCTGTTTGCTGTGCTG-3(SEQ ID NO.19)；

[0083] 反向引物：5-CCGGATGACGTGGTTTCG-3(SEQ ID NO.20)。

[0084] 分别以上述反转录产物为模板，按照LA TaqTM polymerase说明书进行PCR扩增。结果显示：原代成纤维细胞在传至第8代时已不表达TERT，而永生化细胞在第0～40代期间TERT表达保持稳定。

[0085] (7)端粒酶活性检测：分别取第0、3、5、8、10代原代和第0、10、20、30、40代永生化猪成纤维细胞，按照猪端粒酶(TE)ELISA试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)说明书测定端粒酶活性，结果显示：猪原代成纤维细胞在传至第8代时已测不到端粒酶活性，而第10～40代永生化细胞的端粒酶活性保持稳定(图4)。

[0086] (8)肿瘤形成力测定：选择原代和传40代永生化成纤维细胞，设小鼠骨髓瘤SP/20细胞为对照，按照文献(Kakuguchi W,Kitamura T,Kuroshima T,Ishikawa M,Kitagawa Y,Totsuka Y,Shindoh M,Higashino F.HuR knockdown changes the oncogenic potential of oral cancer cells.Mol Cancer Res，2010，8(4):520-528)进行软琼脂克隆形成试验。结果显示：原代和第40代永生化成纤维细胞在软琼脂中培养两周不能形成细胞克隆，而小鼠骨髓瘤SP/20细胞培养6天即可见小的细胞集落，培养10天后形成较大的细胞集落，表明猪成纤维永生化细胞保持原代细胞的接触依赖性特点，不具有癌细胞的集落形成能力。