长效促黄体激素(LH)化合物转让专利
申请号 : CN201280045264.8
文献号 : CN103930134B
文献日 : 2016-12-21
发明人 : 彼得·诺德基尔德 , 斯文德·林登伯格 , 克劳斯·伊丁·安德森 , 金姆·维尔博尔·安德森
申请人 : 阿茨生物股份有限公司
摘要 :
本发明涉及长效生物学活性促黄体激素(LH)化合物，其包含连接至药学上可接受的分子的LH激动剂，与按同LH化合物相同的方式施用的LH激动剂的体内血浆半衰期相比，所述药学上可接受的分子提供大幅度增加的LH激动剂或LH化合物的体内血浆半衰期。本发明涉及用于受控的卵巢刺激的方法，其可以与诸如体外受精、胞质内精子注射、子宫内人工授精和体外成熟的辅助生育技术联合使用。在其它方面，本发明涉及用于诱导卵泡生成的方法以及对黄体提供黄体支持的方法。
权利要求 :
1.一种长效生物学活性促黄体激素(LH)化合物，选自、由SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 26构成的产品2、由SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 28构成的产品3、由SEQ ID NO 9和SEQ ID NO
27构成的产品4、由SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 29构成的产品5、由SEQ ID NO 4和SEQ ID NO
26构成的产品7、由SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 30构成的产品8、由SEQ ID NO 4和SEQ ID NO
27构成的产品9、由SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 31构成的产品10。
2.根据权利要求1所述的LH化合物，用于促进哺乳动物受试者的生育能力。
3.根据权利要求1所述的LH化合物，在辅助生育治疗技术中使用，用于促进哺乳动物受试者的生育能力。
4.根据权利要求1所述的LH化合物，在用于雌性哺乳动物的辅助生育治疗方法中使用，其中在卵泡阶段期间按一次、两次、三次或四次剂量施用所述LH化合物，所述剂量足以支持卵泡发育。
5.根据权利要求4所述的LH化合物，其中以单次团注施用所述LH化合物。
6.根据权利要求5所述的LH化合物，其中所述剂量也足以提供黄体支持。
7.根据权利要求1所述的LH化合物，在用于雌性哺乳动物的辅助生育治疗方法中使用，其中在黄体阶段期间按一次、两次、三次或四次剂量施用所述LH化合物，至少直到排卵后2周。
8.根据权利要求7所述的LH化合物，其中以单次团注施用所述LH化合物。
9.根据权利要求1所述的LH化合物，在用于雌性哺乳动物的辅助生育治疗方法中使用，其中在妊娠阶段期间按一次、两次、三次或四次剂量施用所述LH化合物，至少直到排卵后2周。
10.根据权利要求9所述的LH化合物，其中以单次团注施用所述LH化合物。
11.根据权利要求1所述的LH化合物，在用于治疗雌性哺乳动物反复性流产的方法中使用，其中在早期妊娠期间按一次、两次、三次或四次或者更多次剂量施用所述LH化合物，直到受孕后12周。
12.根据权利要求11所述的LH化合物，其中以单次团注施用所述LH化合物。
13.根据权利要求1所述的LH化合物，在用于增加孕酮产生和优化成功怀孕机会的方法中使用，其中在妊娠的前12周期间按一次、两次、三次或四次或者更多次剂量施用所述LH化合物。
14.根据权利要求13所述的LH化合物，其中以单次团注施用所述LH化合物。
15.根据权利要求7-14中任一项所述的LH化合物，其中在排卵后首次施用所述LH化合物。
16.根据权利要求1所述的LH化合物，在用于雌性哺乳动物的辅助生育治疗方法中使用，其中就排卵诱导按一次或两次剂量施用所述LH化合物。
17.根据权利要求16所述的LH化合物，其中以单次团注施用所述LH化合物。
18.根据权利要求4-14和16-17中任一项所述的LH化合物，其中将GnRH激动剂用于排卵引发。
19.根据权利要求4-14和16-17中任一项所述的LH化合物，其中将hCG用于排卵引发。
20.根据权利要求1所述的LH化合物，用于促进生育能力或治疗促性腺激素分泌不足的性腺低能雄性哺乳动物受试者的不育症。
21.根据权利要求1所述的LH化合物，用于促进生育能力或治疗患有隐睾症的年轻或年少雄性哺乳动物受试者的不育症。
22.一种药物组合物，包含权利要求1所述的LH化合物。
23.根据权利要求22所述的药物组合物，用于注射。
24.根据权利要求22所述的药物组合物，用于皮下注射。
说明书 :
长效促黄体激素(LH)化合物
技术领域
[0001] 本发明涉及包含连接至药学上可接受的分子的LH激动剂的长效生物学活性促黄体激素(LH)化合物，以及涉及制备和使用这种LH化合物的方法。这些LH化合物具有延长的作用特性，并且适用于辅助生育技术程序，如促进生育或治疗不育症，以及用于促性腺激素分泌不足的性腺低能男性和患有隐睾症的男孩。修饰的LH具有延长的作用特性，并且适用于与促卵泡激素(FSH)组合，用于诱导无排卵妇女的卵泡发育，或者用于在哺乳动物雌性受试者的月经周期的卵泡阶段诱导受控的卵巢刺激。此外，本发明涉及用于受控的卵巢刺激的方法，其可以与诸如体外受精(IVF)、胞质内精子注射(ICSI)、子宫内人工授精(IUI)、体外成熟(IVM)和诱导排卵的辅助生育技术联合使用。在其它方面，本发明涉及用于诱导卵泡生成的方法以及对黄体提供黄体和妊娠支持的方法。
背景技术
[0002] 辅助生育技术(ART)程序通常需要用外源促性腺激素治疗以刺激卵泡的生长和成熟。当使用促性腺激素治疗无排卵女性时，目标是在诱导排卵之前当单个优势的卵泡成熟时复制正常的月经周期。相比之下，对于经受体外受精(IVF)的妇女，采用受控的卵巢刺激(COS)来刺激若干卵泡的生长和成熟，产生多个卵母细胞，然后将其重新取之用于IVF程序。
[0003] 与保护多卵泡发育的ART、COS有关的是，有必要获取最佳可能的机会使患者怀孕。为获得多卵泡生长，FSH的循环水平需超过引起响应卵泡生长的时间长于自然的三到四天时间的生理阈值水平。这是通过施用外源性FSH或通过控制垂体腺以分泌增强量的FSH实现的，并且以正确方式进行的COS可很容易地导致收获过多用于体外受精(IVF)的成熟卵母细胞。
[0004] 除了刺激卵泡生长外，FSH的一个重要功能就是刺激颗粒细胞上的LH-受体的发育。LH-受体结构性地表达于直接包围卵泡的卵泡膜细胞上，并且保障生产-除其它物质外-雄激素(即，雄烯二酮和睾酮)，用于在颗粒细胞层中转化成雌激素，但LH-受体在卵泡的颗粒细胞层中也具有重要的功能。目前尚未精确地知道在卵泡发育的何时LH-受体在颗粒细胞上得到表达。
[0005] 在正常的月经周期中，LH-受体仅由垂体释放的LH活性激活，但hCG(本质上是一种妊娠相关蛋白)也可结合并刺激LH-受体。hCG具有比LH长的半衰期，并且通常认为hCG的累积体内活性(来自安瓿中的等剂量LH和hCG)比LH高6至8倍(Stockman PGW et al.Fertil Steril 1993；60:175,Giudice E et al.J Clin Res 2001；4:27)。
[0006] COS的一些制剂仅含有FSH，而其它的含有FSH和LH样活性的组合(即，单独的LH或hCG或者LH和hCG的混合物)。例如，美诺孕含有尿源性FSH和LH样活性。在这些制剂中，体内受体介导的LH样生物活性的约95％来源于hCG，这是由于其半衰期较长(Van den Hooven H et al.RBM Online 2003；7:547)。也可以按纯形式得到重组LH，如对于COS所添加的(即，Luveris,Merck-Serono,Darmstadt,Germany)。然而，用于COS的hCG仅在含有FSH的产品存在时才可得到，并且不以要与COS相关使用的小剂量销售。
[0007] 在过去的十年中，使用与COS相关的LH活性的临床获益一直饱受争议。虽然许多元分析表明，与单独的纯FSH相比，增加LH样活性(这在本质上是经由hCG提供的)显示出带宝宝到家比率(baby-take-home rate)增加，这一问题还没有得到澄清(Al-lnany HG et al.,Reprod Biomed Online.2008；16:81-88,Westergaard LW,Cochrane Database Syst Rev 2003；1:CD003973.,Al-lnany HG et al.,Gynecol Endocrinol.2009；25:372-8)。使问题更复杂的是最频繁使用的含hCG的FSH(即美诺孕(含尿源性FSH、LH和hCG的高度纯化的hMG))与纯FSH(即重组FSH、保妊康或果纳芬)的FSH亚型分布之间的差异。然而，毫无疑问的是，LH水平可以降到增加LH样活性将有益的阈值限度以下，并且还存在阈值上限，高于此阈值上限则对治疗结果的负面影响就变得明显起来。因此LH样活性理想地应保持于治疗上狭窄的窗口中。
[0008] LH和CG是非常同源的。与LH相比，CG具有C-末端糖基化的扩展，已证明其对于CG的较长半衰期是重要的。人LH和hCG在序列上超过80％是相同的。虽然LH和hCG两者都结合并激活LH-受体，但两激素作为异激素的家族存在，它们的寡糖组成不同。各不同亚型以特定的方式影响受体，并且可引起可变的细胞响应(Burgon PG et al.,Endocrinology,1996；137:4827；Stanton PG et al.,Mol Cell Endocrinol.1996；125:133-141)，如不同的FSH亚型也已显示的那样(Barrios-de-Tomasi J,et al.Mol Cell Endocrinol.2002；186:
189-98,Yding Andersen C&Ezcurra D,Reproductive Biology Insights 2011:4,1-10)。
因此LH和hCG的更精微和细致调整的效果实际上可有所不同。在斯德哥尔摩ESHRE会议上给出的近期研究(2011年七月)表明，LH作用比hCG快得多，但在受体水平上总体效率较低(L.Casarini et al.,ESHRE Stockholm 2011-P312,Universita degli Studi di Modena,Italy)。hCG是继排卵后大约8天开始胚胎着床而分泌的妊娠相关蛋白。hCG能够刺激黄体保持活性并使之继续分泌孕酮及其它必要的物质，以便能够发生怀孕。尽管事实上在月经周期的那时刻LH水平是以可观量存在的，但这一水平不足以进一步刺激黄体，并且除非发生怀孕，否则黄体将会退化，将会发生月经出血，并且开始新的月经周期。虽然LH与hCG之间的这种差异已困扰科学界有些时间，但现已证明LH-受体(LH-R)在黄体阶段发生变化。功能性全长受体在存在hCG时保持其表达，而LH无法做到这点(Dickinson RE et al.,Endocrinology 150:2873-2881,2009)。这显示出在黄体阶段期间LH和hCG影响的差异，并且这可能表明LH和hCG也在月经周期的卵泡阶段在受体水平上施加不同的影响。
189-98,Yding Andersen C&Ezcurra D,Reproductive Biology Insights 2011:4,1-10)。
因此LH和hCG的更精微和细致调整的效果实际上可有所不同。在斯德哥尔摩ESHRE会议上给出的近期研究(2011年七月)表明，LH作用比hCG快得多，但在受体水平上总体效率较低(L.Casarini et al.,ESHRE Stockholm 2011-P312,Universita degli Studi di Modena,Italy)。hCG是继排卵后大约8天开始胚胎着床而分泌的妊娠相关蛋白。hCG能够刺激黄体保持活性并使之继续分泌孕酮及其它必要的物质，以便能够发生怀孕。尽管事实上在月经周期的那时刻LH水平是以可观量存在的，但这一水平不足以进一步刺激黄体，并且除非发生怀孕，否则黄体将会退化，将会发生月经出血，并且开始新的月经周期。虽然LH与hCG之间的这种差异已困扰科学界有些时间，但现已证明LH-受体(LH-R)在黄体阶段发生变化。功能性全长受体在存在hCG时保持其表达，而LH无法做到这点(Dickinson RE et al.,Endocrinology 150:2873-2881,2009)。这显示出在黄体阶段期间LH和hCG影响的差异，并且这可能表明LH和hCG也在月经周期的卵泡阶段在受体水平上施加不同的影响。
[0009] 现在公认的是，在FSH仅以与COS有关的小允许量存在的情况下，LH-R在人颗粒细胞上的表达足以驱动卵泡从大约10-12毫米的直径发育并且直到排卵为止(Blockheel et al.,2009；Filicori et a.,1999)。因此这种刺激类似于自然月经周期的条件，其中FSH的水平在卵泡阶段的后半期衰减，而LH的水平保持相当地恒定，并且已表明在促性腺激素的中期激增之前，LH对来自排卵期前卵泡的颗粒细胞中的雌二醇生产具有非常强的刺激作用。对卵泡最终成熟提供更自然的环境的能力有可能提供能力更好的卵母细胞以维持受精、胚胎形成和着床，并随后得到更好的生育结果。
[0010] COS的最严重的副作用之一是出现卵巢过度刺激综合征(OHSS)，这是一种潜在的危及生命的病症。最近的研究已表明，现在通过利用对最终卵泡成熟的激动剂引发有可能几乎完全地消除OHSS(Humaidan P,Kol S,Papanikolaou E；Copenhagen GnRH激动剂Triggering Workshop Group.GnRH激动剂for triggering of final oocyte maturation:time for a change of practice？Hum Reprod Update.2011；17:510-
24.PMID:21450755)，而且不损害生育结果。与GnRH拮抗剂下调的垂体功能相结合，GnRH激动剂的药团能够取代拮抗剂并引起促性腺激素释放的加剧，其然后被用作排卵诱导的信号。然而，继加剧后激动剂引起垂体下调，这将刺激信号移至卵巢。这些刺激的移除也减少了OHSS的危险。然而，这种下调对黄体的功能也有极大的负面影响，并且生育结果低得无法接受。因此为了维持黄体的一定功能，已经成功地尝试在获取卵母细胞之时及后来的黄体阶段中增加hCG的药团(1500IU)。或者每日注射LH可援助黄体阶段并提供良好的生育结果(当使用促性腺激素释放激素激动剂代替人绒膜促性腺激素用于排卵引发时，以重组促黄体激素补充黄体的新颖方法：概念研究的随机化前瞻性证明。Papanikolaou EG,Verpoest W,Fatemi H,Tarlatzis B,Devroey P,Tournaye H.Fertil Steril.2011 Mar 1；95(3):
1174-7.Epub 2010 Oct 27.PMID:20979997)。
24.PMID:21450755)，而且不损害生育结果。与GnRH拮抗剂下调的垂体功能相结合，GnRH激动剂的药团能够取代拮抗剂并引起促性腺激素释放的加剧，其然后被用作排卵诱导的信号。然而，继加剧后激动剂引起垂体下调，这将刺激信号移至卵巢。这些刺激的移除也减少了OHSS的危险。然而，这种下调对黄体的功能也有极大的负面影响，并且生育结果低得无法接受。因此为了维持黄体的一定功能，已经成功地尝试在获取卵母细胞之时及后来的黄体阶段中增加hCG的药团(1500IU)。或者每日注射LH可援助黄体阶段并提供良好的生育结果(当使用促性腺激素释放激素激动剂代替人绒膜促性腺激素用于排卵引发时，以重组促黄体激素补充黄体的新颖方法：概念研究的随机化前瞻性证明。Papanikolaou EG,Verpoest W,Fatemi H,Tarlatzis B,Devroey P,Tournaye H.Fertil Steril.2011 Mar 1；95(3):
1174-7.Epub 2010 Oct 27.PMID:20979997)。
[0011] 尽管近来在ART中有进展，但通过外源性促性腺激素的卵巢刺激并没有一律地取得成功，这部分是由于个体对促性腺激素治疗的反应不同。这种变化性使患者管理复杂化，并可导致多胎以及可能危及生命的并发症。
[0012] 促性腺激素形成结构上相关的糖蛋白激素家族。典型的成员包括绒膜促性腺激素(CG)、促卵泡激素(FSH；促卵泡素)、促黄体激素(LH；促黄体素)和促甲状腺激素(TSH；促甲状腺素)。FSH、LH和TSH存在于大多数脊椎动物物种中，并且由垂体合成和分泌。迄今仅在包括人在内的灵长类动物和马中发现CG，并且是由胎盘组织合成的。FSH和LH是对女性的卵泡成熟和黄体化及男性的睾丸成熟和精子生成必不可少的垂体激素。促性腺激素是在下丘脑的促性腺激素释放激素(GnRH)控制下由垂体腺分泌的。促卵泡激素(FSH)和促黄体激素(LH)是对卵泡成熟(卵泡发育)和黄体化必不可少的垂体激素。在自发月经周期的开始，卵泡募集(即，卵泡的早期生长)需要FSH，并且它也支持中期和晚期的卵泡发育。
[0013] 近些年来通过采用重组DNA技术已经可以得到促性腺激素的非常纯的制剂(参见例如Boime et al.,Seminars in Reproductive Endocrinology 10,45-50,1992:"Expression of recombinant human FSH,LH and CG in mammalian cells")。重组促性腺激素品质是稳定的，即具有可再现的生物化学和生物学性质。已经为所有的亚基制备了基因组和cDNA克隆，并且它们的一级结构已得到解析。此外，已经用人促性腺激素亚基基因转染了中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，并且这些细胞显示出能够分泌完整的二聚体(例如Keene et al(1989),J.Biol.Chem.,264,4769-4775；Van Wezenbeek et al(1990),in From clone to Clinic(eds Crommelin D.J.A.and Schellekens H.),245-251)。已被证明例如重组FSH的生物化学和生物学特性与天然FSH的几乎完全相同(Mannaerts et al(1991),Endocrinology,129,2623-2630)。此外，使用重组FSH在受控的卵巢超数排卵后实现了怀孕(Germond et al(1992),Lancet,339,1170；Devroey et al(1992),Lancet,339,1170-1171)。
[0014] 也可以由天然来源分离促性腺激素，例如由人尿分离，或者可以按(生物)合成方式制备促性腺激素，参见通过重组DNA技术的方式。
[0015] 在临床实践中广泛使用促性腺激素以治疗患有WHO II组和WHO I组无排卵的妇女(World Health Organisation Technical Report 514,(1973))。按惯例，通过以75-150IU/天的剂量施用hMG(人绝经期促性腺激素)或u-hFSH(人尿促卵泡激素)来诱导卵泡发育。几天(通常五天)后按75IU的布幅将此剂量提高。罕有超过450IU/天的。当有至少一个卵泡具有至少18mm的平均直径且不超过两个卵泡具有至少16mm的平均直径时，施用高剂量(例如5000IU)的hCG(人绒毛膜促性腺激素)以诱导排卵。这种“常规方案”已成功使用超过
20年。然而它也带有一定的危险性，主要是对于患有多囊性卵巢或多囊性卵巢综合症(PCOS)的患者。
20年。然而它也带有一定的危险性，主要是对于患有多囊性卵巢或多囊性卵巢综合症(PCOS)的患者。
[0016] 这些危险包括发生OHSS以及相对高发病率的多胎妊娠(Schenker et al,Fertil.Steril.35:105-123(1981))。虽然大多数多胎妊娠都是双胞胎，但在英国，诱导排卵促成三分之一的高级别多胎分娩(Levene et al,Br.J Obstet.Gynacol.99:607-613(1992))。
