一种同时测定半夏提取物中尿苷、鸟苷和腺苷含量的超高效液相色谱方法转让专利
申请号 : CN201310013570.X
文献号 : CN103926332B
文献日 : 2016-02-03
发明人 : 张景勍 , 何丹 , 杨林
申请人 : 重庆医科大学
摘要 :
本发明属于中药成分分析测定技术领域。本研究以UPLC法测定半夏药材及饮片提取物中尿苷、鸟苷和腺苷含量的方法。色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，2.1×50mm)，流动相为水-甲醇不同比例梯度洗脱，柱温30℃，流速0.5mL·min-1，检测波长为254nm。尿苷、鸟苷和腺苷在适用浓度范围内线性关系良好。该方法准确、快速、可靠，能有效地同时测定半夏提取物中尿苷、鸟苷和腺苷的含量。
权利要求 :
1.一种同时测定半夏提取物中尿苷、鸟苷和腺苷含量的超高效液相色谱法，其特征在于：所用的色谱柱为ACQUITYUPLC BEH C18，色谱柱规格为1.7μm，2.1×50mm，流动相为水-甲醇梯度洗脱，时间分别为0，1.1，2，3，4，7，8，8.5，11分钟时水和甲醇的质量百分比分别为100∶0，100∶0，98∶2，90∶10，85∶15，0∶100，0∶100，100∶0，100∶0，检-1测波长254nm，流速0.5mL·min ，进样量5μL，理论塔板数按尿苷峰计算不低于2000，在此色谱条件下，尿苷出峰时间为0.966分钟，鸟苷的出峰时间为2.093分钟，腺苷的出峰时间为3.338分钟，且各成分间分离度大于1.5；
对照品储备液的制备：精密称取尿苷对照品20.33mg，加水溶解并稀释后，得尿苷浓度-1为20.33μg·mL 的对照品溶液，精密称取鸟苷对照品10.98mg，加水溶解并稀释后，得鸟苷-1浓度为10.98μg·mL 的对照品溶液，精密称取腺苷对照品10.06mg，加水溶解并稀释后，-1得腺苷浓度为2.012μg·mL 的对照品溶液，精密吸取尿苷对照储备液5mL、鸟苷对照储备液5mL和腺苷对照品溶液5mL，置50mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液；
供试品溶液的制备：半夏药材80g粉碎成粗粉，另加干姜6.8g，粉碎成粗粉，加水6倍量，混匀，压入隔膜压滤机中，55℃加压循环提取二次，每次30分钟，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.10～1.20，加入2倍量乙醇使沉淀，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至40mL； 每mL提取液相当于原药材2g，精密吸取该浓缩液1mL于25mL容量瓶中，加水稀释定容，
0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得供试品溶液；
半夏药材含量测定：取供试品溶液，按上述的色谱条件测定，用外标法以峰面积计算。
说明书 :
一种同时测定半夏提取物中尿苷、鸟苷和腺苷含量的超高
效液相色谱方法
技术领域
[0001] 本发明属于医药领域，涉及半夏药材及饮片提取物中同时测定尿苷、鸟苷和腺苷的分析技术。
背景技术
[0002] 半夏为天南星科植物半夏Pinelia ternate(thumb.)Breit.的干燥块茎，具有燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结之功效，临床应用非常的广泛。半夏含有多种化学成分，主要包括核苷类、有机酸类、生物碱类等。其中核苷类成分是生物细胞维持生命活动的基本组成元素，具有抗肿瘤、抗病毒、基因治疗等多种生物活性，是半夏药材及饮片中含有的很重要有效成分，含量较高的有尿苷、鸟苷和腺苷。据文献报道，国内外均有学者以核苷类成分为指标对半夏的水溶性成分的含量进行检测，且作为判别半夏药材及饮片质量优劣的重要依据。目前报道的对半夏药材及饮片核苷类成分的测定均采用HPLC法，该方法耗时长，分离效果不佳；且《中国药典》2010版中半夏药材的质量控制是采取电位滴定法对醇提取物中有机总酸进行测定。而对水提取物的质量控制还没有明确规定，由于核苷的药理活性明确，在半夏药材中含量也较高，因此建立核苷类成分的测定方法对于半夏药材及饮片质量控制也非常重要，本发明可同时测定半夏药材及饮片中的三种核苷，可为控制半夏药材及饮片质量提供参考依据。
发明内容
[0003] 本发明采用超高效液相色谱法(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC)对半夏提取物中的三种核苷类成分同时进行测定。本专利所指的半夏提取物可以是半夏药材或饮片提取物。本发明所述的同时测定半夏提取物中三种核苷类成分的UPLC方法高效、快速，重复性和精密度良好，可为半夏药材及饮片的质量控制提供依据。
[0004] 本发明所提供的技术方案可以是：
[0005] 色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，2.1×50mm)；柱温：30℃；流动相为水-甲醇梯度洗脱(时间分别为0，1.1，2，3，4，7，8，8.5，11分钟时水和甲醇的质量百分比分别为100∶0，100∶0，98∶2，90∶10，85∶15，0∶100，0∶100，100∶0；100∶0)；-1