[0017] 通过超声(US)在治疗期间仔细监测并评估血清雌二醇(E2)已减少了这些危险，但尚不能够在所有患者中防止其发生。这些问题与获得单一优势卵泡的生长的难度有直接关系，导致非生理性多卵泡发育。
[0018] 治疗性施用FSH以诱导无排卵妇女和经历COS的妇女中的卵泡发育。在传统的排卵刺激方法中，在整个治疗过程中施用FSH，直到在临取得卵母细胞前不久。这种通过FSH的持续刺激通常会引起多卵泡发育，并可与hCG外源药团相结合而诱导排卵，导致有可能致命的病状OHSS。据现在的估计，COS对原本健康的患者来说，每100,000个刺激周期有大约3个是致命性的。降低FSH的剂量可减少OHSS的危险，但低FSH剂量产生的卵泡数量不足，并因此会降低辅助生育成功的机会。
[0019] LH在正常月经周期的所有阶段均起作用。LH刺激卵泡的泡膜细胞以产生雄激素底物，后者通过颗粒细胞中的芳香酶系统被转化成雌激素。在卵泡成熟的晚期期间，排卵前大约5至7天，大卵泡开始表达颗粒细胞中的LH受体，这使得那些卵泡响应LH以持续成熟和发育。Hillier et al.,Mol.Cell Endocrinol.100:51(1994)，Campbell et al.J.Reprod.Fertil.117:244(1999)。接下来，LH的中期激增引发正常月经周期中的卵泡成熟和排卵的最后阶段。排卵在中期LH激增后24至48小时之内。最后，在月经周期的第二部分，即黄体阶段，LH在卵巢为着床和妊娠准备子宫时刺激雌激素和孕酮在其黄体中的产生。
[0020] 在卵巢刺激方案中，hCG可充当LH活性的来源，因为hCG和LH通过相同的受体起作用。Filicori et al.Human Reprod.17:2009(2002a)；Martin et al.,Fertil.Steril.76:0-49(2002)。相对于LH来说，hCG具有较长的半衰期，并且因此在体内比LH更有效，虽然文献倾向于把hCG和LH作为可互换的处理。事实上，科学文献一般不提及确定天然得到的促性腺激素制剂中的LH活性的来源。
[0021] 文献公开了在整个排卵刺激过程中采用LH活性或低剂量hCG与FSH相结合，但缺少有关LH活性补充的有效量和时间安排的指导。例如，Martin et al,Fertil.Steril.76:O-49(2002)的摘要公开了在排卵刺激期间每天施用2.5μg重组hCG(将血清hCG水平维持在1-
3mIU/mL)。Gordon et al.公开了施用具有0、1、25和75IU LH活性的75IU FSH。Human Reprod.12(Suppl.1):52(1997a)；ibid.:53(1997b)。
3mIU/mL)。Gordon et al.公开了施用具有0、1、25和75IU LH活性的75IU FSH。Human Reprod.12(Suppl.1):52(1997a)；ibid.:53(1997b)。
[0022] 发表的研究报告公开了在整个刺激过程中按FSH与LH的比例为150:0、150:37.5、150:75和150:150施用LH活性。Filicori et al.(2002a)。进一步地，文献记载了以50IU hCG/天补充FSH刺激(Filicori et al.,J.Clin.Endocrinol.&Metabol.84:2659(1999))，以及施用7天150IU FSH、接着以FSH与hCG的比例为150:0、50:50、25:100和0:200治疗的方案(ibid.87:1156(2002c)和US20080108571)。
[0023] 在过去的10年中，为了进一步减少促性腺激素治疗并发症的发病率，已经设计出新的方案(“长期低剂量方案”)并进行了测试(Seibel et al,Int.J Fertil.,29:338-339(1984)；Buvat et al,Fertil.Steril.,52:553-559(1989)；Hamilton-Fairley et al,Human Reprod.6:1095-1099(1991)；Sagle et al,Fertil Steril.,55:56-60(1991)；Shoham et al,Fertil.Steril.,55:1051-1056(1991)；Meldrum,Fertil Steril.,55:
1039-1040(1991))。这一方案以低剂量的FSH或hMG(75IU/天)开始，并且在七天或优选14天的治疗前没有剂量调整。如果需要进行剂量调整，则通过仅37.5IU的增加步幅进行。此外，可仅在以给定的剂量治疗七天后实施每一后续的增加。这种长期低剂量方案的概念是要找到促进单一卵泡生成(unifolliculogenesis)所必需的FSH的阈值量。迄今已经发表了令人鼓舞的结果，表明这种方法减少了排卵前卵泡的平均数，平均排卵前E2水平和中间黄体阶段卵巢的尺寸。
1039-1040(1991))。这一方案以低剂量的FSH或hMG(75IU/天)开始，并且在七天或优选14天的治疗前没有剂量调整。如果需要进行剂量调整，则通过仅37.5IU的增加步幅进行。此外，可仅在以给定的剂量治疗七天后实施每一后续的增加。这种长期低剂量方案的概念是要找到促进单一卵泡生成(unifolliculogenesis)所必需的FSH的阈值量。迄今已经发表了令人鼓舞的结果，表明这种方法减少了排卵前卵泡的平均数，平均排卵前E2水平和中间黄体阶段卵巢的尺寸。
[0024] 然而，尽管采用了长期低剂量方案，但由于过度响应的原因(例如，在有超过3个卵泡平均直径为16mm或更大的情况下)，仍不得不取消一些治疗周期。此外，当与常规方案相比时，虽然多胎妊娠率有明显改善，但仍高于自发怀孕周期中的情况，即在诱导的排卵中为5-10％，相比之下在自发周期中为1.5％。这是由于仅在诱导周期的约三分之二至四分之三中获得单一排卵前卵泡的发育，并且当在hCG施用当天评估排卵前卵泡数时通常不考虑具有15mm或更小的平均直径的卵泡(Buvat et al,FertiL Steril.,52:553-559(1989)；
Hamilton-Fairley et al,Human Reprod.6:1095-1099(1991))。然而，并不清楚在hCG施用当天，平均直径为14至15mm或甚至更小的卵泡是否将会排卵并导致释放健康的可受精卵母细胞。因此，期望能够改进FSH诱导的卵泡发育治疗，其中能减少多胎妊娠率和周期取消率。
Hamilton-Fairley et al,Human Reprod.6:1095-1099(1991))。然而，并不清楚在hCG施用当天，平均直径为14至15mm或甚至更小的卵泡是否将会排卵并导致释放健康的可受精卵母细胞。因此，期望能够改进FSH诱导的卵泡发育治疗，其中能减少多胎妊娠率和周期取消率。
[0025] 窦状卵泡生长由FSH诱导。一些卵泡进入生长阶段，该生长阶段在达到排卵前状态的完全成熟阶段之前被退化和闭锁中断，这种现象在整个生命过程中一直持续着乃至达到绝经期(Hillier,Hum.Reprod.,9:181-191(1994))。在生长阶段期间，大多数卵泡可以自闭锁状态中解救出来，条件是其暴露于足够的FSH浓度。防止卵泡闭锁并促进其进一步生长所需的FSH水平被称为“FSH阈值”水平(Brown,Aus.NZJ Obstet.Gynecol.,18:47-55(1987)。FSH阈值水平随时间而变化，并且在给定的时间点，当前处于生长阶段的卵泡具有不同的FSH阈值水平。这就是“长期低剂量”方案所依据的基本原理。采用FSH剂量的渐进和谨慎的增加来寻找最少数量卵泡的阈值水平，并且有希望实现单排卵。
[0026] 已知LH还促成卵泡优势化和单排卵的现象。实际上，虽然在卵泡发育期间一些LH对于E2合成是必不可少的，但有证据表明，过度暴露于LH将引发卵泡闭锁并抑制颗粒细胞增殖。因此发育中的卵泡看起来对通过LH刺激具有限定的要求，超此限度则正常的卵泡发育就停止。这就是“LH高限”概念(Hillier,Hum.Reprod.,9:181-191(1994))。据信在给定的时间点，当前处于生长阶段的卵泡具有不同的LH高限水平。可认为较成熟的卵泡比较少成熟的卵泡对LH的闭锁作用更具抵抗力。
[0027] 已报道了两例WHO I组无排卵，是通过单独的FSH或采用递升方案的hMG治疗的(Glasier et al,Journal of Endocrinology,119A-159(1988))。“单独的FSH”周期具有比hMG周期数目多得多的成熟卵泡，这可能支持LH在次级卵泡的闭锁中的作用。后来发表了两项比较研究。在10位促性腺激素分泌不足的性腺低能妇女的第一项交叉研究中，就排卵前E2水平记录到显著的差异，但没有报告卵泡计数(Couzinet et al ,J.Clin.Endocrinol.Metab.66:552-556(1988))。9位促性腺激素分泌不足的性腺低能妇女的第二项交叉研究报告了在hCG施用的当天，平均直径超过16mm的卵泡的平均数为2.0(在hMG治疗周期中为0.7，在FSH治疗周期中为1.2(Shoham et al,FertiL Steril.,55:1051-
1056(1991))。没有较小卵泡数的资料。
1056(1991))。没有较小卵泡数的资料。
[0028] 最近以来，已经发表了对血清FSH、LH和E2浓度低到不可测量的单个患者施用150IU hFSH(人FSH)和75IU r-hLH(重组人LH)的结果(Hall et al,The Lancet,344(8918):334-335(1994))。与单独施用hFSH相比，施用r-hLH和r-hFSH导致E2水平升高，并且直径10mm或更大的卵泡的总数减少。然而，大卵泡的数目还保持着足够地高，意味着多胎妊娠率高得不可接受。
[0029] 进一步的研究比较了在宫内着床之前用FSH治疗以刺激多卵泡发育后对正常的排卵妇女施用r-hLH(剂量为300IU/天或750IU/天)和r-hFSH的效果(Sullivan et al,Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism,84,228-232,1999))。结果表明接受了LH的妇女血清E2水平升高，虽然没有测量卵泡数及卵泡尺寸，并且在接受750IU/天的LH的组中发生了多胎妊娠。
[0030] 文献记载了同时含有FSH和LH活性的其它组合物以及FSH与LH活性相结合的用途。例如，2000年11月16日公布的PCT申请WO 00/67778涉及使用LH或等量的hCG与FSH相结合以诱导无排卵妇女中的卵泡发育。更具体地，'778申请公开了按每天100至1500IU的剂量(第4页，第26-29行)和范围在1:1.5至1:20的FSH:LH比例(同上，第16-18行)施用LH或“其生物活性类似物”。
[0031] 美国专利5,929,028涉及含有一种或多种天然或重组促性腺激素(包括FSH、LH和hCG)的液体制剂。'028专利讨论天然来源的人绝经期促性腺激素(hMG)的组合物，其FSH和LH活性比为大约1:1，但没有提到不同于商业化hMG制剂的1:1比例的FSH与LH活性比。
[0032] 此外，还有同时含FSH和LH的商业化制剂。可得到含75IU FSH且具有75IU LH活性(普格纳、喜美康、Repronex和美诺孕)和75IU FSH且具有25或35IU LH活性(Normegon和Pergogreen)的人源性制剂。
[0033] 然而，传统的观点是，虽然尚不明确，但“过多的”LH水平导致卵泡闭锁、颗粒细胞增殖的抑制及过早的黄体化。一般地，参见Filicori,Fertil.Steril.79:253(2003)。虽然近期的工作表明情况不然，但在该领域中仍然存在着这样的概念，即LH活性水平必须在一定的范围内，而低于或高于“LH高限”的水平损害正常的卵泡发育。Shoham,Fertil.Steril.70:1170(2002)。
[0034] 总之，发表的证据表明，在排卵诱导期间以LH活性补充FSH可减少治疗的持续时间和用于实现适当卵泡发育的促性腺激素量。Filicori et al.(1999),(2002b)。另一方面，仍然存在着这样的信念，即“高”LH活性水平对卵泡发育有负面影响。
[0035] 尽管在COS方案中有诸多进展，但仍有必要作进一步的改进并消除OHSS的发生，提高后续的着床率并提高经受辅助生育治疗的女性的方便性以及提高安全性。
[0036] 这种信念已指导了常规的卵巢刺激规范，其涉及在整个受控的卵巢刺激过程中施用FSH。在卵泡发育的早期至中期阶段期间，外源性LH活性被认为是不必要的，并且甚至是有害的。因此，卵巢刺激的传统方式需要用单独的FSH治疗，通常按75-300IU/天。在这种传统的方案中，仅在卵泡达到一定的发育阶段后才施用LH活性以诱导排卵。只是近期才已经在整个治疗过程中施用LH活性，并且在这方面LH活性的最佳量和时间安排仍存在争议。
[0037] 为了使男孩发展正常的生育能力，两个睾丸均需位于体外在阴囊中处于较低的温度。如果一个或两个睾丸长时间地保持在体温下，则生育能力可能会受到损害，并且在成年生活中产生具备功能的精子细胞的能力可能受损。为了减少未降到阴囊的睾丸对生育能力的负面影响，通常是通过物理操作或者通过用使睾丸移到阴囊的hCG激素治疗将其移到阴囊。hCG通过刺激睾丸间质细胞产生雄激素来刺激睾丸类固醇激素的产生。还没有准确地了解雄激素水平增加引起睾丸移到阴囊的确切作用机理。
[0038] 在男孩中有至少一个未降到阴囊的睾丸的频率对于足月男婴为约3％，早产男婴为30％。然而，在生命的第一年期间，大多数在体内的睾丸会自己到达阴囊(大多数在三个月内)，使隐睾的真实发病率整体为1％左右。hCG的影响是有充分记载的，但由于患者年龄、治疗方案的差异以及可能包括伸缩性睾丸的原因，已报告的结果差别非常大，尚不清楚真实疗效。已经报告了许多不同的剂量方案，范围在一周两次给3-15剂(经5周10次注射是常见的)。最常见的方案之一规定小婴儿为250IU/剂，6岁或以下儿童为500IU/剂，而6岁以上个体为1000IU/剂。
[0039] 促性腺激素分泌不足的性腺低能男人没有能力进行促性腺激素LH和FSH的垂体释放。各种基因缺陷可引起下丘脑中的缺陷，导致促性腺激素释放激素(GnRH)的释放不足，这继而引起垂体减少FSH和LH的释放。一种这样的病状是所谓的卡尔曼综合症，其影响到大约1:10.000的男性和1:50.000的女性。除了影响生育能力外，对男人和妇女的主要健康问题是骨质疏松症。
[0040] 当LH的水平低时，男人的雄激素产生减少，他们往往会不育，并显示出男性特征减少。治疗集中在恢复不足的激素。对男性施用hCG或睾酮。许多不同的睾酮制剂可供使用。较广泛使用的睾酮制剂仅需以按月的间隔施用。然而，为诱导这些男人的精子产生和生育能力，需要随着施用hCG，因为经由循环到达睾丸的外源性施用的睾酮很少能达到足以导致精子产生的睾丸内水平。似乎更有效的是使用hCG以刺激足以诱发精子产生的睾丸雄激素产生，往往与FSH结合施用。由于从精子发生阶段的精子产生到完全成熟的精虫需要60至70天，这往往是一个漫长的过程，多次注射hCG以引发精子产生。
发明内容
[0041] 本发明人已经认识到，激动和激活哺乳动物中的LH受体并提供如下的哺乳动物CG或LH(例如人CG或人LH)的生物体组合物或浓度的修饰的哺乳动物CG或LH(例如人CG或人LH)
[0042] a)足以驱动窦状卵泡从直径约5-6mm(如从10mm)直到直径约30mm，其中成熟中的卵母细胞可完成成熟，以为减数分裂的恢复做好准备，
[0043] b)足以驱动雄性后代出生后约1年的早期少年及青春期雌性和雄性受试者的雄激素产生，
[0044] c)足以支持促性腺激素分泌不足的性腺低能雌性和雄性受试者的类固醇产生，[0045] d)足以维持哺乳动物受试者围排卵阶段、排卵阶段和排卵后阶段中的孕酮，目的是调节子宫内膜和子宫以允许哺乳动物胚泡的着床，
[0046] e)足以维持哺乳动物受试者围排卵阶段、排卵阶段和排卵后阶段中的孕酮，目的是为着床准备子宫内膜和子宫，
[0047] f)足以驱动促性腺激素分泌不足的性腺低能男人中的雄激素产生，目的是诱发精子产生并增加雄激素产生。
[0048] g)足以驱动患有隐睾症的男孩中的雄激素产生，目的是诱发睾丸对阴囊的重新定位。
[0049] h)足以驱动复孕妇女中的孕酮产生，目的是减少流产的危险。
[0050] 对改进ART的目前平台是重要的(除了b)。
[0051] 因此，在广泛的方面，本发明涉及一种长效生物学活性促黄体激素(LH)化合物，其包含连接至药学上可接受的分子的LH激动剂，与按同LH化合物相同的方式施用的LH激动剂的体内血浆半衰期相比，所述药学上可接受的分子提供大幅度增加的LH激动剂或LH化合物的体内血浆半衰期。
[0052] 在另一方面，本发明涉及一种长效生物学活性促黄体激素(LH)化合物，其包含接至药学上可接受的分子的LH激动剂，与内源性绒膜促性腺激素(CG)的体内血浆半衰期相比，所述药学上可接受的分子提供大幅度增加的LH激动剂或LH化合物的体内血浆半衰期。
[0053] 在进一步的方面中，本发明涉及一种长效生物学活性促黄体激素(LH)化合物，其包含连接至药学上可接受的分子的哺乳动物CG或其类似物或者哺乳动物LH或其类似物，所述药学上可接受的分子选自结合至哺乳动物新生儿Fc受体的分子、转铁蛋白和其中n是8至22的CH3(CH2)nCO-以及聚合物。
[0054] LH激动剂可来源于哺乳动物，并且可选自哺乳动物CG，如人CG，和马科动物CG，如马CG；或哺乳动物LH，如人LH、母牛LH、猪LH、马LH、绵羊LH、狗LH、猫LH和山羊LH。LH激动剂也可以是哺乳动物LH激动剂的类似物，并且通常类似物与LH激动剂(如绒膜促性腺激素或促黄体激素)的相应哺乳动物序列具有至少80％的同一性，如至少85％的同一性、90％的同一性、95％的同一性、98％的同一性或至少99％的同一性。
[0055] LH激动剂也可来源于非哺乳动物，并且可选自有机小分子、肽、多肽和蛋白质。
[0056] LH激动剂被连接至另一分子，优选药学上可接受的分子，并且正是这种修饰的化合物在本文中被称为LH化合物。LH激动剂可以按多种方式被连接至药学上可接受的分子，如现有技术文献中所述，如且不限于通过双官能连接子的化学偶联、通过将LH激动剂(如hCG或hLH)的N-末端或C-末端偶联至药学上可接受的分子(如白蛋白)的基因技术。特别地，可将白蛋白(例如人白蛋白)的N-末端偶联至hCG或hLH的α-链的C-末端或者hCG或hLH的β-链的C-末端，或者可将白蛋白(例如人白蛋白)的C-末端偶联至hCG或hLH的α-链的N-末端或者hCG或hLH的β-链的N-末端。可将连接子序列插在白蛋白与hCG或LH链之间。hCG和/或hLH中的两条链(即α和β链)可通过连接肽偶联在一起，从而产生一个多肽序列，其继而可被连接(如通过化学连接或基因连接)至药学上可接受的分子。
[0057] LH激动剂可通过稳定的连接子或较不稳定的连接子连接至药学上可接受的分子。若干连接子是本领域中已知的，包括双官能PEG分子(例如参见Paige et.al
Pharmaceutical Research,vol.12,no.12,1995)、可水解的连接子(Shechter et al Bioconjugate Chem.2005,16,913-920和International Journal of Peptide Research and Therapeutics,Vol.13,Nos.1-2,June 2007和WO2009095479)、PDPH和EMCH，参见例如WO2010092135。在其中LH激动剂(如hCG)与药学上可接受的分子的化学缀合(两个或更多个分子的连接)强烈地减少官能LH活性的特例中，可优选使用能释放官能LH激动剂的较不稳定的连接子。
Pharmaceutical Research,vol.12,no.12,1995)、可水解的连接子(Shechter et al Bioconjugate Chem.2005,16,913-920和International Journal of Peptide Research and Therapeutics,Vol.13,Nos.1-2,June 2007和WO2009095479)、PDPH和EMCH，参见例如WO2010092135。在其中LH激动剂(如hCG)与药学上可接受的分子的化学缀合(两个或更多个分子的连接)强烈地减少官能LH活性的特例中，可优选使用能释放官能LH激动剂的较不稳定的连接子。
[0058] LH激动剂可以被糖基化，在这种情况下连接至药学上可接受的分子可通过这种糖部分进行，或者可插入糖部分并用来建立LH激动剂与药学上可接受的分子之间的连接。
[0059] LH激动剂可以被连接至一种或多种药学上可接受的分子，或者一种药学上可接受的分子可以被连接至一种或多种LH激动剂，通常将LH激动剂连接至一种或两种药学上可接受的分子，优选一种药学上可接受的分子。比如，将一种hCG连接至一种白蛋白，例如人白蛋白或修饰的白蛋白。
[0060] 本发明的LH化合物进一步的优点是，药学上可接受的分子提供足以支持形成和维持黄体(Corpus Luteum/corpora lutea，CL)的LH激动剂或LH化合物的血清浓度。当在与促卵泡激素(FSH)治疗有关(优选在开始FSH治疗后的5-10天)的月经周期的卵泡阶段期间给予LH化合物注射时就获得这种优点。
[0061] 本发明的LH化合物再进一步的优点是，药学上可接受的分子提供一定浓度的LH激动剂或LH化合物以刺激由CL释放足够的孕酮。当在与FSH治疗有关(优选在开始FSH治疗后的5-10天)或与排卵诱导有关或与胚胎转移有关的月经周期的卵泡阶段期间或者有时在黄体或妊娠阶段注射LH化合物后就获得这种优点。
[0062] 本发明进一步的方面涉及一种药物组合物，其包含LH化合物和任选药学上可接受的载体或赋形剂。这种组合物可包含一种或多种LH化合物。
[0063] 本发明又进一步的方面涉及本发明的LH化合物，其用于哺乳动物受试者的不育症治疗，如辅助生育技术治疗，例如IVF或ICSI治疗，或睾丸的降下不良，或者用于在促性腺激素分泌不足的性腺低能症中增加类固醇产生的用途。通常，LH化合物用于促进哺乳动物受试者的生育能力。
[0064] 本发明还涉及治疗哺乳动物受试者不育症的方法，包括对有需要的哺乳动物施用本发明的LH化合物。
[0065] 此外，本发明涉及促进哺乳动物受试者生育能力的方法，包括对有需要的哺乳动物施用本发明的LH化合物。
[0066] 此外，本发明人已经意识到，包含连接至药学上可接受的分子的哺乳动物LH或其类似物的长效修饰的LH，例如连接至(例如融合至)白蛋白或者融合至哺乳动物抗体的Fc片段或哺乳动物抗体的Fc片段的变体或者缀合至酰化基团或PEG的人LH，其激动和激活哺乳动物中的LH受体，并提供哺乳动物LH或其类似物或者修饰的LH的体内血浆半衰期，其在哺乳动物中为2至48小时，通常为4至28小时，如6-8小时。据信在卵泡阶段中或作为黄体阶段支持给予的修饰的LH改善安全性、治疗结果和患者方便性。本发明具有指定的体内半衰期的这种长效修饰的哺乳动物LH特别适用于与FSH相结合。
[0067] 因此，本发明进一步的方面涉及一种药物组合物，其包含本发明修饰的LH和FSH或具有FSH活性的分子。药物组合物可以是一种同时包含修饰的LH和FSH或具有FSH活性的分子的组合物，或者可以是在分开的组合物中包含修饰的LH和FSH或具有FSH活性的分子的部件的试剂盒，其中可以同时、按顺序或分开施用这种组合物。
[0068] 本发明还涉及一种修饰的LH，其包含连接至药学上可接受的分子的哺乳动物LH或其类似物，所述药学上可接受的分子提供哺乳动物LH或其类似物或者修饰的LH的体内血浆半衰期，其在哺乳动物中为2至48小时，以与FSH或具有FSH活性的分子结合使用，用于同时、按顺序或分开使用以在哺乳动物雌性受试者的无排卵治疗中诱导卵泡发育，如少量卵泡生成(paucifolliculogenesis)或单一卵泡生成，或者在哺乳动物雌性受试者的月经周期的卵泡阶段中诱导COS。
[0069] 本发明还涉及在哺乳动物雌性受试者的无排卵治疗中诱导卵泡发育(如少量卵泡生成)或在哺乳动物雌性受试者的月经周期的卵泡阶段中诱导COS的方法，包括对有需要的哺乳动物施用有效量的修饰的LH，其包含连接至药学上可接受的分子的哺乳动物LH或其类似物，所述药学上可接受的分子提供哺乳动物LH或其类似物或者修饰的LH的体内血浆半衰期，其在哺乳动物中为2至48小时，以同时、按顺序或分开地与FSH或具有FSH活性的分子相结合。
[0070] 在进一步的方面中，本发明涉及在妊娠的前12周期间对患有反复性流产的妇女施用LH化合物，以便通过CL提高孕酮输出和提高儿童的分娩率。
[0071] 因此，在进一步的方面中，本发明涉及包含连接至药学上可接受的分子的哺乳动物LH或其类似物的修饰的LH，所述药学上可接受的分子提供哺乳动物LH或其类似物或者修饰的LH的体内血浆半衰期，其在哺乳动物中为2至48小时，通常为4至28小时，如6-8小时。如上所述，这种修饰的LH特别适用于与FSH治疗相结合。
[0072] 哺乳动物的LH可选自哺乳动物LH，如灵长类动物LH(例如猿或猴LH)、人LH和马LH。LH也可以是哺乳动物LH的类似物，并且通常类似物与LH的相应哺乳动物序列具有至少80％的同一性，如至少85％的同一性、90％的同一性、95％的同一性、98％的同一性或至少99％的同一性。
[0073] 哺乳动物LH被连接至另一分子，优选药学上可接受的分子，并且正是这种修饰的LH在本文中被称为修饰的LH。哺乳动物LH可以按多种方式被连接至药学上可接受的分子，如现有技术文献中所述，如且不限于通过双官能连接子的化学偶联、通过将LH(如hLH)的N-末端或C-末端偶联至药学上可接受的分子(如白蛋白)的基因技术。特别地，可将白蛋白(例如人白蛋白)的N-末端偶联至hLH的α-链的N-末端或hLH的β-链的C-末端。hLH中的两条链(即α和β链)可通过连接肽偶联在一起，从而产生一个多肽序列，继而可被连接(如通过化学连接或基因连接)至药学上可接受的分子。
[0074] 哺乳动物LH可通过稳定的连接子或较不稳定的连接子连接至药学上可接受的分子。若干连接子是本领域中已知的，包括双官能PEG分子(例如参见Paige et.al Pharmaceutical Research,vol.12,no.12,1995)、可水解的连接子(Shechter et al Bioconjugate Chem.2005,16,913-920和International Journal of Peptide Research and Therapeutics,Vol.13,Nos.1-2,June 2007和WO2009095479)、PDPH和EMCH，参见例如WO2010092135。在其中哺乳动物LH(如hLH)与药学上可接受的分子的化学缀合(两个或更多个分子的连接)强烈地减少官能LH活性的特例中，可优选使用能释放哺乳动物LH的较不稳定的连接子。
[0075] 哺乳动物LH可以被糖基化，在这种情况下连接至药学上可接受的分子可通过这种糖部分进行，或者可插入糖部分并用来建立LH激动剂与药学上可接受的分子之间的连接。
[0076] 哺乳动物LH可以被连接至一种或多种药学上可接受的分子，或者一种药学上可接受的分子可以被连接至一种或多种哺乳动物LH，通常将哺乳动物LH连接至一到五种(如一种或两种)药学上可接受的分子。比如，将一种hLH连接至一种白蛋白，例如人白蛋白或修饰的白蛋白。
[0077] 本发明进一步的方面涉及一种药物组合物，其包含本发明修饰的LH和任选药学上可接受的载体或赋形剂。这种组合物可包含一种或多种修饰的LH。
[0078] 本发明又进一步的方面提供在女性人类中进行辅助生育治疗的方法，所述方法包括
[0079] a.在月经周期的第1-3周期日通过施用FSH开始刺激，
[0080] b.从刺激的第4-7天施用GnRH拮抗剂直到排卵引发，
[0081] c.通过在刺激的第1-9天期间施用至少一个剂量的LH激动剂来对所述女性提供LH激动剂，所述剂量足以刺激卵泡发育，直到排卵引发，
[0082] d.当至少一个卵泡具有12-14mm的直径时停止施用FSH，
[0083] e.当至少一个卵泡具有至少15mm的直径时用至少一个剂量的GnRH激动剂诱导排卵。
[0084] 本发明的刺激方案试图通过以下方式改进已知的方法，即当已经募集到合适数目的卵泡时停止FSH施用，并且在此时切换到hCG(或LH)施用，以便确保最大卵泡的成熟，同时较不成熟的卵泡不进一步发育。本领域中已知在排卵时高数目不成熟的卵泡会增加OHSS的危险。
[0085] 通过以下方式进一步减少OHSS的危险，即通过采用GnRH激动剂引发注射诱导排卵，从而无须施用高剂量的hCG以诱发排卵。
[0086] 在本发明优选的实施方案中，在卵泡刺激期间施用的hCG是长效hCG或长效LH。使用长效hCG或LH有若干优点。明显的是患者配合度提高，因为注射的次数减少了。还预期的是，这样可以更进一步地减少OHSS的危险，因为在卵泡阶段期间仅一次或两次施用蛋白质时，hCG或LH的积累没有危险。
[0087] 还可以设想到可以在刺激方案的就头几天中的一天期间作为单次剂量施用长效hCG或LH。当进行药物(如重组蛋白)的团注时，几乎总是有血清水平的初始激增，此后血清水平下降到较低的水平，该水平根据药物的血清半衰期情况而平稳地减少。在刺激方案的最初几天期间，hCG或LH的受体还没有在颗粒细胞上呈活性，这时它们被结构性表达于周围的泡膜细胞上。在卵泡发育的此阶段提供的LH活性有可能通过泡膜细胞增加雄激素输出。这些雄激素有可能影响颗粒细胞以增强它们的FSH受体表达，因此使它们对外源施用的FSH更敏感，并因此改善卵泡健康( Nielsen M,Rasmussen IA,Kristensen SG,
Christensen ST, K,Wreford Andersen E,Byskov AG,Yding Andersen C:
Expression of Androgen-receptor mRNA in granulosa cells from human small antral follicles and the corresponding follicular fluid concentrations of androgens are positively correlated to granulosa cell FSH receptor mRNA expression.Mol.Hum.Reprod.2011；17:63-70.PMID:20843821)。这意味着由hCG团注造成的激增可提高颗粒细胞响应性，并且在受体于颗粒细胞上变得呈活性前被终止。此后，可以获得更合适和稳定的hCG血清水平以使适当的卵泡发育和成熟。
Christensen ST, K,Wreford Andersen E,Byskov AG,Yding Andersen C:
Expression of Androgen-receptor mRNA in granulosa cells from human small antral follicles and the corresponding follicular fluid concentrations of androgens are positively correlated to granulosa cell FSH receptor mRNA expression.Mol.Hum.Reprod.2011；17:63-70.PMID:20843821)。这意味着由hCG团注造成的激增可提高颗粒细胞响应性，并且在受体于颗粒细胞上变得呈活性前被终止。此后，可以获得更合适和稳定的hCG血清水平以使适当的卵泡发育和成熟。
[0088] 在本发明的一些实施方案中，在刺激阶段期间施用的长效hCG或LH仅足以支持卵泡发育直到排卵。在其它实施方案中，剂量也足以对根据本发明的黄体阶段提供支持。
[0089] 在替代方案中，通过施用相对低剂量的hCG进行排卵诱导，剂量为2000IU或更少，如1500IU或更少，例如1000IU或更少，如750IU、500IU或200IU。优选地，剂量在1000与2000IU之间。排卵诱导也可以涉及联合施用GnRH激动剂。这种替代方案固有的OHSS危险性也低，因为用于排卵诱导的hCG的剂量比现有技术中用于排卵诱导的剂量显著地低。
[0090] 在另一方面，本发明涉及对经受辅助生育治疗的女性提供黄体支持的方法，所述方法包括在黄体阶段期间施用LH激动剂，至少直到排卵后2周。
[0091] 根据这一方面，从大约排卵或取得卵母细胞时施用LH激动剂，并且在黄体阶段期间继续施用。优选地，继续施用LH激动剂，直到排卵后至少28天。
[0092] 优选地，在黄体阶段期间施用的LH激动剂是如本文所述的LH或LH类似物或LH变体。
[0093] 可以按本申请中所述的剂量和间隔施用LH和hCG以及这些激素的长效形式物。女性可以是根据本发明经受辅助生育治疗的女性。女性也可以是已经根据现有技术经受受控的卵巢刺激的女性，包括已经接受用于引发排卵的hCG的团注的女性。后者的女性将具有足以在排卵引发后提供大约一周黄体支持的hCG的血清水平。
[0094] 在优选的实施方案中，施用LH激动剂直到排卵后至少6周，如7周，例如8周，如9周，例如受精后10周。
[0095] 可以在排卵诱导阶段和/或黄体阶段和/或妊娠阶段期间每2天施用长效hCG或长效LH，如每3天施用，例如每4天施用，如每5天施用，例如每6天施用，如每7天施用，例如每8天施用，如每9天施用，例如每10天施用。
[0096] 也可以在排卵诱导阶段和/或随后的黄体阶段和/或随后的妊娠阶段期间每14天施用长效hCG或长效LH，如每21天施用，例如每月施用，或者以甚至更小的频度施用。
[0097] 本发明的受控卵巢刺激方法通常导致涉及以下参数中的一项或多项的改善：生化妊娠、活胎、着床率提高、留存率提高、流产率降低、宫外孕流产率降低、OHSS发生的减少以及由于在黄体阶段中对施用孕酮的减少或没有必要施用孕酮而使方便性得到改善。
[0098] 可通过胞质内精子注射(ICSI)、子宫内人工授精(IUI)、体外成熟(IVM)或由其衍生的其它形式(如单独的卵巢排卵)将本发明的卵泡刺激方案与体外受精(IVF)联合使用。
[0099] 可以将提供黄体支持的方法与上文提到的任何刺激方案联合使用或者与其中需要刺激孕酮水平的任何尝试妊娠或实际妊娠联合使用。
[0100] 在进一步的方面中，本发明涉及用于诱导卵泡生成和支持随后的胚胎着床的方法，包括：
[0101] a.在月经周期的第1-3周期日通过施用FSH开始刺激，
[0102] b.从刺激的第4-7天施用GnRH拮抗剂直到排卵，
[0103] c.通过在第1-9天期间施用至少一个剂量的hCG来施用LH激动剂，所述至少一个剂量的hCG足以刺激卵泡发育，直到排卵，
[0104] d.当至少一个卵泡具有12-14mm的平均直径时停止施用FSH，以及
[0105] e.通过施用足以在排卵后7-10天提供至少20nmol/L血清孕酮浓度的一个或多个剂量的LH激动剂来提供黄体支持。
[0106] 这种方法可导致单卵泡生成(monofolliculogenesis)或少量卵泡生成。该方法也可用于在无排卵妇女中刺激卵泡发育。该方法还可涉及采用hCG引发注射或GnRH引发注射的排卵诱导，作为COS方案的一部分。
[0107] 本发明进一步的方面是对这种男孩提供LH化合物，以便提供稳定浓度的雄激素并减少对这些年轻男孩给予注射的次数。
[0108] 本发明又进一步的方面对促性腺激素分泌不足的性腺低能男人提供LH化合物，以便提供稳定浓度的hCG，其可诱发足以引起精子产生并将雄激素维持在可接受水平的睾丸雄激素产生。
附图说明
[0109] 图1a.现有技术中已知的具有hCG/GnRHa引发的典型短期拮抗剂方案的示意图。图中示意性地显示出从月经周期的第1天每日施用FSH并且直到排卵引发。大约在第6天开始施用日剂量的GnRH拮抗剂并且直到排卵引发。当卵泡已达到直径16-18mm的尺寸时通过hCG或GnRH激动剂的药团注射引发排卵。36小时后收获卵母细胞。两天后，将一个或多个受精胚胎转回子宫。为了提供黄体支持，施用孕酮，例如通过阴道或肌内施用。
[0110] 图1b.具有hCG/GnRH激动剂引发的替代性短期拮抗剂方案的示意图。该方案基于在方案的第一天施用长效FSH(绒促卵泡素(Corifollitropin))。从第6或7天往后施用日剂量的重组或尿FSH以补充绒促卵泡素。GnRH拮抗剂、引发及黄体支持如图1a。
[0111] 图2a.本发明的示例性COS方案，其中以长持续性FSH(如绒促卵泡素)的一个团注代替FSH的日剂量。通过施用长效hCG(S-hCG)支持卵泡发育，其是在大约第6天施用的，这取决于卵泡直径的情况。从方案的第6天左右施用GnRH拮抗剂，并且以GnRH激动剂诱导排卵。可由孕酮或通过采用本发明的黄体方法提供黄体支持(图4a或4b)。
[0112] 图2b.根据本发明的一个示例性受控卵巢刺激(COS)方案的示意图示。以尿或重组FSH的日剂量施用FSH。从对应于大约12-14mm的卵泡尺寸的第6天左右停止FSH施用。第6天开始以日剂量施用GnRH拮抗剂并且直到排卵引发。在第6天施用长效(长持续性)hCG或长效LH的药团注射。通过施用GnRH激动剂引发排卵。黄体支持未显示，可通过如图1a那样施用孕酮或者通过在黄体阶段期间施用hCG或长效hCG或LH或长效LH的一种或多种皮下注射予以实现。
[0113] 图2c.本发明的示例性COS方案，其中通过日剂量的重组或尿FSH支持卵泡募集。从对应于大约12-14mm的卵泡尺寸的约第6天通过日剂量的hCG或LH支持卵泡发育。第6天开始以日剂量施用GnRH拮抗剂并且直到排卵引发。通过施用GnRH激动剂引发排卵。黄体支持未显示，可通过如图1a那样施用孕酮或者通过在黄体阶段期间施用hCG或长效hCG或LH或长效LH的一种或多种皮下注射予以实现。在怀孕的情况下，黄体支持可继续，直到第5-10妊娠周。
[0114] 图3a.本发明的示例性COS方案。与图2b中的方案相比，长效(长持续性)hCG或LH的施用继续到黄体阶段以提供黄体支持。在怀孕的情况下，黄体支持可继续，直到第5-10妊娠周。
[0115] 图3b.本发明的示例性COS方案。与图3a中的方案相比，以重组或尿hCG或LH的每日注射施用hCG或LH。可用同等的LH剂量代替hCG。在怀孕的情况下，黄体支持可继续，直到第5-10妊娠周。
[0116] 图3c.本发明的示例性COS方案。与图3b中的方案相比，已从月经周期的第2天以hCG或LH的每日注射开始hCG/LH施用。作为另外的选择，可以用同等剂量的一次或多次长效hCG或长效LH的注射代替日剂量。在怀孕的情况下，黄体支持可继续，直到第5-10妊娠周。
[0117] 图4a：本发明示出黄体支持的示例性方案。不论刺激方案(未显示)如何，在排卵后大约第2天开始的黄体阶段期间，尿或重组LH或hCG的日剂量提供黄体支持。如果女性怀孕，黄体支持可继续，直到第5妊娠周，例如直到第10妊娠周。
[0118] 图4b.本发明示出黄体支持的示例性方案。不论刺激方案(未显示)如何，在排卵后大约第2天开始的黄体阶段期间，每2至7天施用的一个或多个剂量的长效LH或长效hCG提供黄体支持。如果女性怀孕，黄体支持可继续，直到第5妊娠周，例如直到第10妊娠周。
[0119] 图5：来自不同物种的促性腺激素α链的ClustalX2比对。序列取自Uniprot数据库。Uniprot ID和登录号给出如下：
[0120] 人 GLHA_HUMAN P01215
[0121] 小鼠 GLHA_MOUSE P01216
[0122] 大鼠 GLHA_RAT P11962
[0123] 完全保守的残基用黑色背景标记，且对应的氨基酸残基在比对下面以大写显示。半保守的残基用灰色背景显示，并且用比对下面的小写字型标记。
[0124] 用ClustalX2进行比对(Larkin,M.A.,Blackshields,G.,Brown,N.P.,Chenna,R.,McGettigan,P.A.,McWilliam,H.,Valentin,F.,Wallace,I.M.,Wilm,A.,Lopez,R.,Thompson,J.D.,Gibson,T.J.,Higgins,D.G.(2007)Clustal W and Clustal X vers ion 2.0.Bioinformatics,23:2947-2948.)