检测波长254nm；流速0.5mL·min ；进样量5μL，理论塔板数按尿苷峰计算不低于2000。
在此色谱条件下，尿苷出峰时间为0.966分钟，鸟苷的出峰时间为2.093分钟，腺苷的出峰时间为3.338分钟。且各成分间分离度大于1.5。
检测波长254nm；流速0.5mL·min ；进样量5μL，理论塔板数按尿苷峰计算不低于2000。
在此色谱条件下，尿苷出峰时间为0.966分钟，鸟苷的出峰时间为2.093分钟，腺苷的出峰时间为3.338分钟。且各成分间分离度大于1.5。
[0006] 对照品储备液的制备：精密称取尿苷对照品20.33mg，加水溶解并稀释后，得尿苷-1浓度为20.33μg·mL 对照品溶液。精密称取鸟苷对照品10.98mg，加水溶解并稀释后，得-1
尿苷浓度为10.98μg·mL 对照品溶液。精密称取腺苷对照品10.06mg，加水溶解并稀释-1
后，得腺苷浓度为2.012μg·mL 对照品溶液。精密吸取尿苷对照储备液5ml、鸟苷对照储备液5ml和腺苷对照品溶液5ml，置50mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液。
尿苷浓度为10.98μg·mL 对照品溶液。精密称取腺苷对照品10.06mg，加水溶解并稀释-1
后，得腺苷浓度为2.012μg·mL 对照品溶液。精密吸取尿苷对照储备液5ml、鸟苷对照储备液5ml和腺苷对照品溶液5ml，置50mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液。
[0007] 供试品溶液的制备(以半夏药材为例)：半夏药材80g粉碎成粗粉，另加干姜6.8g，粉碎成粗粉，加水6倍量，混匀，压入隔膜压滤机中，55℃加压循环提取二次，每次30分钟，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.10～1.20(50℃)，加入2倍量乙醇使沉淀，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至40ml。每ml提取液相当于原药材2g。精密吸取该浓缩液1ml于
25ml容量瓶中，加水稀释定容，0.22μm微孔滤膜滤过取续滤液即得供试品溶液。
25ml容量瓶中，加水稀释定容，0.22μm微孔滤膜滤过取续滤液即得供试品溶液。
[0008] 线性关系考察：精密量取混合对照品溶液1，2，3，5，8，10mL，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得系列混合对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件测定，以峰面积Y对-1浓度X(μg·mL )进行线性回归。尿苷的回归方程为：Y＝16788X-3556(r＝0.9999)；鸟苷的回归方程为：Y＝25378X-325(r＝0.9999)；腺苷的回归方程为：Y＝30800X-59(r＝-1
0.9999)。结果表明，尿苷浓度在2.033～20.33μg·mL 范围内与峰面积呈良好的线性关-1
系；鸟苷浓度在1.098～10.98μg·mL 范围内与峰面积呈良好的线性关系；腺苷浓度在-1
0.2012～2.012μg·mL 范围内与峰面积呈良好的线性关系。
0.9999)。结果表明，尿苷浓度在2.033～20.33μg·mL 范围内与峰面积呈良好的线性关-1
系；鸟苷浓度在1.098～10.98μg·mL 范围内与峰面积呈良好的线性关系；腺苷浓度在-1
0.2012～2.012μg·mL 范围内与峰面积呈良好的线性关系。
[0009] 精密度试验：取混合对照品溶液，按“2.1”项下方法连续进样6次，测定峰面积。结果尿苷、鸟苷和腺苷的RSD分别为0.32％、0.33％和0.34％。符合精密度实验要求。
[0010] 稳定性试验：取混合对照品溶液，室温下放置0，1，2，4，6，8小时，按“2.1”项下色谱条件分别进样5μL测定峰面积。结果峰面积基本不变，尿苷、鸟苷和腺苷的RSD分别为0.32％、0.31％和0.33％，表明溶液在8小时内基本稳定。
[0011] 重复性实验：按供试品配制方法平行配制6份，按“2.1”项下方法进样分析，按外标法以峰面积计算含量，尿苷、鸟苷和腺苷的平均含量分别为0.016％(g/g)、0.011％(g/g)和0.001％(g/g)，RSD分别为0.88％、1.01％和0.93％。
[0012] 加样回收率试验：取已测知含量的半夏提取物，分别精密量取5ml，共27份，置10mL量瓶中，分别精密加入提取物中尿苷、鸟苷和腺苷含量的80％、100％和120％的对照储备液，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，按上述色谱条件进样5μL，按外标法计算回收率。结果尿苷、鸟苷和腺苷的平均回收率分别为98.65％、98.21％和98.54％，RSD分别为2.12％、2.32％和1.91％。
[0013] 半夏药材含量测定：取供试品溶液，按上述的色谱条件测定，用外标法以峰面积计算，结果尿苷、鸟苷和腺苷的含量分别为0.016％(g/g)、0.011％(g/g)和0.001％(g/g)，RSD分别为0.88％、1.01％和0.93％。