[0125] 图6：来自不同物种的促黄体激素β链的ClustalX2比对：
[0126] 序列取自Uniprot数据库。Uniprot ID和登录号给出如下
[0127]
[0128] 图7：来自不同物种的促卵泡激素β链的ClustalX2比对。序列取自Uniprot数据库。Uniprot ID和登录号给出如下：
[0129] 促卵泡素β亚基
[0130]
[0131]
[0132] 图8a：缀合物l的非还原SDS PAGE，rHA和hCG为对照。
[0133] 图8b：缀合物l的还原SDS PAGE，rHA和不同浓度的hCG为对照。
[0134] 图8c：纯缀合物l的SEC-HPLC分析。
[0135] 图9a：缀合物3的非还原SDS PAGE，rHA和hCG为对照。
[0136] 图9b：缀合物3的还原SDS PAGE，with rHA和不同浓度的hCG为对照。
[0137] 图9c：纯缀合物3的SEC-HPLC分析。
[0138] 图10a：缀合物4的非还原SDS PAGE，rHA和hCG为对照。
[0139] 图10b：缀合物4的还原SDS PAGE，rHA和不同浓度的hCG为对照。
[0140] 图10c：纯缀合物4的SEC-HPLC分析。
[0141] 图11a：缀合物3V1的非还原SDS PAGE，K473P-rHA和hCG为对照。
[0142] 图11b：缀合物3V1的还原SDS PAGE，K573P-rHA和不同浓度的hCG为对照。
[0143] 图11c：纯缀合物3V1的SEC-HPLC分析。
[0144] 图12a：缀合物4V1的非还原SDS PAGE，K573P-rHA和hCG为对照。
[0145] 图12b：缀合物4V1的还原SDS PAGE，K573P-rHA和不同浓度的hCG为对照。
[0146] 图12c：纯缀合物4V1的SEC-HPLC分析。
[0147] 图13：转染前扩增的单基因载体的确认。
[0148] 图14：使用抗-HSA(人血清白蛋白)的产品1-10的蛋白质印迹(Western Blot)。
[0149] 图15：使用抗-促性腺激素共同α-亚基的产品1-10的蛋白质印迹。
[0150] 图16：使用抗-hCGβ-亚基的产品1-10的蛋白质印迹。
[0151] 图17：产品1-10的SDS PAGE(非还原及还原)分析。
[0152] 图18：产品11-12的SDS PAGE(非还原及还原)分析。
[0153] 图19a：hCG、缀合物3和缀合物4的体外活性测量。
[0154] 图19b：hCG、缀合物3v1、缀合物4V1、产品11和产品12的体外活性测量。
[0155] 图19c：hCG、产品2、产品3、产品4和产品5的体外活性测量。
[0156] 图19d：hCG、产品7、产品8、产品9和产品10的体外活性测量。
[0157] 图20a：四个日剂量后hCG体内活性的测量。
[0158] 图20b：四个日剂量后hCG和缀合物3的体内活性的测量。
[0159] 图20c：四个日剂量后hCG和缀合物3的体内活性的测量。
[0160] 图20d：四个日剂量后hCG、缀合物3和缀合物4的体内活性的测量。
[0161] 图20e：四个日剂量后hCG、缀合物3V1和缀合物4V1的体内活性的测量。
[0162] 图20f：四个日剂量后hCG、产品2、产品3和产品8的体内活性的测量。
[0163] 图20g：四个日剂量后hCG、产品11和产品12的体内活性的测量。
[0164] 图20h：四个日剂量后hCG、产品4、产品5和产品10的体内活性的测量。
[0165] 图20i：四个日剂量后hCG和产品7的体内活性的测量。
[0166] 图20j：在第1天单次团注后hCG、缀合物3、产品11和产品12的体内活性的测量。
[0167] 图21a：在切除垂体的雄性大鼠中hCG、缀合物3和缀合物3V1的药代动力学数据(线性标度)。
[0168] 图21b：在切除垂体的雄性大鼠中hCG、缀合物3和缀合物3V1的药代动力学数据(对数标度)。
[0169] 图21c：hCG、缀合物3和缀合物3V1的标准曲线。
[0170] 图21d：在切除垂体的雄性大鼠中hCG、缀合物3和缀合物3V1的终末半衰期的计算。
[0171] 图22a：在切除垂体的雄性大鼠中hCG、缀合物4V1、产品11和产品12的药代动力学数据(线性标度)。
[0172] 图22b：在切除垂体的雄性大鼠中hCG、缀合物4V1、产品11和产品12的药代动力学数据(对数标度)。
[0173] 图22c：hCG、缀合物4V1、产品11和产品12的标准曲线。
[0174] 图22d：在切除垂体的雄性大鼠中hCG、缀合物4V1、产品11和产品12的终末半衰期的计算。
[0175] 图22e：在切除垂体的雄性大鼠中产品7和产品10的药代动力学数据(线性标度)。
[0176] 图22f：在切除垂体的雄性大鼠中产品7和产品10的药代动力学数据(对数标度)。
[0177] 图22g：产品7和产品10的标准曲线。
[0178] 图22h：在切除垂体的雄性大鼠中产品7和产品10的终末半衰期的计算。
[0179] 图23a：在正常成年雄性大鼠中hCG、LH、缀合物3、缀合物3V1、产品2、产品3和产品7的药代动力学数据(线性标度)。
[0180] 图23b：在正常成年雄性大鼠中hCG、LH、缀合物3、缀合物3V1、产品2、产品3和产品7的药代动力学数据(对数标度)。
[0181] 图23c：LH和产品7的标准曲线。
[0182] 图23d：在正常成年雄性大鼠中hCG、LH、缀合物3、缀合物3V1、产品2、产品3和产品7的终末半衰期的计算。
[0183] 定义
[0184] 在本发明的上下文中，如本文所用的术语“LH激动剂”意指哺乳动物或非哺乳动物来源的分子，其结合并激活哺乳动物(如人)的促黄体激素受体。LH激动剂可以是有机小分子、肽、多肽、蛋白质，并且可以通过合成方法、通过重组手段来产生，或者由组织或体液获得。如本文所用的术语“LH激动剂”还包括其药学上可接受的盐。术语“LH激动剂”包括hLH、hLH类似物和变体以及长效hLH。该术语还包括hCG、hCG类似物和变体以及长效hCG。
[0185] 如本文所用，“IU比例”是一个组分的IU数与另一组分的IU数之比。值得注意的是，促性腺激素现在可以被表示成(质量/g)而不是生物IU。在这种情况下，必须使用转换因子将新的值转成IU。如本文所用，通过ELISA或本领域技术人员已知的另外的免疫学方法测量哺乳动物中的体内血浆浓度，并表示成可与IU/L互换使用的每升IU。
[0186] 在本发明的上下文中，如本文所用的术语“长效生物学活性促黄体激素(LH)化合物”或“LH化合物”(这些术语在整个说明书中可互换使用)意指连接至药学上可接受的分子的LH激动剂，如hCG或hLH，其具有与其结合的药学上可接受的分子，以便修饰所述hCG或hLH的性质。如本文所用的术语“LH化合物”还包括其药学上可接受的盐。
[0187] 在本发明的上下文中，如本文所用的术语“修饰的促黄体激素”或“修饰的LH”(这些术语在整个说明书中可互换使用)意指连接至药学上可接受的分子的哺乳动物LH，如hLH，其具有与其结合的药学上可接受的分子，以便修饰所述hLH的性质。如本文所用的术语“修饰的LH”还包括其药学上可接受的盐。
[0188] 在本发明的上下文中，如本文所用的术语“结合至哺乳动物新生儿Fc受体的分子”意指对哺乳动物新生儿Fc受体(FcRn)具有亲和力的任何药学上可接受的分子，如具有强亲和力、弱亲和力或中等亲和力。FcRn在成人上皮组织中是活性的，并且表达在肠的内腔、肺气道、鼻表面、阴道表面、结肠和直肠表面中(第6,485,726号美国专利)。包含FcRn结合伴侣(例如，IgG、Fc片段)的融合蛋白能通过FcRn有效地穿越上皮屏障，从而提供非侵入性手段以全身性施用所需的治疗分子。此外，包含FcRn结合伴侣的融合蛋白被表达FcRn的细胞内吞和保护。这些融合蛋白不是被标记为降解，而是被向外再循环再次进入到循环里，从而增加这些蛋白质的体内半衰期。提高治疗蛋白疗效的一种方法是增加其血清持久性，从而允许较高的循环水平、较低频度的施用和减少的剂量。白蛋白融合物或缀合物的半衰期或者Fc融合物或缀合物的半衰期在一个实例中取决于其与FcRn的pH依赖性结合。表达于内皮细胞的表面上的FcRn以pH依赖性方式结合白蛋白和/或Fc，并保护其防止降解。在pH 6.0但不是pH 7.4下与FcRn选择性地结合强于相应的野生型的一些白蛋白变体或Fc片段的变体在多种动物模型中显示出较长的终末半衰期。对于含Fc的分子，位于CH2与CH3结构域之间界面的若干突变，如T250Q/M428L(Hinton PR.et al.,2004.Engineered human IgG antibodies with longer serum half-lives in primates.J Biol Chem.279(8):6213-6)和252Y/S254T/T256E+H433K/N434F(Vaccaro C.et al.,2005.Engineering the Fc region of immunoglobulin G to modulate in vivo antibody levels.Nat
Biotechnol.23(10):1283-8)，已显示出在体内增加对FcRn的结合亲和力和含Fc-变体的分子的半衰期。然而，增加的FcRn结合与提高的半衰期之间并不总是有直接关系(Datta-Mannan A.et al.,2007.Humanized IgG1Variants with Differential Binding
Properties to the Neonatal Fc Receptor:Relationship to Pharmacokinetics in Mice and Primates.Drug Metab.Dispos.35:86-94)。人白蛋白的变体以类似的方式已显示出在体内增加对FcRn的结合亲和力和含白蛋白-变体的分子的半衰期(参见WO 2010/
092135和WO2011/051489)。
Biotechnol.23(10):1283-8)，已显示出在体内增加对FcRn的结合亲和力和含Fc-变体的分子的半衰期。然而，增加的FcRn结合与提高的半衰期之间并不总是有直接关系(Datta-Mannan A.et al.,2007.Humanized IgG1Variants with Differential Binding
Properties to the Neonatal Fc Receptor:Relationship to Pharmacokinetics in Mice and Primates.Drug Metab.Dispos.35:86-94)。人白蛋白的变体以类似的方式已显示出在体内增加对FcRn的结合亲和力和含白蛋白-变体的分子的半衰期(参见WO 2010/
092135和WO2011/051489)。
[0189] 在本发明的上下文中，如本文所用的术语“哺乳动物抗体的Fc片段”意指恒定区，即哺乳动物抗体的Fc片段或其片段，其中这种哺乳动物抗体可选自哺乳动物(如灵长类动物，例如人、猿或猴；马科动物，例如马)的IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。哺乳动物抗体的典型Fc片段是人抗体的重组Fc片段，如人IgG抗体的重组Fc片段。生成包含连接至所关注的蛋白质或其片段的免疫球蛋白恒定区的融合蛋白已有描述(参见，例如第5,155,027、5,428,130、5,480,981和5,808,029号美国专利)。这些分子通常兼有与所关注的连接分子相关的生物活性以及效应子功能，或与免疫球蛋白恒定区相关的一些其它所需特性。包含免疫球蛋白的Fc部分的融合蛋白可对融合蛋白赋予若干可取的性质，包括提高的稳定性、增加的血清半衰期(参加Capon et al.(1989)Nature 337:525)以及对诸如新生儿Fc受体(FcRn)的Fc受体的结合(第6,086,875、6,030,613和6,485,726号美国专利)。
[0190] 在本发明的上下文中，如本文所用的术语“哺乳动物抗体的Fc片段的变体”或“Fc变体”(在整个本说明书中可互换使用)意指哺乳动物抗体的Fc片段，其中一个或多个氨基酸残基(如Fc片段的1-10氨基酸残基)已被其它氨基酸残基取代，和/或其中一个或多个氨基酸残基(如1-10氨基酸残基)已被从Fc片段中删除，和/或其中一个或多个氨基酸残基(如1-10氨基酸残基)已被加至Fc片段，和/或其中一个或多个氨基酸残基(如Fc片段中的1-10氨基酸残基)已被修饰。这种氨基酸残基的增加或删除可发生在例如Fc片段的N-末端和/或Fc片段的C-末端。Fc变体是指由天然Fc修饰的分子或序列，但仍包含挽救受体，FcRn，的结合位点(WO 97/34631)。天然是指未被人修饰的Fc。WO 96/32478描述了示例性Fc变体以及与挽救受体的相互作用。因此，术语“Fc变体”在一个实施方案中包含由非人类天然Fc人源化的分子或序列。此外，天然Fc包含可除去的位点，因为它们提供了本发明的融合分子不需要的结构特征或生物活性。因此，Fc变体包含缺少一个或多个影响或涉及以下方面的天然Fc位点或残基的分子或序列，(1)二硫键形成，(2)与选定的宿主细胞不相容，(3)在选定的宿主细胞中表达时的N-末端不均一性，(4)糖基化，(5)与补体的相互作用，(6)结合至挽救受体以外的Fc受体，或(7)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。可根据诸如定点诱变等的公认程序修饰IgG的Fc区以产生将被FcRn结合的修饰的IgG或Fc片段或其部分。这种修饰包括远离FcRn接触位点的修饰以及在保持或甚至增强对FcRn的结合的接触位点内的修饰。例如，人IgG1Fc(Fcy1)中的以下单氨基酸残基可被取代而不显著损失对FcRn的Fc结合亲和力：
P238A、S239A、K246A、K248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、A330S、P331A、P331S、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375A D376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D413A、K414A、R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A、E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A和K447A，其中例如P238A代表在238号位置被丙氨酸取代的野生型脯氨酸。除了丙氨酸外，其它氨基酸可以在上面指定的位置取代野生型氨基酸。可以将突变单独引入Fc，产生超过一百种不同于天然Fc的FcRn结合伴侣。此外，可将这些单个突变中的两种、三种或更多种的组合一起引入，产生数百多种FcRn结合伴侣。上述突变中的某些可对FcRn结合伴侣赋予新功能性。例如，一个实施方案采用N297A，除去高度保守的N-糖基化位点。此突变的作用是减少对免疫效应细胞的结合并潜在地降低免疫原性，从而提高FcRn结合伴侣的循环半衰期，并且使FcRn结合伴侣不能结合FcyRI、FcyRIIA、FcyRIIB和FcyRIIIA，而不使对FcRn的亲和力受损(Routledge et al.(1995)
Transplantation 60:847；Friend et al.(1999)Transplantation 68:1632；Shields et al.(1995)J.Bioi.Chern.276:6591)。此外，至少三种人Fcγ受体似乎可识别下游铰链区内IgG上的结合位点，通常为氨基酸234-237。因此，另一例新功能性及潜在降低的免疫原性可由此区的突变引起，例如通过用来自lgG2“PVA”的相应序列(删除一个氨基酸)替换人IgG1“ELLG”的氨基酸233-236。已经显示当已引入这种突变时，介导各种效应子功能的FcyRI、FcyRII和FcyRIII将不结合至IgG1(Ward and Ghetie(1995)Therapeutic Immunology 2:
77和Armour et al.(1999)Eur.J.Immunol.29:2613)。作为起因于上述突变的新功能性的进一步的例子，在一些情况下对FcRn的亲和力可被增加超出野生型的情况。这一增加的亲和力可反映增加的“结合”率(on rate)、减小的“离解”率(off rate)或增加的“结合”率和减小的“离解”率两者。据认为对FcRn赋予增加的亲和力的突变包括T256A、T307A、E380A和N434A(Shields et al.(2001)J.Bioi.Chem.276:6591)。此外，Fc片段的这种变体包括且不限于描述在例如Atwell et all J.Mol.Biol.(1997),270,26-35和Ridgway et al Protein Engineering,vol.9,no.7,pp617-621,1996中的“旋钮-入-洞(knob-into-hole)”或“KnH”技术。如本文所用的术语“旋钮-入-洞”或“KnH”技术是指通过将突出(旋钮)引进一个多肽并且将腔(洞)引进另一个多肽(在它们相互作用的界面)而在体外或体内引导两个多肽配对到一起。例如，KnH已被引入在抗体的Fc:Fc结合界面、CL:CHI界面或VH:VL界面中(例如，US2007/0178552、US12/811,207、US20100286374、WO96/027011、WO98/050431和Zhu et a！.(1997)Protein Science 6:781-788)。这特别适用于在生产多特异性抗体或异二聚Fc-融合分子期间驱动将两个不同的重链配对到一起。例如，在其Fc区具有KnH的多特异性抗体可进一步包含连接至每个Fc区的单可变结构域，或者进一步包含与类似或不同的轻链可变结构域配对的不同的重链可变结构域。KnH技术也可用于将两个不同的受体胞外结构域配对到一起或包含不同的靶识别序列的任何其它多肽序列(例如，包括亲和体、肽体及其它Fc融合物)。KnH技术也可用于将例如促性腺激素分子中的两个不同的链(如Fc-融合物中的FSH、LH、hCG或TSH)配对。
P238A、S239A、K246A、K248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、A330S、P331A、P331S、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375A D376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D413A、K414A、R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A、E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A和K447A，其中例如P238A代表在238号位置被丙氨酸取代的野生型脯氨酸。除了丙氨酸外，其它氨基酸可以在上面指定的位置取代野生型氨基酸。可以将突变单独引入Fc，产生超过一百种不同于天然Fc的FcRn结合伴侣。此外，可将这些单个突变中的两种、三种或更多种的组合一起引入，产生数百多种FcRn结合伴侣。上述突变中的某些可对FcRn结合伴侣赋予新功能性。例如，一个实施方案采用N297A，除去高度保守的N-糖基化位点。此突变的作用是减少对免疫效应细胞的结合并潜在地降低免疫原性，从而提高FcRn结合伴侣的循环半衰期，并且使FcRn结合伴侣不能结合FcyRI、FcyRIIA、FcyRIIB和FcyRIIIA，而不使对FcRn的亲和力受损(Routledge et al.(1995)
Transplantation 60:847；Friend et al.(1999)Transplantation 68:1632；Shields et al.(1995)J.Bioi.Chern.276:6591)。此外，至少三种人Fcγ受体似乎可识别下游铰链区内IgG上的结合位点，通常为氨基酸234-237。因此，另一例新功能性及潜在降低的免疫原性可由此区的突变引起，例如通过用来自lgG2“PVA”的相应序列(删除一个氨基酸)替换人IgG1“ELLG”的氨基酸233-236。已经显示当已引入这种突变时，介导各种效应子功能的FcyRI、FcyRII和FcyRIII将不结合至IgG1(Ward and Ghetie(1995)Therapeutic Immunology 2:
77和Armour et al.(1999)Eur.J.Immunol.29:2613)。作为起因于上述突变的新功能性的进一步的例子，在一些情况下对FcRn的亲和力可被增加超出野生型的情况。这一增加的亲和力可反映增加的“结合”率(on rate)、减小的“离解”率(off rate)或增加的“结合”率和减小的“离解”率两者。据认为对FcRn赋予增加的亲和力的突变包括T256A、T307A、E380A和N434A(Shields et al.(2001)J.Bioi.Chem.276:6591)。此外，Fc片段的这种变体包括且不限于描述在例如Atwell et all J.Mol.Biol.(1997),270,26-35和Ridgway et al Protein Engineering,vol.9,no.7,pp617-621,1996中的“旋钮-入-洞(knob-into-hole)”或“KnH”技术。如本文所用的术语“旋钮-入-洞”或“KnH”技术是指通过将突出(旋钮)引进一个多肽并且将腔(洞)引进另一个多肽(在它们相互作用的界面)而在体外或体内引导两个多肽配对到一起。例如，KnH已被引入在抗体的Fc:Fc结合界面、CL:CHI界面或VH:VL界面中(例如，US2007/0178552、US12/811,207、US20100286374、WO96/027011、WO98/050431和Zhu et a！.(1997)Protein Science 6:781-788)。这特别适用于在生产多特异性抗体或异二聚Fc-融合分子期间驱动将两个不同的重链配对到一起。例如，在其Fc区具有KnH的多特异性抗体可进一步包含连接至每个Fc区的单可变结构域，或者进一步包含与类似或不同的轻链可变结构域配对的不同的重链可变结构域。KnH技术也可用于将两个不同的受体胞外结构域配对到一起或包含不同的靶识别序列的任何其它多肽序列(例如，包括亲和体、肽体及其它Fc融合物)。KnH技术也可用于将例如促性腺激素分子中的两个不同的链(如Fc-融合物中的FSH、LH、hCG或TSH)配对。
[0191] 在本发明的上下文中，术语“药学上可接受的盐”旨在表示对待治疗的哺乳动物受试者无害的盐。这种盐包括药学上可接受的酸加成盐、药学上可接受的金属盐、铵盐和烷基化铵盐。酸加成盐包括无机酸以及有机酸的盐。合适的无机酸的代表性例子包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸、硫酸、硝酸等。合适的有机酸的代表性例子包括甲酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、丙酸、苯甲酸、肉桂酸、柠檬酸、富马酸、乙醇酸、乳酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、草酸、苦味酸、丙酮酸、水杨酸、丁二酸、甲磺酸、乙磺酸、酒石酸、抗坏血酸、扑酸、双亚甲基水杨酸、乙二磺酸、葡糖酸、柠康酸、天冬氨酸、硬脂酸、棕榈酸、EDTA、乙醇酸、对氨基苯甲酸、谷氨酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等。药学上可接受的无机或有机酸加成盐的进一步例子包括在J.Pharm.Sci.66,2,(1977)中列出的药学上可接受的盐，该文献以引用的方式并入本文。金属盐的例子包括锂、钠、钾、镁盐等。铵和烷基化铵盐的例子包括铵、甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、乙基铵、羟乙基铵、二乙基铵、丁基铵、四甲基铵盐等。
[0192] 在本发明的上下文中，如本文所用的术语“绒膜促性腺激素”意指哺乳动物来源的绒膜促性腺激素，例如灵长类动物(如人)绒膜促性腺激素或马科动物绒膜促性腺激素(如马绒膜促性腺激素)，和重组绒膜促性腺激素，如重组人绒膜促性腺激素，以及这种绒膜促性腺激素的类似物。如本文所用，“CG”和“绒膜促性腺激素”是可互换的。当CG是哺乳动物的绒膜促性腺激素(如hCG和重组hCG)的类似物时，所述类似物被理解为通过用另一种天然或非天然氨基酸取代CG(例如hCG)序列中的一个或多个氨基酸残基；和/或通过对CG(例如hCG)序列增加一个或多个天然或非天然氨基酸；和/或通过从CG(例如hCG)序列中删除一个或多个氨基酸残基而获得的化合物，其中可任选在任何这些步骤的随后进行一个或多个氨基酸残基的进一步衍生化。特别地，一个氨基酸残基被同组的另一个氨基酸残基取代，即被具有类似性质的另一个氨基酸残基取代，从这个意义上来说，这种取代是保守的。根据其性质，可以方便地将氨基酸分成以下组：碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺、半胱氨酸和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸)。通常，CG与hCG具有至少80％的同一性，并且通常具有hCG的CG体内活性的至少20％。
[0193] 在本发明的上下文中，如本文所用的术语“促黄体激素”或“哺乳动物促黄体激素”意指哺乳动物来源的促黄体激素，如灵长类动物(例如人)或马促黄体激素和重组促黄体激素(如重组人、马、猿或猴促黄体激素)，以及这种促黄体激素的类似物。如本文所用，“LH”和“促黄体激素”是可互换的。当LH是哺乳动物的促黄体激素(如hLH和重组hLH)的类似物时，所述类似物被理解为通过用另一种天然或非天然氨基酸取代LH(例如hLH)序列中的一个或多个氨基酸残基；和/或通过对LH(例如hLH)序列增加一个或多个天然或非天然氨基酸；和/或通过从LH(例如hLH)序列中删除一个或多个氨基酸残基而获得的化合物，其中可任选在任何这些步骤的随后进行一个或多个氨基酸残基的进一步衍生化。特别地，一个氨基酸残基被同组的另一个氨基酸残基取代，即被具有类似性质的另一个氨基酸残基取代，从这个意义上来说，这种取代是保守的。根据其性质，可以方便地将氨基酸分成以下组：碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺、半胱氨酸和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸)。通常，LH与hLH具有至少80％的同一性，并且通常具有hLH的LH体内活性的至少20％。对于本发明的目的而言，hLH、hLH类似物和变体以及长效hLH不包括hCG、hCG类似物和变体以及长效hCG。
[0194] 在本发明的上下文中，如本文所用的术语“卵泡刺激激素”意指哺乳动物来源的卵泡刺激激素，如人、马科动物、牛或猪卵泡刺激激素，和重组卵泡刺激激素，如重组人、马科动物、牛或猪卵泡刺激激素，以及这种卵泡刺激激素的类似物。如本文所用，“FSH”和“卵泡刺激激素”是可互换的。对于卵泡生长的刺激，FSH可得自外源，或者可在妇女中内源性产生，其量高于正常量，f.i.通过提供作为对垂体的雌二醇拮抗剂的柠檬酸克罗米芬。
[0195] 当FSH是哺乳动物的卵泡刺激激素(如hFSH和重组hFSH)的类似物时，所述类似物被理解为通过用另一种天然或非天然氨基酸取代FSH(例如hFSH)序列中的一个或多个氨基酸残基；和/或通过对FSH(例如hFSH)序列增加一个或多个天然或非天然氨基酸；和/或通过从FSH(例如hFSH)序列中删除一个或多个氨基酸残基而获得的化合物，其中可任选在任何这些步骤的随后进行一个或多个氨基酸残基的进一步衍生化。特别地，一个氨基酸残基被同组的另一个氨基酸残基取代，即被具有类似性质的另一个氨基酸残基取代，从这个意义上来说，这种取代是保守的。根据其性质，可以方便地将氨基酸分成以下组：碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺、半胱氨酸和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸)。重组产生的FSH或FSH的类似物通常得自哺乳动物细胞系，如人或仓鼠细胞系，例如选自CHO、BHK和HEK的细胞系。通常，FSH与hFSH具有至少80％的同一性，并且通常具有hFSH的FSH体内活性的至少20％。
[0196] 如本文所用的术语“具有FSH活性的分子”意指当对哺乳动物施用时结合并激活FSH受体的分子，例如这种分子可(不限于)选自任何一种有机小分子。
[0197] 在本发明的上下文中，如本文所用的术语“连接子”意指将LH激动剂(例如哺乳动物LH)和药学上可接受的分子分开的价键或多官能部分，如双官能部分。多官能部分(如双或三官能的)共价连接至一种或多种LH激动剂(如一种或多种哺乳动物LH)，并共价连接至一种或多种药学上可接受的分子，以便产生LH化合物，如修饰的LH。连接子可以是稳定的，这意味着在治疗的时间段中，在生理条件(例如摄氏37度的温度和pH 7.4)下不发生显著的化学反应，例如水解。这可以通过本领域中已知的稳定性研究予以确定。连接子可以是不稳定的，这意味着在生理相关的条件(例如摄氏37度的温度和pH 7.4)下化学键断裂，通常是通过水解被断裂。这可以通过本领域中已知的稳定性研究予以确定。连接子可以是化学连接子，这意味着它是在活细胞以外通过有机化学产生的。连接子可以是糖部分，如对蛋白质糖基化，或者可以进行化学制备并用于连接LH激动剂(例如哺乳动物LH)和药学上可接受的分子。连接子可以是二硫桥，如各自在LH激动剂(例如哺乳动物LH)与药学上可接受的分子中的两个半胱氨酸(Cys)氨基酸残基之间的-S-S-键。连接子可以是融合连接子，这意味着LH化合物(例如修饰的LH)可以在活细胞中被表达为一种多肽或蛋白质。连接子可以是用化学部分将LH激动剂(例如哺乳动物LH)和药学上可接受的分子分开的亲水连接子，所述化学部分包含至少5个非氢原子，其中的30-50％为N或O。连接子可以是可水解的，如US6515100、US7122189、US7700551、WO2004089280、WO2006138572和WO2009095479中所述。在本发明中适合作为连接子的典型化合物包括选自具有二羧酸、马来酰亚胺基酰肼、PDPH、SPDP、LC-SPDP、GMBS、羧酸酰肼和小肽的化合物。根据本发明适合作为连接子的化合物的更具体的例子包括：(a)二羧酸，如丁二酸、戊二酸和己二酸；(b)马来酰亚胺基酰肼，如N-[马来酰亚胺基己酸]酰肼(EMCH)、N-[马来酰亚胺基丙酸丙酸]酰肼(MPH或BMPH)、4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧基酰肼和N-[k-马来酰亚胺基十一烷酸]酰肼(KMUH)、4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)；(c)NHS-3-马来酰亚胺基丙酸酯琥珀酰亚胺酯(MPS-EDA)；(d)PDPH连接子，如缀合至巯基反应蛋白的(3-[2-吡啶基二硫代]丙酰肼)；(e)N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(SPDP)，(f)琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸酯(LC-SPDP)，(g)N-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯(GMBS)，和(h)选自
2-5个碳原子的羧酸酰肼。其它非肽连接子也是可能的。例如，可以使用烷基连接子，如-NH-(CH2)m-C(O)-，其中m是选自2-20的整数。这些烷基连接子可以被任何非空间位阻基团进一步取代，如低级烷基(例如，C1至C6)低级酰基、卤素(例如，Cl、Br、I、F)、CN、NH2、苯基等。示例性非肽连接子为PEG连接子。根据本发明适用的另外的连接子描述在第6,660,843号美国专利中。其中药学上可接受的分子融合至LH激动剂的本发明的LH化合物可任选包含至少一个肽连接子。在一个实施方案中，连接子包含通过肽键连接在一起的氨基酸，其中氨基酸选自二十种天然存在的氨基酸。在各种实施方案中，连接子可包含1-5个氨基酸、1至10个氨基酸、1-20个氨基酸、10-50个氨基酸、50-100个氨基酸或100-200个氨基酸。在一个实施方案中，氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。在一个实施方案中，连接子由大多数无空间位阻的氨基酸组成，如甘氨酸和丙氨酸。连接子在一个实施方案中可包含序列Gn(等效地，-(Gly)n-)。连接子在一个实施方案中可包含序列(GGS)n或(GGGGS)n。在每个例子中，n是整数，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。连接子的例子包括但不限于GGG、SGGSGGS(SEQ ID NO:58)、GGSGGSGGSGGSGGG(SEQ ID NO:59)、GGSGGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID N0:60)和GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID N0:57)。在一个实施方案中，连接子是8-氨基酸连接子EFAGAAAV(SEQ ID N0:56)。
2-5个碳原子的羧酸酰肼。其它非肽连接子也是可能的。例如，可以使用烷基连接子，如-NH-(CH2)m-C(O)-，其中m是选自2-20的整数。这些烷基连接子可以被任何非空间位阻基团进一步取代，如低级烷基(例如，C1至C6)低级酰基、卤素(例如，Cl、Br、I、F)、CN、NH2、苯基等。示例性非肽连接子为PEG连接子。根据本发明适用的另外的连接子描述在第6,660,843号美国专利中。其中药学上可接受的分子融合至LH激动剂的本发明的LH化合物可任选包含至少一个肽连接子。在一个实施方案中，连接子包含通过肽键连接在一起的氨基酸，其中氨基酸选自二十种天然存在的氨基酸。在各种实施方案中，连接子可包含1-5个氨基酸、1至10个氨基酸、1-20个氨基酸、10-50个氨基酸、50-100个氨基酸或100-200个氨基酸。在一个实施方案中，氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。在一个实施方案中，连接子由大多数无空间位阻的氨基酸组成，如甘氨酸和丙氨酸。连接子在一个实施方案中可包含序列Gn(等效地，-(Gly)n-)。连接子在一个实施方案中可包含序列(GGS)n或(GGGGS)n。在每个例子中，n是整数，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。连接子的例子包括但不限于GGG、SGGSGGS(SEQ ID NO:58)、GGSGGSGGSGGSGGG(SEQ ID NO:59)、GGSGGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID N0:60)和GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID N0:57)。在一个实施方案中，连接子是8-氨基酸连接子EFAGAAAV(SEQ ID N0:56)。
[0198] 将诸如LH激动剂(例如哺乳动物LH)和药学上可接受的分子的两种或更多种分子连接在一起(并且任选经由多官能连接子，如双官能连接子)的不同技术是现有技术中就有的，这里合适的参考文献是WO0158493，包括其中所列举和引用的所有相关文件。
[0199] 在本发明的上下文中，如本文所用的术语“药学上可接受的分子”意指选自有机小分子、肽、寡肽、多肽、蛋白质、受体、糖基化、糖、聚合物(例如聚乙二醇，PEG)、核酸(例如DNA和RNA)、激素中的任何一种的分子，当其连接至LH激动剂(例如哺乳动物LH)时增加LH激动剂(例如哺乳动物LH)或LH化合物(例如修饰的LH)的血清半衰期。通常，药学上可接受的分子是而不限于白蛋白(如人白蛋白、重组白蛋白)或聚合物(如PEG，例如分子量为至少10kDa、如10kDa至150kDa的PEG)。此外，药学上可接受的分子可选自哺乳动物抗体的Fc片段、转铁蛋白、白蛋白(如人白蛋白、重组白蛋白、白蛋白的变体)、其中n是8至22的CH3(CH2)nCO-或聚合物(如PEG，例如分子量为至少5kDa、如10kDa至150kDa、通常10至40kDa的PEG)。
[0200] 在本发明的上下文中，术语“体内血浆半衰期”按其正常的含义使用，即在生物系统中LH激动剂(例如哺乳动物LH)或LH化合物(例如修饰的LH)的量通过生物过程减少到其值的一半所需的时间。
[0201] 可与“血浆半衰期”或“半衰期”互换使用的术语“血清半衰期”按其正常的含义使用，即在生物系统中LH激动剂(例如哺乳动物LH)或LH化合物(例如修饰的LH)、重组或尿hCG或LH或FSH或者长效hCG、长效LH或长效FSH的量减少到其浓度的一半所需的时间。因此如本文所用，“血清半衰期”表示体内血清半衰期。血清半衰期的测定通常比功能半衰期的测定更简单，并且血清半衰期的大小通常是功能体内半衰期大小的良好指示。优选在哺乳动物中测量血清半衰期，更优选人科物种，如红毛猩猩、黑猩猩或大猩猩，更优选在人中测量。本申请中提到的血清半衰期是按在人中测定的半衰期。也可以在诸如小鼠或大鼠或仓鼠的啮齿类动物中获得半衰期或半衰期的任何变化的指示。此外，可以在体重范围与人相同或者体重比啮齿类动物更接近人的较大型哺乳动物中测量半衰期：优选猴、狗、猪或牛(小牛)。根据本发明，半衰期比重组或尿促性腺激素(FSH、LH或hCG)长的促性腺激素被认为是“长效”的。
[0202] 结合血浆半衰期使用的术语“增加的”用于表示在可比较的条件下测定时，相对于LH激动剂(例如哺乳动物LH)的情况，LH化合物(例如修饰的LH)的相关半衰期在统计学上显著增加。比如，相关半衰期可增加至少约25％，如至少约50％，例如至少约100％、150％、200％、250％或500％。可以按文献中描述的多种方式进行体内血浆半衰期的测量。体内血浆半衰期的增加可以被量化为清除率的减少或平均停留时间(MRT)的增加。按合适的测定方法确定，本发明的LH化合物(例如修饰的LH)，其清除率被减少到LH激动剂(例如哺乳动物LH)的清除率的不到70％，如不到50％，如不到20％，如不到10％，这被认为是具有增加的体内血浆半衰期。按合适的测定方法确定，本发明的LH化合物(例如修饰的LH)，其MRT增加到LH激动剂(例如哺乳动物LH)的MRT的超过130％，如超过150％，如超过200％，如超过500％，这被认为是具有增加的体内血浆半衰期。可使用合适的试验动物在标准的药代动力学研究中评估清除率和平均停留时间。本领域技术人员有能力针对给定的蛋白质来选择合适的试验动物。当然人体试验代表最根本的试验。合适的试验动物包括正常的Sprague-Dawley雄性大鼠、小鼠和食蟹猴。通常对小鼠和大鼠注射单次皮下药团，而可以对猴注射单次皮下药团或注射单次iv剂量。注射量取决于试验动物的情况。随后，视情况经一至十天取血样(取决于测定的灵敏度情况，这可能要长达30天)用于评估清除率和MRT。通过ELISA技术或其它免疫学技术方便地对血样进行分析。
[0203] 在本发明的上下文中，如本文所用的术语“哺乳动物来源”意指获自哺乳动物，因此哺乳动物来源的LH激动剂可例如是获自哺乳动物组织或血液的人CG或人LH，或者可通过重组方法获得，如重组蛋白质、重组多肽，比如哺乳动物来源的LH激动剂可以是重组哺乳动物CG或重组哺乳动物LH，比如重组人CG或LH。
[0204] 在本发明的上下文中，如本文所用的术语“非哺乳动物来源”意指获自不是哺乳动物的来源，如合成肽、寡肽和多肽或有机小分子，比如非哺乳动物来源的LH激动剂可以是结合并激活LH受体的有机小分子或5至20个氨基酸的短肽。
[0205] 在本发明的上下文中，如本文所用的术语“血浆浓度”意指在注射LH激动剂后的任意给定时间可在循环中测量的浓度。
[0206] 在本发明的上下文中，如本文所用的术语“注射”意指通过肠胃外途径施用，如通过皮下、肌内、腹膜内施用或者借助于针筒或其它施用装置静脉内注射。
[0207] 在本发明的上下文中，如本文所用的术语“FSH治疗”意指标准的卵泡刺激激素治疗。在自发月经周期的开始，卵泡募集(即，卵泡的早期生长)需要FSH，并且它也支持中期和晚期卵泡生成。治疗性地施用FSH以在无排卵妇女和经受COS的妇女中诱导卵泡生成。在传统的排卵刺激方法中，在整个治疗过程中施用FSH，直到获取卵母细胞之时。
[0208] 在本发明的上下文中，如本文所用的术语“类似物”(analog，analogue：在整个本说明书中可互换使用)意指多肽或蛋白质，其中多肽或蛋白质的一个或多个氨基酸残基已被其它氨基酸残基取代，和/或其中一个或多个氨基酸残基已被从肽中删除，和/或其中一个或多个氨基酸残基已被添加至多肽或蛋白质。这种氨基酸残基的增加或删除可发生在例如肽的N-末端和/或肽的C-末端。可用简单的系统来描述类似物：例如，包含突变R133C的hCG类似物指示其中在hCG的位置133处天然存在的R已被C取代的类似物。另一个例子，包含突变L121C的hLH类似物指示其中在hLHβ链的位置121处天然存在的L已被C取代的类似物，采用根据IUPAC-IUB用于氨基酸的标准单字母缩写来描绘多肽或蛋白质类似物的化学式。
[0209] 在本发明的上下文中，如本文所用的术语“同一性”是指两种或更多种蛋白质的序列之间的关系，是通过比较序列测定的。在本领域中，“同一性”还意指蛋白质之间的序列相关性程度，按两种或更多种氨基酸残基的链之间的匹配数来测定。“同一性”测量两个或多个序列的较小者之间的完全相同匹配的百分比，通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)处理空位比对(如果有的话)。通过已知的方法可以很容易地计算出相关蛋白质的同一性。这类方法包括但不限于以下文献中描述的方法：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part 1,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M.Stockton Press,New York,1991；和Carillo et al.,SIAM J.Applied Math.,48,1073,(1988)。设计用于测定同一性的优选方法以给出测试序列之间的最大匹配。可公众获得的计算机程序中描述了测定同一性的方法。测定两序列之间的同一性的优选计算机程序方法包括：GCG程序包，包括GAP(Devereux et al.,Nucl.Acid.Res.,12,387,(1984)；Genetics Computer Group，University of Wisconsin,Madison,Wis.)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul et al.,J.Mol.Biol.,215,403-410,(1990))。公众可从国家生物技术信息中心(NCBI)及其它来源(BLAST Manual,Altschul et al.NCB/NLM/NIH Bethesda,Md.20894；Altschul et al.,同上)获得BLASTX程序。也可以使用熟知的Smith Waterman算法来测定同一性。例如，使用计算机算法GAP(Genetics Computer Group,University of