[0014] 超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography)，采用小粒径填料色谱柱(小于2μm)和超高压系统(大于105kPa)，可显著改善色谱峰的分离度和检测灵敏度，同时大大缩短分析周期，特别适用于微量复杂混合物的分离和高通量研究，全面提升液相色谱的速度、灵敏度和分离度。目前国内未见采用UPLC法对半夏药材及饮片中核苷类成分测定的报道。从本文的研究结果可知，采用UPLC法测定半夏提取物中的核苷类成分快速，准确，分离效果好。
[0015] 《中国药典》2010版中半夏药材的质量控制是采取电位滴定法对醇提取物中有机总酸进行测定。而对水提取物的质量控制还没有明确规定，由于核苷的药理活性明确，在半夏药材和饮片中含量也较高，因此建立核苷类成分的测定方法对于半夏药材和饮片质量控制也非常重要，本文同时测定了半夏药材和饮片提取物中的三种核苷，可为此提供参考依据。
附图说明
[0016] 附图是实施例1中半夏提取物的UPLC色谱图。a尿苷、鸟苷和腺苷的对照品混合溶液；b半夏提取物；1尿苷，2鸟苷，3腺苷。
具体实施方式
[0017] 为了进一步说明本发明及其优点，给出了下列特定的实施例，应理解这些实施例仅有于具体说明而不是作为本发明范围的限制。
[0018] 实施例1：
[0019] 供试品溶液的制备：半夏药材80g粉碎成粗粉，另加干姜6.8g，粉碎成粗粉，加水6倍量，混匀，压入隔膜压滤机中，55℃加压循环提取二次，每次30分钟，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.10～1.20(50℃)，加入2倍量乙醇使沉淀，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至
40ml。每ml提取液相当于原药材2g。精密吸取该浓缩液1ml于25ml容量瓶中，加水稀释定容，0.22μm微孔滤膜滤过取续滤液即得供试品溶液。
40ml。每ml提取液相当于原药材2g。精密吸取该浓缩液1ml于25ml容量瓶中，加水稀释定容，0.22μm微孔滤膜滤过取续滤液即得供试品溶液。
[0020] 半夏药材中三种核苷类成分的含量测定：取供试品溶液，按上述的色谱条件(色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，2.1×50mm)；柱温：30℃；流动相为水-甲醇梯度洗脱(时间分别为0，1.1，2，3，4，7，8，8.5，11分钟时水和甲醇的质量百分比分别为100∶0，100∶0，98∶2，90∶10，85∶15，0∶100，0∶100，100∶0；100∶0)；检测波长254nm；
-1
流速0.5mL·min ；进样量5μL)测定，用外标法以峰面积计算，结果尿苷、鸟苷和腺苷的含量分别为0.016％(g/g)、0.011％(g/g)和0.001％(g/g)，RSD分别为0.88％、1.01％和
0.93％。
-1
流速0.5mL·min ；进样量5μL)测定，用外标法以峰面积计算，结果尿苷、鸟苷和腺苷的含量分别为0.016％(g/g)、0.011％(g/g)和0.001％(g/g)，RSD分别为0.88％、1.01％和
0.93％。
[0021] 实施例2：
[0022] 供试品溶液的制备：半夏饮片160g粉碎成粗粉，另加干姜13.6g，粉碎成粗粉，加水6倍量，混匀，压入隔膜压滤机中，45℃加压循环提取二次，每次30分钟，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.10～1.20(50℃)，加入2.5倍量乙醇使沉淀，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至160ml。每ml提取液相当于原药材1g。精密吸取该浓缩液1ml于25ml容量瓶中，加水稀释定容，0.22μm微孔滤膜滤过取续滤液即得供试品溶液。
[0023] 半夏饮片含量测定：取供试品溶液，按上述的色谱条件(色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，2.1×50mm)；柱温：30℃；流动相为水-甲醇梯度洗脱(时间分别为0，1.1，2，3，4，7，8，8.5，11分钟时水和甲醇的质量百分比分别为100∶0，100∶0，98∶2，-1
90∶10，85∶15，0∶100，0∶100，100∶0；100∶0)；检测波长254nm；流速0.5mL·min ；
进样量5μL)测定，用外标法以峰面积计算，结果尿苷、鸟苷和腺苷的含量分别为0.013％(g/g)、0.012％(g/g)和0.0013％(g/g)，RSD分别为0.68％、0.91％和0.95％。
90∶10，85∶15，0∶100，0∶100，100∶0；100∶0)；检测波长254nm；流速0.5mL·min ；
进样量5μL)测定，用外标法以峰面积计算，结果尿苷、鸟苷和腺苷的含量分别为0.013％(g/g)、0.012％(g/g)和0.0013％(g/g)，RSD分别为0.68％、0.91％和0.95％。