Wisconsin,Madison,Wis.)，比对要测定序列同一性百分比的两种蛋白质的相应氨基酸的最佳匹配(由算法测定的“匹配跨度(matched span)”)。空位开放罚分(其计算为3乘以平均对角线；“平均对角线”为所使用的比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”是由特定的比较矩阵分配给每个完全氨基酸匹配的分值或数值)和空位延伸罚分(其通常为{分数(1/10)}乘以空位开放罚分)以及比较矩阵(如PAM 250或BLOSUM 62)与算法联合使用。算法还使用标准比较矩阵(对于PAM 250比较矩阵，参见Dayhoff et al.,Atlas of Protein Sequence and Structure,vol.5,supp.3(1978)；对于BLOSUM 62比较矩阵，参见Henikoff et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA,89,10915-10919,(1992))。蛋白质序列比较的优选参数包括以下：算法：Needleman et al.,J.Mol.Biol,48,443-453,(1970)；比较矩阵：BLOSUM 62，来自Henikoff et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,10915-10919,(1992)；空位罚分：12，空位长度罚分：4，相似性阈值：0。采用上述参数的GAP程序是适用的。前述参数是使用GAP算法的蛋白质比较的缺省参数(连同末端空位没有罚分)。使用例如ClustalW程序(1.8版，1999年6月)、使用缺省参数(Thompson et al.,1994,ClustalW:Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice,Nucleic Acids Res.,22:4673-
4680)由比对序列方便地测定氨基酸序列同源性/同一性，并通过使用GENEDOC第2.5版进行分析(Nicholas et al.,1997GeneDoc:Analysis and Visualization of Genetic Variation,EMBNEW.NEWS 4:14；Nicholas,K.B.and Nicholas H.B.Jr.1997GeneDoc:
Analysis and Visualization of Genetic Variation)。
Wisconsin,Madison,Wis.)，比对要测定序列同一性百分比的两种蛋白质的相应氨基酸的最佳匹配(由算法测定的“匹配跨度(matched span)”)。空位开放罚分(其计算为3乘以平均对角线；“平均对角线”为所使用的比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”是由特定的比较矩阵分配给每个完全氨基酸匹配的分值或数值)和空位延伸罚分(其通常为{分数(1/10)}乘以空位开放罚分)以及比较矩阵(如PAM 250或BLOSUM 62)与算法联合使用。算法还使用标准比较矩阵(对于PAM 250比较矩阵，参见Dayhoff et al.,Atlas of Protein Sequence and Structure,vol.5,supp.3(1978)；对于BLOSUM 62比较矩阵，参见Henikoff et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA,89,10915-10919,(1992))。蛋白质序列比较的优选参数包括以下：算法：Needleman et al.,J.Mol.Biol,48,443-453,(1970)；比较矩阵：BLOSUM 62，来自Henikoff et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,10915-10919,(1992)；空位罚分：12，空位长度罚分：4，相似性阈值：0。采用上述参数的GAP程序是适用的。前述参数是使用GAP算法的蛋白质比较的缺省参数(连同末端空位没有罚分)。使用例如ClustalW程序(1.8版，1999年6月)、使用缺省参数(Thompson et al.,1994,ClustalW:Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice,Nucleic Acids Res.,22:4673-
4680)由比对序列方便地测定氨基酸序列同源性/同一性，并通过使用GENEDOC第2.5版进行分析(Nicholas et al.,1997GeneDoc:Analysis and Visualization of Genetic Variation,EMBNEW.NEWS 4:14；Nicholas,K.B.and Nicholas H.B.Jr.1997GeneDoc:
Analysis and Visualization of Genetic Variation)。
[0210] 在哺乳动物物种的循环血液中最丰富的蛋白质组分是血清白蛋白，其存在的浓度通常是每100毫升全血为大约3至4.5克。血清白蛋白是大约70,000道尔顿(Da)的血液蛋白质，其在循环系统中具有若干重要的功能。其充当血液中存在的多种有机分子的转运体、诸如脂肪酸和胆红素的各种代谢产物通过血液的主要转运体，并且由于其量丰富，充当循环血液的渗透调节剂。在本发明的上下文中，如本文所用的术语“白蛋白”意指哺乳动物来源或非哺乳动物来源的白蛋白，如Peters,T.,Jr.(1996)All about Albumin:Biochemistry,Genetics and Medical,Applications pp10,Academic Press,Inc.,Orlando(ISBN 0-12-5521 10-3)中描述的人血清白蛋白，或者重组人白蛋白或修饰的白蛋白，如按
WO2011051489和WO2010092135中所描述的那样修饰的人白蛋白。
WO2011051489和WO2010092135中所描述的那样修饰的人白蛋白。
[0211] WO2011051489，说明书涉及亲本白蛋白的变体，与亲本白蛋白相比，其血浆半衰期改变了。本发明还涉及包含所述变体白蛋白的融合多肽和缀合物。
[0212] WO2010092135，基于白蛋白的三维结构，发明人已设计了具有一个或多个带游离巯基的半胱氨酸残基的变体多肽(突变蛋白)(下文称“硫代-白蛋白")。变体多肽可通过半胱氨酸残基的硫原子缀合至缀合伴侣，如生物活性化合物。
[0213] WO2005054286，说明书涉及包含白细胞介素11(IL-11)的蛋白质(包括但不限于其片段和变体)，其显示出血小板生成或抗炎性质，融合至白蛋白(包括但不限于白蛋白的片段或变体)。
[0214] WO2004083245描述了一种药剂，其在患有NS的患者中的半衰期大于天然产生的白蛋白，该药剂包含结合于第二多肽的白蛋白样第一多肽。
[0215] WO03066681描述了一种组合物，其包含通过添加高度纯化的重组人血清白蛋白而稳定化的非白蛋白蛋白质。该非白蛋白蛋白质可以是因子VIII。
[0216] 如本文所用的术语“聚合物”意指通过两种或更多种单体键连形成的分子，其中除了聚合物是人白蛋白或别的丰富血浆蛋白质的情况外，没有一种单体是氨基酸残基。术语“聚合物”可与术语“聚合物分子”互换使用。该术语旨在涵盖通过体外糖基化附接的碳水化合物分子。通过诸如N-or O-糖基化的体内糖基化(下文进一步描述)附接的碳水化合物分子在本文中被称为“寡糖部分”。除了明确指出聚合物分子数目的情况外，如本发明中所用，每次提到“聚合物”、“一种聚合物”、“一种聚合物分子”、“所述聚合物”或“所述聚合物分子”应指一种或多种聚合物分子。聚合物可以是水溶性或水不溶性聚合物，如PEG部分。PEG部分可具有选自500Da至200.000Da范围的平均大小，如500Da至100.000Da，如2000Da至50.000Da。这种PEG分子可取自i.a.Shearwater Inc。
[0217] 在本发明的上下文中，如本文所用的术语“药物组合物”意指含有本发明的LH化合物(例如修饰的LH)和/或本发明的修饰的LH以及FSH和任选一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂的组合物，并且可以通过常规技术来制备，例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy 1995(E.W.Martin编辑),Mack Publishing Company,第19版，Easton,Pa中所述。组合物可呈常规的形式，例如胶囊剂、片剂、气雾剂、溶液剂、混悬剂或局部施用剂。通常，可以将本发明的药物组合物配制成用于肠胃外施用，例如通过i.v.或皮下注射，并且可以呈在安瓿、预填充针筒、小体积输注或加有防腐剂的多剂量容器中的单位剂型。组合物可采取诸如在油性或水性媒介物中的混悬液、溶液或乳液的形式，例如聚乙二醇水溶液。油性或非水性载体、稀释剂、溶剂或媒介物的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如，橄榄油)和可注射的有机酯(例如，油酸乙酯)，并且可含有配制剂，如防腐剂、润湿剂、乳化或混悬剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以为粉末形式，通过消毒固体的无菌分离或者通过由溶液冻干获得，用于在使用前用合适的媒介物(例如，无菌无热原水)进行组构。适用于肠胃外制剂的油包括石油、动物油、植物油或合成油。适用于这种制剂的油的具体例子包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、凡士林油和矿物油。用于肠胃外制剂的合适脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是合适的脂肪酸酯的例子。肠胃外制剂在溶液中通常含有约0.0001至约25重量％(如约0.5至约25％重量)的活性成分。可以使用防腐剂和缓冲剂。为了最小化或消除注射部位的刺激，这种组合物可含有一种或多种具有约12至约17的亲水-亲脂平衡值(HLB)的非离子型表面活性剂。这种制剂中的表面活性剂量通常在约0.000001至约15重量％范围内，如约0.000001至约5重量％或约5至约15重量％。合适的表面活性剂包括聚乙烯失水山梨醇脂肪酸酯(如失水山梨醇单油酸酯)和通过环氧丙烷与丙二醇缩合形成的环氧乙烷与疏水碱的高分子量加合物。肠胃外制剂可存在于单位剂量或多剂量密封的容器中，如安瓿和小瓶，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，在临使用前，注射仅需添加无菌液体赋形剂，例如水。
[0218] 在本发明的上下文中，如本文所用的术语“辅助生育技术”意指旨在增加自然怀孕或通过获取卵母细胞和精虫并进行体外受精而怀孕的可能性，这可以通过体外受精(IVF)或胞质内精子注射(ICSI)、子宫内人工授精(IUI)、体外成熟(IVM)或由其而来的其它形式。
[0219] 术语“反复性流产”或“习惯性流产”(可互换使用)发生在约1％的育龄妇女中，她们没能成功地在三个或更多个孕期中怀孕，并且怀孕在妊娠的12周前终止。因为胚胎附着和在子宫中的早期着床是受局部激素环境的精密控制的，所以内分泌紊乱经常关联到早期妊娠的失败，虽然诸多的因素可导致类似的临床现象。通过雌激素和孕酮的刺激，子宫在着床前期间中经历重要的发育变化。由CL分泌的孕酮对于成功着床和延续怀孕是重要的。因此，与CL分泌孕酮不足相关的条件有可能负面地影响怀孕的结果。
[0220] 如本文所用的术语“药团”是化合物的施用，这种给予将其在血液、血清或血浆中的浓度升高到有效水平。可通过任何施用途径给予这种施用，包括口服、吸入、静脉内施用、通过肌内、鞘内或皮下注射。
[0221] 如本文所用的术语“促性腺激素”是属于异二聚糖蛋白一组的天然存在的激素，包括促卵泡激素(FSH)、促黄体激素(LH)和绒膜促性腺激素(CG)，如人绒膜促性腺激素。这些激素调节男性和女性的性腺功能。这些天然存在的激素中的每一种由两个非共价连接的亚基组成：α-亚基和β-亚基，前者是FSH、LH和hCG所共有的，后者对它们中的每一种来说是独特的，并且对每种激素赋予生物特异性。在所有天然存在的促性腺激素中，每个亚基具有天冬酰胺-连接(N-连接)的寡糖侧链。在人类激素共有的α-亚基中，这些附接在位置52和78(SEQ ID NO:1)。在人FSH和hCG两者中，两个N-连接的寡糖侧链在FSH中的位置7和24附接至β-亚基(SEQ ID NO:10)。
[0222] 本发明优选的促性腺激素的α链选自与SEQ ID NO 1、2或3具有至少80％、更优选85％、更优选90％、更优选95％的序列同一性的序列。优选地，变体在SEQ ID NO 1的位置和间距处包含保守的半胱氨酸残基。在特别优选的实施方案中，促性腺激素包含具有SEQ ID NO 1的人α-亚基。
[0223] 如同所有的糖蛋白，寡糖结构的变化发生在促性腺激素中，产生一系列见于垂体腺内和循环中的亚型。此外，通过唾液酸的末端碳水化合物“封端”的程度有不同。亚型可以根据其电荷而被分开，这在很大程度上是由唾液酸化N-连接的寡糖的数目和分布决定的。高度唾液酸化的形式将具有较酸性的pH，并且被称为“酸性的”。唾液酸化较低的形式具有相对较高的pH并被称为“碱性的”。
[0224] 由于其结构差异的原因，促性腺激素亚型在它们结合靶细胞受体的能力方面有所不同。唾液酸化的程度影响它们在循环中存活的能力。例如，在FSH的情况下，高度酸性/唾液酸化的亚型在动物模型中具有显著较长的血浆半衰期。
[0225] 天数-本发明的方案开始于月经周期中的某一点。月经周期的第1天为月经的首日。当指刺激方案的天数时，第1天是施用第一剂量的FSH的那天。刺激方案的第2天是后面的那天，等等。在黄体阶段，天数是从排卵那天或者从取得卵母细胞的那天计算的。
[0226] 卵泡尺寸-可通过卵泡体积的妇科超声检查测量卵巢功能。采用超声检查例行地测量卵泡直径。现在，也可以快速地测量卵泡体积，并自动地形成三维重建的超声图像(Salama S,Arbo E,Lamazou F,Levailllant JM,Frydman R,Fanchin R(2010年4月)。Reproducibility and reliability of automated volumetric measurement of single preovulatory follicles using SonoAVC”.Fertil.Steril.93(6):2069-73)。
[0227] 尿源或尿的。这两个术语可互换使用。所述术语是指由尿纯化的促性腺激素的来源。
[0228] 在本发明的上下文中，如本文所用的术语“不孕症治疗”意指帮助无生育能力的夫妇中的妇女或单独妇女怀孕的方法。
[0229] 在本发明的上下文中，如本文所用的术语“促进生育能力”意指提高夫妇、妇女或男人生育能力的方法。
[0230] 在本发明的上下文中，如本文所用的术语“哺乳动物受试者”、“哺乳动物”或“哺乳动物的”(这些术语在整个说明书中可互换使用)意指任何哺乳动物，如人、母牛、猪、马、绵羊、狗、猫和山羊。
[0231] 在描述本发明的上下文中使用的术语“一个(种)”(a，an)和“该(所述)”以及类似的指代应被解释为涵盖单数和复数两种情况，除非本文指出另外的情况或者与上下文明显互相矛盾。
[0232] 如本文所用的“有效量”的LH化合物意指要施用的LH化合物足以促进哺乳动物的生育能力或治疗有需要的哺乳动物的不育症。足够做到这一点的量被定义为“有效量”。每一目的的有效量将取决于病症的严重程度以及受试者的体重和一般状态。要理解的是，采用例行的实验，通过构建数值的矩阵，并测试矩阵中的不同点，由此可确定适当的剂量，这都在受过训练的医师或兽医所掌握的普通技能范围内。hCG施用的典型剂量为每日50-500IU或者是会提供类似的生物效应的LH化合物的剂量。
[0233] 如本文所用的“有效量”的修饰的LH意指要施用的修饰的LH的量足以在哺乳动物雌性受试者的无排卵治疗中帮助诱导卵泡发育，如少量卵泡生成或单一卵泡生成，或者在有需要的哺乳动物雌性受试者的月经周期的卵泡阶段中诱导COS。因为如本文所述，修饰的LH旨在与FSH结合使用，所以修饰的LH将与FSH一起“帮助”进行这种治疗。足够做到这一点的量被定义为“有效量”。每一目的的有效量将取决于病症的严重程度以及受试者的体重和一般状态。要理解的是，采用例行的实验，通过构建数值的矩阵，并测试矩阵中的不同点，由此可确定适当的剂量，这都在受过训练的医师或兽医所掌握的普通技能范围内。hFSH施用的典型剂量为每日50-500IU或者是会提供类似的生物效应的具有FSH活性的分子剂量。
[0234] 如本文所用的术语“酰化基团”意指R-(C＝O)-基团，其中R选自直链或支链的饱和或不饱和碳链，任选包含一个或多个O、N、S或P，如直链或支链烷烃羧酸。合适酰化基团的各种例子描述在WO2006/037810、WO00/34331、WO2006/097537、WO2011/080103中。在特定的例子中，合适的酰化基团具有结构CH3(CH2)nCO-，其中n是4至40，例如8至22，如选自以下的酰化基团：CH3(CH2)8CO-、CH3(CH2)9CO-、CH3(CH2)10CO-、CH3(CH2)11CO-、CH3(CH2)12CO-、CH3(CH2)13CO-、CH3(CH2)14CO-、CH3(CH2)15CO-、CH3(CH2)16CO-、CH3(CH2)17CO-、CH3(CH2)18CO-、CH3(CH2)19CO-、CH3(CH2)20CO-、CH3(CH2)21CO-和CH3(CH2)22CO-。合适酰化基团的进一步的例子具有结构HOOC-(CH2)nCO-，其中n是4至40，例如12至20，典型的有HOOC-(CH2)14CO-、HOOC-(CH2)15CO-、HOOC-(CH2)16CO-、HOOC-(CH2)17CO-和HOOC-(CH2)18CO-。关于酰化基团的进一步例子，还参见US5905140。
[0235] 如本文涉及修饰的LH所用的术语“治疗”(treatment，treating)意指为了在哺乳动物雌性受试者的无排卵治疗中诱导卵泡发育或者在哺乳动物雌性受试者的月经周期的卵泡阶段中诱导COS的目的而管理和护理患者。
[0236] 如本文涉及LH化合物所用的术语“治疗”(treatment，treating)意指为治疗不育症或促进生育能力的目的而管理和护理患者。要治疗的患者优选为哺乳动物；特别是人，但也可以包括动物，如狗、猫、马、母牛、绵羊和猪。
具体实施方式
[0237] 长效生物学活性促黄体激素化合物
[0238] 本发明涉及包含连接至药学上可接受的分子的LH激动剂的长效生物学活性LH化合物，其中与ART程序有关的LH化合物的施用可进行一次或两次，特别是在卵泡阶段期间。相较目前的ART程序，这是相当具有优点的，并且导致不育症治疗的改进。
[0239] 此外，本发明涉及包含连接至药学上可接受的分子的LH激动剂的长效生物学活性LH化合物，其中可以按有规律的间隔进行与ART程序有关的LH化合物的施用，以维持黄体和妊娠阶段支持。相较目前的ART程序，这是相当具有优点的，并且导致不育症治疗的改进。
[0240] 在广泛的方面中，本发明涉及连接至药学上可接受的分子的LH激动剂的长效生物学活性LH化合物，与按同LH化合物相同的方式施用的LH激动剂的体内血浆半衰期相比，所述药学上可接受的分子提供大幅度增加的LH激动剂或LH化合物的体内血浆半衰期。
[0241] 在另一广泛的方面中，本发明涉及包含连接至药学上可接受的分子的LH激动剂的长效生物学活性LH化合物，与内源性CG的体内血浆半衰期相比，所述药学上可接受的分子提供大幅度增加的LH激动剂或LH化合物的体内血浆半衰期。
[0242] 在又进一步的方面中，本发明涉及长效生物学活性促黄体激素(LH)化合物，其包含连接至药学上可接受的分子的哺乳动物CG或其类似物或者哺乳动物LH或其类似物，所述药学上可接受的分子选自结合至哺乳动物新生儿Fc受体的分子、转铁蛋白和其中n是8至22的CH3(CH2)nCO-以及聚合物。
[0243] 在一个实施方案中，药学上可接受的分子选自结合至哺乳动物新生儿Fc受体的分子。
[0244] 在进一步的实施方案中，药学上可接受的分子选自白蛋白，如人白蛋白、重组人白蛋白、对哺乳动物FcRn结合增加的修饰的人白蛋白、对哺乳动物FcRn结合增加的修饰的重组白蛋白。通常，药学上可接受的分子选自重组人白蛋白(SEQ ID NO 20)。通常，药学上可接受的分子选自重组K573P人白蛋白(SEQ ID NO 21)。
[0245] 在又进一步的实施方案中，药学上可接受的分子选自哺乳动物抗体的Fc片段，如哺乳动物抗体的重组Fc片段。通常，药学上可接受的分子选自SEQ ID NO 22。
[0246] 在进一步的实施方案中，药学上可接受的分子选自哺乳动物抗体的Fc片段的变体，如哺乳动物抗体的Fc片段的重组变体。通常，药学上可接受的分子选自与SEQ ID NO 22具有至少80％同一性的序列，如至少90％同一性，如至少95％同一性，不包括SEQ ID NO.22。
[0247] 在进一步的实施方案中，LH激动剂可选自有机小分子、肽、多肽、蛋白质，并且可通过合成方法、重组手段产生或者由组织或血液获得。在特定的实施方案中，LH激动剂是非哺乳动物来源的。在另一特定的实施方案中，LH激动剂是哺乳动物来源的，如通过重组手段获得的蛋白质。
[0248] 在又进一步的实施方案中，哺乳动物CG或其类似物或者哺乳动物LH或其类似物选自重组哺乳动物CG或其类似物或者重组哺乳动物LH或其类似物。
[0249] 在进一步的实施方案中，LH激动剂选自哺乳动物CG或哺乳动物LH。当LH激动剂是哺乳动物CG时，其通常为灵长类动物CG，例如人CG或猿CG或猴CG，但也可选自其它哺乳动物物种，如马科动物CG，例如马CG。当LH激动剂是哺乳动物LH时，其通常为灵长类动物LH，如人LH、猿LH或猴LH；母牛LH的序列；猪LH的序列；马科动物LH的序列，如马LH；绵羊LH的序列；狗LH的序列；猫LH的序列；和山羊LH的序列。通常，LH激动剂是人CG。
[0250] 在进一步的实施方案中，LH激动剂选自哺乳动物CG的类似物或哺乳动物LH的类似物。当LH激动剂是哺乳动物CG的类似物时，该类似物与绒膜促性腺激素的相应哺乳动物序列具有至少80％同一性，如85％同一性、90％同一性、95％同一性、98％同一性。通常，LH激动剂是与绒膜促性腺激素的相应人序列具有至少80％同一性的人CG的类似物，如85％同一性、90％同一性、95％同一性、98％同一性。当LH激动剂是哺乳动物LH的类似物时，该类似物与促黄体激素的相应哺乳动物序列具有至少80％同一性，如85％同一性、90％同一性、95％同一性、98％同一性。通常，LH激动剂是与促黄体激素的相应人序列具有至少80％同一性的人LH的类似物，如85％同一性、90％同一性、95％同一性、98％同一性。
[0251] 当LH激动剂选自多肽或蛋白质时，如哺乳动物CG的类似物或哺乳动物LH的类似物，它可以被糖基化。通常，LH激动剂是被糖基化的hCG。
[0252] 也可以是像这样的LH化合物被糖基化，并且糖基化可以在LH激动剂上，或者在药学上可接受的分子上(当所述分子选自多肽或蛋白质，如人白蛋白时)。
[0253] 可以按多种方式将LH激动剂连接至药学上可接受的分子，如直接通过价键，或者间接地通过连接子，该连接子通常为双官能连接子，虽然它也可以是多官能连接子，在进一步的实施方案中，连接子选自化学连接子、糖部分、二硫桥、融合连接子、亲水连接子、可水解的连接子。在进一步的实施方案中，LH激动剂通过肽连接子融合至药学上可接受的分子。在又进一步的实施方案中，LH激动剂直接融合至药学上可接受的分子，以便通过由宿主细胞(如CHO细胞或酵母细胞)表达LH化合物来产生一种多肽或蛋白质。在进一步的实施方案中，LH激动剂通过稳定的连接子连接至药学上可接受的分子。在另一实施方案中，LH激动剂通过不稳定的连接子连接至药学上可接受的分子。
[0254] 因此，可以采用现有技术中熟知的技术，按多种方式将LH激动剂连接至药学上可接受的分子，并且本发明还包括其中一种或多种LH激动剂连接至一种或多种药学上可接受的分子的情况，如两种LH激动剂连接至一种药学上可接受的分子，或者一种LH激动剂连接至两种药学上可接受的分子。在进一步的实施方案中，LH激动剂连接至一种或两种药学上可接受的分子，优选一种药学上可接受的分子。
[0255] 在进一步的实施方案中，哺乳动物CG或其类似物或者哺乳动物LH或其类似物连接至药学上可接受的分子，并且其中连接子选自化学连接子，任选双官能连接子。通常，化学连接子选自糖部分、二硫桥、亲水连接子、可水解的连接子、二羧酸、羧酸酰肼、马来酰亚胺基酰肼、PDPH、SPDP、LC-SPDP、GMBS、烷基连接子和PEG连接子。在又进一步的实施方案中，化学连接子选自丁二酸、戊二酸、己二酸、N-[马来酰亚胺基己酸]酰肼(EMCH)、N-[马来酰亚胺基丙酸]酰肼(MPH或BMPH)、4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧基酰肼、N-[k-马来酰亚胺基十一烷酸]酰肼(KMUH)、4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)、NHS-3-马来酰亚胺基丙酸酯琥珀酰亚胺酯(MPS-EDA)、缀合至巯基反应蛋白的(3-[2-吡啶基二硫代]丙酰肼)、N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸酯(LC-SPDP)、N-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯(GMBS)、具有2-5个碳原子的羧酸酰肼、-NH-(CH2)m-C(O)-，其中m是2-20的整数，它们任选被非空间位阻基团取代，如C1-C6烷基、C1-C6酰基、卤素(例如，Cl、Br)、CN、NH2或苯基。
[0256] 在进一步的实施方案中，哺乳动物CG或其类似物或者哺乳动物LH或其类似物直接化学连接至药学上可接受的分子。
[0257] 在进一步的实施方案中，药学上可接受的分子连接至哺乳动物CG或其类似物或者哺乳动物LH或其类似物的α链。
[0258] 在进一步的实施方案中，药学上可接受的分子连接至哺乳动物CG或其类似物或者哺乳动物LH或其类似物的β链。
[0259] 在又进一步的实施方案中，哺乳动物CG或其类似物或者哺乳动物LH或其类似物融合至药学上可接受的分子，所述药学上可接受的分子选自结合至哺乳动物新生儿Fc受体的分子，如白蛋白、哺乳动物抗体的Fc片段或哺乳动物抗体的Fc片段的变体，任选通过肽连接子。
[0260] 在进一步的实施方案中，肽连接子具有至少1个氨基酸，如1-200个氨基酸，通常1-50个氨基酸，其中氨基酸选自二十种天然存在的氨基酸。通常，肽连接子具有1-40个氨基酸，如1-30、如1-20、如1-10个氨基酸。
[0261] 在进一步的实施方案中，肽连接子选自由选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸的氨基酸组成的连接子。通常，肽连接子由大多数无空间位阻的氨基酸(如甘氨酸和丙氨酸)组成。特别地，肽连接子包含选自-(G)n-、(GGS)n或(GGGGS)n的序列，其中n是1-50的整数。通常n是选自1-10的整数，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
[0262] 在进一步的实施方案中，肽连接子选自GGG、SGGSGGS(SEQ ID NO:58)、GGSGGSGGSGGSGGG(SEQ ID NO:59)、GGSGGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID N0:60)、
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID N0:57)和EFAGAAAV(SEQ ID N0:56)。
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID N0:57)和EFAGAAAV(SEQ ID N0:56)。
[0263] 在另一实施方案中，哺乳动物CG或其类似物或者哺乳动物LH或其类似物直接融合至药学上可接受的分子。
[0264] 在进一步的实施方案中，药学上可接受的分子融合至哺乳动物CG或其类似物的N-末端。
[0265] 在又进一步的实施方案中，药学上可接受的分子融合至哺乳动物LH或其类似物的N-末端。
[0266] 在进一步的实施方案中，药学上可接受的分子融合至哺乳动物CG或其类似物的α链的N-末端。
[0267] 在又进一步的实施方案中，药学上可接受的分子融合至哺乳动物LH或其类似物的α链的N-末端。
[0268] 在进一步的实施方案中，药学上可接受的分子融合至哺乳动物CG或其类似物的β链的N-末端。
[0269] 在又进一步的实施方案中，药学上可接受的分子融合至哺乳动物LH或其类似物的β链的N-末端。
[0270] 在进一步的实施方案中，药学上可接受的分子融合至哺乳动物CG或其类似物的C-末端。
[0271] 在又进一步的实施方案中，药学上可接受的分子融合至哺乳动物LH或其类似物的C-末端。
[0272] 在进一步的实施方案中，药学上可接受的分子融合至哺乳动物CG或其类似物的α链的C-末端。
[0273] 在又进一步的实施方案中，药学上可接受的分子融合至哺乳动物LH或其类似物的α链的C-末端。
[0274] 在进一步的实施方案中，药学上可接受的分子融合至哺乳动物CG或其类似物的β链的C-末端。
[0275] 在又进一步的实施方案中，药学上可接受的分子融合至哺乳动物LH或其类似物的β链的C-末端。
[0276] 在进一步的实施方案中，哺乳动物CG或其类似物或者哺乳动物LH或其类似物选自一种哺乳动物CG或其类似物。通常是一种hCG。
[0277] 在又进一步的实施方案中，哺乳动物CG或其类似物或者哺乳动物LH或其类似物选自一种哺乳动物LH或其类似物。通常是一种hLH。
[0278] 在进一步的实施方案中，哺乳动物CG或其类似物或者哺乳动物LH或其类似物选自两种哺乳动物CG或其类似物。通常是两种hCG。
[0279] 在又进一步的实施方案中，哺乳动物CG或其类似物或者哺乳动物LH或其类似物选自两种哺乳动物LH或其类似物。通常是两种hLH。
[0280] 在进一步的实施方案中，药学上可接受的分子选自一种药学上可接受的分子。通常是一种白蛋白或一种Fc片段或Fc片段的一种变体。
[0281] 在又进一步的实施方案中，药学上可接受的分子选自两种药学上可接受的分子。通常是两种白蛋白或两种Fc片段或Fc片段的两种变体或它们的组合。
[0282] 本发明优选的LH化合物选自缀合物l(hCG-PDPH-rHA缀合物)、缀合物3(hCG-SPDP-rHA缀合物)、缀合物4(EDC活化的hCG-PDPH-rHA缀合物)、缀合物3V1(hCG-SPDP-rHA-K573P缀合物)和缀合物4V1(EDC活化的hCG-PDPH-rHA-K573P缀合物)。
[0283] 本发明其它优选的LH化合物选自由SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 26构成的产品2、由SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 28构成的产品3、由SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 27构成的产品4、由SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 29构成的产品5、由SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 26构成的产品7、由SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 30构成的产品8、由SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 27构成的产品9、由SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 31构成的产品10、由SEQ ID NO 32和SEQ ID NO 33构成的产品11、由SEQ ID NO 32和SEQ ID NO 34构成的产品12、由SEQ ID NO 32和SEQ ID NO
61构成的产品13以及由SEQ ID NO 32和SEQ ID NO 62构成的产品14。
61构成的产品13以及由SEQ ID NO 32和SEQ ID NO 62构成的产品14。
[0284] 有关ART程序，为了产生可施用一次或两次的LH化合物，这种LH化合物在对哺乳动物施用时应导致LH激动剂或LH化合物体内血浆半衰期增加至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍，如1.5倍至25倍。
[0285] 在进一步的实施方案中，LH激动剂具有的体内血浆半衰期为至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天，9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天，18天、19天，如2至20天。在进一步的实施方案中，LH化合物具有的体内血浆半衰期为至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天，9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天，18天、19天，如2至20天。
[0286] 在进一步的实施方案中，药学上可接受的分子提供LH激动剂或LH化合物的生物体组合物或浓度，其足以驱动窦状卵泡从直径约10mm直到排卵前阶段(即直径约15-30mm)，在此阶段成熟中的卵母细胞可完成成熟，以为减数分裂的恢复做好准备。
[0287] 在又进一步的实施方案中，药学上可接受的分子提供LH激动剂或LH化合物的生物体组合物或浓度，其足以驱动雄性后代出生后约1年的早期少年及青春期雌性和雄性受试者的雄激素产生。
[0288] 在进一步的实施方案中，药学上可接受的分子提供LH激动剂或LH化合物的生物体组合物或浓度，其足以支持促性腺激素分泌不足的性腺低能受试者。
[0289] 在又进一步的实施方案中，药学上可接受的分子提供LH激动剂或LH化合物的生物体组合物或浓度，其足以维持哺乳动物受试者围排卵阶段、排卵阶段和排卵后阶段中的孕酮，目的是调节子宫内膜和子宫以允许哺乳动物胚泡的着床。
[0290] 在进一步的实施方案中，药学上可接受的分子提供LH激动剂或LH化合物的生物体组合物或浓度，其足以维持哺乳动物受试者围排卵阶段、排卵阶段和排卵后阶段中的孕酮，目的是为着床准备子宫内膜和子宫。
[0291] 在又进一步的实施方案中，当在月经周期的卵泡阶段期间与FSH治疗有关地给予注射时，优选开始FSH治疗后5-10天，药学上可接受的分子提供LH激动剂或LH化合物的血浆浓度以支持CL的形成和维持。
[0292] 在进一步的实施方案中，在月经周期的卵泡阶段期间与FSH治疗有关地注射后，优选开始FSH治疗5-10天后，药学上可接受的分子提供LH激动剂或LH化合物的浓度以刺激由CL释放足够的孕酮。
[0293] 在又进一步的实施方案中，药学上可接受的分子结合至新生儿Fc受体(FcRn)，如pH依赖性结合，其允许LH化合物避开溶酶体降解，如Roopenian et.al.,"FcRn:the neonatal Fc receptor comes of age",Nature reviews,Immunology,vol.7,p.715.725,sept.2007中所述。
[0294] 结合至FcRn的典型药学上可接受的分子选自白蛋白，如对FcRn结合增加的修饰的白蛋白、人白蛋白或重组人白蛋白。
[0295] 在进一步的实施方案中，药学上可接受的分子选自有机小分子、肽、寡肽、多肽、蛋白质、受体、糖基化、酰化基团、糖、聚合物(例如聚乙二醇，PEG)、核酸(例如DNA和RNA)以及激素中的任一种。通常，药学上可接受的分子(不限于)选自哺乳动物抗体的Fc片段、转铁蛋白、白蛋白(如人白蛋白)、重组白蛋白、白蛋白的变体；酰化基团，如CH3(CH2)nCO-，其中n是8至22；或聚合物，如PEG，例如分子量为至少5kDa的PEG，如10kDa至150kDa，通常为10至40kDa。
[0296] 在进一步的实施方案中，药学上可接受的分子选自聚合物，如PEG。通常，PEG部分可具有选自500Da至200.000Da范围的平均大小，如500Da至100.000Da，如2000Da至50.000Da。
[0297] 本发明进一步的方面涉及包含本发明的LH化合物和任选药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。通常，药物组合物用于注射，如皮下注射。
[0298] 与ART程序有关，在不育症治疗中或者在促进生育能力中可同时地或顺序地施用不止一种药剂。因此，在用于不育症治疗的ART程序(如IVF或ICSI)中或者在促进生育能力中，使用本发明的LH化合物与一种或多种通常用于不育症治疗或促进生育能力的其它治疗活性化合物相结合，这是在本发明范围内的。通过类比，在生产用于不育症治疗或促进生育能力的药剂中，使用本发明的LH化合物与通常用于所述不育症治疗或促进生育能力的其它治疗活性化合物相结合，这也在本发明的范围内。
[0299] 本发明进一步的方面涉及本发明的LH化合物，用于哺乳动物受试者的不育症治疗或促进生育能力，如辅助生育技术治疗，例如IVF或ICSI治疗或睾丸的降下不良。
[0300] 本发明进一步的方面涉及本发明的LH化合物，用于雌性哺乳动物中的辅助生育治疗方法，其中在卵泡阶段期间按一次、两次、三次或四次剂量施用LH化合物，该剂量足以支持卵泡发育。可以单次团注施用LH化合物。在一个实施方案中，剂量也足以提供黄体支持。
[0301] 本发明又进一步的方面涉及本发明的LH化合物，用于雌性哺乳动物中的辅助生育治疗方法，其中在黄体阶段期间按一次、两次、三次或四次剂量施用LH化合物，至少直到排卵后2周。可以单次团注施用LH化合物。在一个实施方案中，排卵后首次施用LH化合物。
[0302] 本发明进一步的方面涉及本发明的LH化合物，用于雌性哺乳动物中的辅助生育治疗方法，其中在妊娠阶段期间按一次、两次、三次或四次剂量施用LH化合物，至少直到排卵后2周。可以单次团注施用LH化合物。在一个实施方案中，排卵后首次施用LH化合物。
[0303] 本发明又进一步的方面涉及本发明的LH化合物，用于雌性哺乳动物中治疗反复性流产的方法，其中在早期妊娠期间按一次、两次、三次或四次剂量施用LH化合物，直到直到怀孕后12周。可以单次团注施用LH化合物。在一个实施方案中，排卵后首次施用LH化合物。
[0304] 本发明进一步的方面涉及本发明的LH化合物，用于增加孕酮产生和优化成功怀孕机会的方法，其中在妊娠的头12周期间按一次、两次、三次或四次剂量施用LH化合物。可以单次团注施用LH化合物。在一个实施方案中，排卵后首次施用LH化合物。
[0305] 本发明进一步的方面涉及本发明的LH化合物，用于雌性哺乳动物中的辅助生育治疗方法，其中与排卵诱导有关地按一次或两次剂量施用LH化合物。可以单次团注施用LH化合物。
[0306] 与排卵引发有关，可以采用各种治疗方案。在一个实施方案中，将GnRH激动剂用于排卵引发。在另一实施方案中，将hCG用于排卵引发。
[0307] 本发明进一步的方面涉及本发明的LH化合物，用于促进生育能力或治疗促性腺激素分泌不足的性腺低能雄性哺乳动物受试者的不育症。
[0308] 本发明又进一步的方面涉及本发明的LH化合物，用于促进生育能力或治疗患有隐睾症的年轻或年少雄性哺乳动物受试者的不育症。
[0309] 本发明又进一步的方面涉及哺乳动物受试者的不育症治疗方法，包括对有需要的哺乳动物施用有效量的本发明的LH化合物。
[0310] 本发明进一步的方面涉及促进哺乳动物受试者生育能力的方法，包括对有需要的哺乳动物施用有效量的本发明的LH化合物。
[0311] 在进一步的实施方案中，哺乳动物受试者选自人、母牛、猪,a马、绵羊、狗、猫和山羊，通常为人受试者。
[0312] 在进一步的方面中，本发明涉及制备包含连接至药学上可接受的分子的LH激动剂的长效生物学活性促黄体激素(LH)化合物(如本发明在本文公开的任一种缀合物)的方法，该方法包括使LH激动剂与附接至药学上可接受的分子的连接子反应，或者使LH激动剂与连接子反应，并然后将所述连接子附接至药学上可接受的分子，或者使连接子与药学上可接受的分子反应，并然后使LH激动剂与附接至药学上可接受的分子的连接子反应，或者通过由宿主细胞表达LH激动剂和药学上可接受的分子。
[0313] 长效修饰的哺乳动物LH
[0314] 本发明涉及长效修饰的哺乳动物LH，例如连接至(例如融合至)白蛋白或缀合至酰化基团或PEG的人LH，其激动和激活哺乳动物中的LH受体，并提供哺乳动物LH或其类似物或者修饰的LH的体内血浆半衰期，其在哺乳动物中为2至48小时。据信在卵泡阶段中或作为黄体阶段支持给予的修饰的LH改善患者方便性和治疗结果。
[0315] 此外，使用长效修饰的哺乳动物LH不会对将由着床胚胎分泌的高糖基化hCG施加的特定影响产生干扰，并且使患者有可能通过利用普通的怀孕测试尽早方便地检测到她是否怀孕。
[0316] 总的来说，这些研究结果表明，在长效修饰的哺乳动物LH制剂中，LH的特定效果在受体水平上得到保持，结合在循环中的稳定存在，这将能够优化月经周期的卵泡阶段中的COS，并因此优化最终治疗结果。
[0317] 在广泛的方面中，本发明涉及包含连接至药学上可接受的分子的哺乳动物LH或其类似物的修饰的LH，所述药学上可接受的分子提供哺乳动物LH或其类似物或者修饰的LH的体内血浆半衰期，其在哺乳动物中为2至48小时。
[0318] 本发明进一步的方面涉及包含连接至药学上可接受的分子的哺乳动物LH或其类似物的长效生物学活性促黄体激素(LH)化合物，所述药学上可接受的分子选自结合至哺乳动物新生儿Fc受体的分子、转铁蛋白和其中n是8至22的CH3(CH2)nCO-以及聚合物，与FSH或具有FSH活性的分子结合使用，用于同时、按顺序或分开使用，以在哺乳动物雌性受试者的无排卵治疗中诱导卵泡发育，如少量卵泡生成或单一卵泡生成，或者在哺乳动物雌性受试者的月经周期的卵泡阶段中诱导COS。
[0319] 在一个实施方案中，FSH在哺乳动物雌性受试者中是外源得到的。在另一实施方案中，FSH是在哺乳动物雌性受试者中内源产生的。
[0320] 在进一步的实施方案中，药学上可接受的分子选自结合至哺乳动物新生儿Fc受体的分子，如白蛋白，例如人白蛋白、重组人白蛋白、对哺乳动物FcRn结合增加的修饰的人白蛋白、对哺乳动物FcRn结合增加的修饰的重组白蛋白；哺乳动物抗体的Fc片段，如哺乳动物抗体的重组Fc片段；和哺乳动物抗体的Fc片段的变体。
[0321] 在进一步的实施方案中，药学上可接受的分子提供哺乳动物LH或其类似物或者修饰的LH的体内血浆半衰期，其在哺乳动物雌性受试者中为2至48小时。
[0322] 在进一步的实施方案中，哺乳动物LH具有的体内血浆半衰期为至少3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时，如4至48小时、5至40小时、6至36小时、7至30小时、8至28小时、9至26小时或10至24小时，通常为6至8小时。在进一步的实施方案中，修饰的LH具有的体内血浆半衰期为至少3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时，如4至48小时、5至40小时、6至36小时、
7至30小时、8至28小时、9至26小时或10至24小时，通常为6至8小时。
7至30小时、8至28小时、9至26小时或10至24小时，通常为6至8小时。
[0323] 在对哺乳动物施用修饰的LH时，重要的是达到足够的体内血浆浓度，并保持提供在哺乳动物雌性受试者的无排卵治疗中诱导卵泡发育或在哺乳动物雌性受试者的月经周期的卵泡阶段中诱导COS效果所需的时间。在进一步的实施方案中，本发明的修饰的LH在哺乳动物中提供2至30IU/L范围内的修饰的LH、哺乳动物LH或其混合物的体内血浆浓度，如2至4IU/L、4至8IU/L、8至14IU/L、14至20IU/L或20至30IU/L。
[0324] 哺乳动物LH或其类似物以是重组的或合成的，或者是它们的组合，并且可以通过合成方法制备，如标准的化学方法，包括通过自动化程序合成，或者通过重组手段，或者由尿、组织或血液获得。在进一步的实施方案中，哺乳动物LH是重组LH。在又进一步的实施方案中，哺乳动物LH是重组人LH(rhLH)。
[0325] 在进一步的实施方案中，哺乳动物LH可选自人LH的序列、母牛LH的序列、猪LH的序列、马LH的序列、绵羊LH的序列、狗LH的序列、猫LH的序列和山羊LH的序列。
[0326] 在又进一步的实施方案中，哺乳动物LH类似物是重组LH。可通过重组手段产生的哺乳动物LH类似物通常选自这样的哺乳动物LH的类似物，其中该类似物与LH的相应哺乳动物序列具有至少80％同一性，如85％同一性、90％同一性、95％同一性、98％同一性。比如，哺乳动物LH类似物选自人LH的类似物，其中该类似物与LH的人序列具有至少80％同一性，如85％同一性、90％同一性、95％同一性、98％同一性。或者哺乳动物LH类似物选自马LH的类似物，其中该类似物与LH的马序列具有至少80％同一性，如85％同一性、90％同一性、95％同一性、98％同一性。
[0327] 按本发明使用的哺乳动物LH或哺乳动物LH的类似物可以是糖基化的。通常，哺乳动物LH或类似物是糖基化的，如被糖基化的hLH。
[0328] 也可以是像这样的修饰的LH被糖基化，并且糖基化可以在哺乳动物LH上，或者在药学上可接受的分子上(当所述分子选自多肽或蛋白质，如人白蛋白时)。可以按多种方式将哺乳动物LH或其类似物连接至药学上可接受的分子，如直接通过价键，或者间接地通过连接子，该连接子通常为双官能连接子，虽然它也可以是多官能连接子。在进一步的实施方案中，连接子选自化学连接子、糖部分、二硫桥、融合连接子、亲水连接子、可水解的连接子。在进一步的实施方案中，哺乳动物LH或其类似物通过肽连接子融合至药学上可接受的分子。在又进一步的实施方案中，哺乳动物LH或其类似物直接融合至药学上可接受的分子，以便通过由宿主细胞(如CHO细胞或酵母细胞)表达修饰的LH来产生一种多肽或蛋白质。在进一步的实施方案中，哺乳动物LH或其类似物通过稳定的连接子连接至药学上可接受的分子。在另一实施方案中，哺乳动物LH或其类似物通过不稳定的连接子连接至药学上可接受的分子。
[0329] 因此，可以采用现有技术中熟知的技术，按多种方式将哺乳动物LH或其类似物连接至药学上可接受的分子，并且本发明还包括其中一种或多种哺乳动物LH或其类似物连接至一种或多种药学上可接受的分子的情况，如两种哺乳动物LH或其类似物连接至一种药学上可接受的分子，或者一种哺乳动物LH或其类似物连接至两种药学上可接受的分子。在进一步的实施方案中，哺乳动物LH或其类似物连接至一种或两种药学上可接受的分子，如一种药学上可接受的分子。
[0330] 在又进一步的实施方案中，药学上可接受的分子结合至新生儿Fc受体(FcRn)，如pH依赖性结合，其允许修饰的LH避开溶酶体降解，如Roopenian et.al.,"FcRn:the neonatal Fc receptor comes of age",Nature reviews,Immunology,vol.7,p.715.725,sept.2007中所述。
[0331] 结合至FcRn的典型药学上可接受的分子选自白蛋白，如对FcRn结合增加或减少的修饰的白蛋白、人白蛋白或重组人白蛋白。
[0332] 在进一步的实施方案中，药学上可接受的分子选自有机小分子、肽、寡肽、多肽、蛋白质、受体、糖基化、酰化基团、糖、聚合物(例如聚乙二醇，PEG)、核酸(例如DNA和RNA)以及激素中的任一种。通常，药学上可接受的分子(不限于)选自哺乳动物抗体的Fc片段、转铁蛋白、白蛋白(如人白蛋白)、重组白蛋白、白蛋白的变体；酰化基团，如CH3(CH2)nCO-，其中n是8至22；或聚合物，如PEG，例如分子量为至少5kDa的PEG，如10kDa至150kDa，通常为10至40kDa。
[0333] 本发明进一步的方面涉及包含本发明的修饰的LH和任选药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
[0334] 与ART程序有关，并且特别是与本文所讲解的诱导卵泡发育或COS有关，可同时地或顺序地施用不止一种药剂。因此，在用于不育症治疗的ART程序(如诱导COS)中或者在促进生育能力中，使用本发明的修饰的LH与一种或多种通常用于不育症治疗或促进生育能力的其它治疗活性化合物相结合，这是在本发明范围内的。
[0335] 在进一步的方面中，本发明涉及包含连接至药学上可接受的分子的哺乳动物LH或其类似物的修饰的LH，所述药学上可接受的分子提供哺乳动物LH或其类似物或者修饰的LH的体内血浆半衰期，其在哺乳动物中为2至48小时，以与FSH或具有FSH活性的分子结合使用，用于同时、按顺序或分开使用以在哺乳动物雌性受试者的无排卵治疗中诱导卵泡发育，或者在哺乳动物雌性受试者的月经周期的卵泡阶段中诱导COS。在一个实施方案中，FSH选自哺乳动物的FSH，如人FSH，特别是重组FSH，例如rhFSH。在特定的实施方案中，FSH选自保妊康、果纳芬、依诺娃、Fostinorm、Bravelle、美诺孕。
[0336] 在进一步的实施方案中，本发明的修饰的LH与FSH或具有FSH活性的分子的组合是要在哺乳动物雌性受试者的无排卵治疗中诱导卵泡发育，如少量卵泡生成或单一卵泡生成。在又进一步的实施方案中，本发明的修饰的LH与FSH或具有FSH活性的分子的组合是要在哺乳动物雌性受试者的月经周期的卵泡阶段中诱导COS。通常，在诱导卵泡发育或COS中，按20:1至1:20的IU比例范围(FSH:修饰的LH)施用本发明的修饰的LH和FSH或具有FSH活性的分子。在进一步的实施方案中，按18:1至1:18、15:1至1:15、12:1至1:12、9:1至1:9、5:1至1:5(如4:1至1:4)的IU比例范围施用FSH:修饰的LH。
[0337] 虽然如上所述可以同时、按顺序或分开施用FSH和修饰的LH，但通常是作为成套试剂盒或者作为药物组合物一起地组合施用，前者包含单独剂型的修饰的LH和FSH，这些剂型可以是相同的，例如试剂盒中的两个单独的注射剂，如皮下注射剂，后者包含本发明的修饰的LH和FSH或具有FSH活性的分子以及任选药学上可接受的载体或赋形剂。优选的是，皮下施用修饰的LH和FSH，优选进入前腹壁。用于胃肠外施用的制剂通常是无菌的。适于肠胃外施用的药物制剂包括水和非水无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与拟定哺乳动物受试者的血液等渗的溶质；可包括混悬剂及增稠剂的水和非水无菌混悬液也在本发明的范围内。制剂可存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，在临使用前，注射仅需添加无菌液体载体，例如水。可由无菌粉末、颗粒和片剂制备临时注射溶液和混悬液。可通过预填充针筒、自动注射器或多剂量自动注射器施用制剂。通常，提供LH化合物和FSH或具有FSH活性的分子以在药物组合物中同时使用。
[0338] 本发明又进一步的方面涉及在哺乳动物雌性受试者的无排卵治疗中诱导卵泡发育(如少量卵泡生成或单一卵泡生成)或者在哺乳动物雌性受试者的月经周期的卵泡阶段中诱导COS的方法，包括与FSH或具有FSH活性的分子相结合而同时、按顺序或分开地对有需要的哺乳动物施用有效量的本发明的修饰的LH。在进一步的实施方案中，FSH或具有FSH活性的分子选自哺乳动物的FSH，如人FSH，特别是重组FSH，例如rhFSH。
[0339] 在进一步的实施方案中，哺乳动物受试者选自人、母牛、猪、马、绵羊、狗、猫和山羊，通常为人受试者。
[0340] 在进一步的方面中，本发明涉及制备本发明的修饰的LH(如本发明的任一种本文公开的缀合物)的方法，该修饰的LH包含连接至药学上可接受的分子的哺乳动物LH或其类似物，所述药学上可接受的分子提供哺乳动物LH或其类似物或者修饰的LH的体内血浆半衰期，其在哺乳动物中为2至48小时，该方法包括使哺乳动物LH或其类似物与附接至药学上可接受的分子的连接子反应，或者使哺乳动物LH或其类似物与连接子反应，并然后将所述连接子附接至药学上可接受的分子，或者使连接子与药学上可接受的分子反应，并然后使哺乳动物LH或其类似物与附接至药学上可接受的分子的连接子反应，或者通过由宿主细胞表达哺乳动物LH或其类似物和药学上可接受的分子。
[0341] 本发明的方法
[0342] 图1a和1b描述现有技术中已知的受控卵巢刺激的方案。图1中的方案开始于在月经周期的第1-3天施用重组或尿FSH。按日剂量施用FSH直到排卵诱导。从约第6天施用GnRH拮抗剂以避免排卵诱导之前LH过早激增。通过施用5,000至10,000IU重组hCG的引发注射来诱导排卵。可选择性地通过GnRH激动剂引发来诱导排卵。这通常是当一至三个卵泡具有17mm的尺寸时进行。为了提供黄体支持，在胚胎转移的当天开始通过阴道或肌内施用孕酮。
孕酮施用持续至少直到刺激方案的第28天。在许多情况下，施用孕酮直到怀孕的第5周或甚至直到怀孕的第10周。
孕酮施用持续至少直到刺激方案的第28天。在许多情况下，施用孕酮直到怀孕的第5周或甚至直到怀孕的第10周。
[0343] 在图1b中，在第1-6天将日剂量的FSH替换成一个剂量的长效FSH(绒促卵泡素)。在第5-7天左右，绒促卵泡素的血清水平降低，并且给予日剂量的重组或尿FSH直到排卵引发。使用绒促卵泡素的优点在于，女性不需要在第2-5或6天就诊和接受FSH注射。
[0344] 图2a是根据本发明基于施用长效促性腺激素刺激方案的一个实施方案的示意图示。在此例中，在月经周期的第1-3天施用长效FSH，如绒促卵泡素α。在绒促卵泡素的例子中，剂量可以是每位女性100和150μg。选择剂量和血清半衰期以使得在卵泡阶段的后期FSH的血清水平减少，从而在卵泡阶段的晚期显著地减少进一步的卵泡募集。这是为了减少受刺激发育的卵泡数，从而减少OHSS的危险。
[0345] 如在已知方案中的那样，在刺激方案的第4-7天开始施用GnRH拮抗剂。通过在刺激方案的第6天或更早施用一个剂量的长效hCG来刺激卵泡发育。也可以使用长效LH。长效hCG或LH的剂量足以刺激卵泡发育，并且足够低以减少OHSS的危险。按给出的生物响应类似于以4-15IU/升血清水平所获得的响应的剂量施用长效hCG或LH。为进一步减少OHSS的危险，当至少一个卵泡具有至少15mm的直径时、优选当3个卵泡具有17mm的直径时采用GnRH激动剂引发注射以诱导排卵。当皮下施用或鼻内施用时，合适的剂量范围在0.1与1mg之间。可以通过如已知方案(在图2a中示出)中的那样施用孕酮或者通过如本文所描述和示出(图4a和4b)的那样施用LH激动剂来提供黄体阶段支持。
[0346] 图2b示出本发明的一项方案，其中通过从第1天施用重组或尿源FSH作为每日注射剂来刺激卵泡生成，直到大约第6天。FSH的优选日剂量为每天150-225IU。通过UV扫描和测量卵泡直径来确定停止FSH施用的确切日子。当至少一个卵泡已达到12-14mm直径时停止FSH施用，并施用单剂量的长效hCG或LH以刺激卵泡发育，如上文所述。卵母细胞诱导和黄体支持如图2a中所描述。在图2b的方案中，如对于图2a所描述的那样施用GnRH拮抗剂和激动剂。
[0347] 图2c示出本发明的一项方案，其中通过从大约第6天开始施用日剂量的FSH(如图2b中的那样)和日剂量的hCG或LH来刺激卵泡生成和卵泡发育。在卵泡阶段期间hCG的合适剂量包括每天25-400IU，如每天50-300IU，更优选每天100-300IU，如每天150-250IU，例如每天175—225IU。在图2c的方案中，如对于图2a所描述的那样施用GnRH拮抗剂和激动剂。这里没有示出黄体支持，但可以通过施用孕酮或施用LH/hCG提供，如图4a或4b中所描述的那样。
[0348] 在基于图3a示出的施用长效(长持续性)hCG或LH的可供选择的方案中，如对于图2b中的方案所描述的那样施用FSH、GnRH拮抗剂和GnRH激动剂。通过例如从卵泡阶段中的约第6天开始，以2-7天的间隔(以5天示出)施用长效hCG或LH，并持续至少直到怀孕测试，由此提供卵泡发育和黄体支持。在怀孕的情况下，可继续施用长效LH或hCG，直到怀孕的第5周，例如直到怀孕的第10周。在卵泡阶段期间长效hCG或LH的合适剂量是给出的生物响应类似于以4-15IU/升的血清水平获得的响应的剂量。
[0349] 在可供选择的方案中，在卵泡阶段期间并贯穿黄体阶段以日剂量施用重组或尿hCG或LH(图3b和3c)。图中示出了hCG施用，但同样可设想到施用LH。hCG的施用可开始于刺激的第6天，但同样可更早地开始，如在刺激的第2天。在卵泡阶段期间尿或重组hCG的合适剂量包括每天25-400IU，如每天50-300IU，更优选每天100-300IU，如每天150-250IU，例如每天175—225IU。在黄体阶段中，优选使用LH或LH类似物或变体，因为施用重组或尿hCG可能会导致生化怀孕误检测。大多数横向流装置怀孕测试依赖于尿hCG的检测。在黄体阶段中重组或尿hCG的合适剂量包括每天25-400IU hCG，优选每天50-200IU hCG，例如75-200IU/天，如100-150或120-170IU/天。
[0350] 图3c中的方案示出本发明的另一种方案，其中已从刺激方案的第2天施用hCG(或LH)。其它方面该方案与图3b的方案完全相同。也可以用长效hCG或长效LH实施图3b和3c中的方案的卵泡刺激，它们是在刺激方案第1、2或3天以单剂量施用的。
[0351] 图4a和4b示出根据本发明的黄体支持方案。根据示出的实施方案(图4a)，通过从大约卵母细胞收获之时施用日剂量的LH(或hCG)，并持续直到方案的第28天，由此提供黄体支持。用于黄体支持的重组或尿LH的优选剂量范围包括每天100-600IU LH的日剂量，优选每天150-450IU LH，如每天200-400IU LH，例如250-350IU/天。重组或尿hCG的优选剂量范围包括每天25-400IU hCG，优选每天50-200IU hCG，例如75-200IU/天，如100-150或120-170IU/天。
[0352] 黄体支持持续直到排卵后至少2周，但可持续直到第5或10妊娠周。
[0353] 通过在黄体阶段期间以一定的剂量一次或多次施用长效LH或长效hCG(图4b)可以得到类似的结果，所述剂量给出的生物响应类似于通过施用LH的优选剂量的日剂量所获得的响应。可与任何类型的ART联合使用黄体支持方案。
[0354] 可以按多种方式组合本发明的不同方案，只要它们不背离如独立权利要求中所确定的本发明的发明构思即可。
[0355] FSH
[0356] 促卵泡激素(FSH)调节人体的发育、生长、青春期成熟和生育过程。在男性和女性中，FSH刺激生殖细胞的成熟。在男性中，FSH诱导睾丸支持细胞分泌抑制素并刺激支持细胞-支持细胞紧密连接(闭锁小带)的形成。在女性中，FSH刺激未成熟卵泡在卵巢中的生长和募集。在早期(小)窦状卵泡中，FSH是挽救卵泡凋亡(卵泡和卵母细胞的体细胞的程序性死亡)的主要存活因子。在黄体-卵泡阶段过渡期，孕酮和雌激素(主要是雌二醇)的血清水平下降，并且不再抑制FSH的释放，因此FSH在约第三天达到峰值(第一天为月经周期的首日)。
[0357] FSH是异二聚糖蛋白。每个单体单元是一个或多个寡糖链共价连接至氨基酸侧链的蛋白质分子；这些单体单元中的两个构成完整的功能性蛋白。蛋白二聚体含有2个多肽单元，以α和β亚基标记。LH、FSH、TSH和hCG的α亚基是完全相同的，并且含有92个氨基酸(参见图5)。FSH具有118个氨基酸的β亚基(FSHB)，这些氨基酸赋予其特定的生物学作用，并负责与FSH-受体的相互作用。激素的糖部分由岩藻糖、半乳糖、甘露糖、半乳糖胺、葡糖胺和唾液酸组成，后者对于其生物半衰期是关键的。FSH的半衰期是3-4小时。
[0358] α亚基的基因位于染色体6p21.1-23上。其表达于不同的细胞类型中。FSHβ亚基的基因位于染色体11p13上，并且表达于垂体细胞的促性腺物质中，被GnRH控制，受抑制素的抑制，并且通过激活素增强。
[0359] 本发明优选的FSH的β-链选自与SEQ ID NO 10、11、12、13或15具有至少80％、更优选85％、更优选90％、更优选95％的序列同一性的序列。优选地，变体在SEQ ID NO 10的位置和间距处包含保守的半胱氨酸残基。在特别优选的实施方案中，FSH包含具有SEQ ID NO 10的人α-亚基。
[0360] 本领域技术人员要理解的是，FSH可被生物学活性类似物或者被刺激内源性FSH分泌的化合物替代。在这后一类中包括有芳香酶抑制剂和抗雌激素，如它莫昔芬和克罗米酚柠檬酸盐(CC)。这些化合物通过除去雌激素施加于下丘脑上的负反馈(通过拮抗雌激素受体，如CC和它莫昔芬的情况，或者通过大幅度减少雌激素浓度，如芳香酶抑制剂的情况)而刺激内源性FSH分泌。其它类型的FSH类似物包括例如单链FSH类似物，其中[β]-亚基融合至hCG的CTP，其继而融合至FSH[α]-亚基，如WO 96/05224中所述(单链FSH-CTP)。
[0361] 在进一步的实施方案中，FSH选自哺乳动物FSH的类似物或哺乳动物FSH的类似物。当FSH是哺乳动物FSH的类似物时，该类似物与FSH的相应哺乳动物序列具有至少80％同一性，如85％同一性、90％同一性、95％同一性、98％同一性。序列同一性适用于FSH的α和β链两者。
[0362] 所使用的两种最常见的形式是尿人绝经期促性腺激素(含FSH和LH活性)和重组FSH(含FSH而没有任何LH活性)。由于所有目前使用的FSH制剂的半衰期相对较短，在刺激IVF的妇女中诱导多卵泡发育的临床方案需要每日注射。可采用使用显示出半衰期延长的FSH的长效形式物代替FSH的每日注射。
[0363] 通常按药典以IU给出FSH活性。现在也可以生产出FSH的纯制剂，并且活性以质量给出(例如μg每小瓶)。在本发明中要理解的是，以IU给出的活性同以其它单位给出的FSH活性有关联。
[0364] 在本发明的一个实施方案中，FSH是长效FSH。说到长效旨在表示其血清半衰期为重组或尿FSH的血清半衰期的至少1.5倍的蛋白质，更优选至少2倍、更优选至少3倍、更优选至少4倍、更优选至少5倍、更优选至少7倍、更优选至少10倍，如至少15倍，例如至少20倍，如至少25倍，例如至少30倍、40倍或50倍或更多。
[0365] 优选长效FSH的半衰期不长于72小时，如48小时。这使得在卵泡生成的后期更容易控制FSH施用。
[0366] 长效FSH可例如是FSH-CTP，其描述于WO93/06844中，并具有野生型FSH[α]-亚基以及[β]-亚基，其包括在其羧基末端融合至hCG的[β]-亚基(天然hCG[β]序列SEQ ID NO 9的位置145的残基118)的羧基末端肽(CTP)的野生型人FSH[β]-亚基(SEQ ID NO 10)。所得到的β-亚基具有SEQ ID NO 15的序列。
[0367] 绒促卵泡素α是在CHO细胞中通过重组DNA技术产生的糖蛋白。绒促卵泡素α被设计为持续的卵泡刺激物，具有与(rec)FSH相同的药效学特点(pharmacodynamic profile)，但FSH活性的持续时间显著延长。由于其能够引发和维持多卵泡生长长达一周，因而在COS治疗周期中单次皮下注射推荐剂量的绒促卵泡素 可代替任何每日(rec)FSH制剂的头七次注射中的一些或全部。通过对人FSH(SEQ ID NO 10)的β-链增加人绒膜促性腺激素(hCG)的β-亚基的羧基末端肽实现FSH活性的长持续时间。绒促卵泡素α不显示有任何内在的LH/hCG活性。绒促卵泡素α具有69小时(59-79小时)的平均消除半衰期。
[0368] 优选可按每一雌性哺乳动物一次团注40-240μg来施用绒促卵泡素，例如像每一雌性哺乳动物60-220μg、例如像每一雌性哺乳动物80-200μg、例如像每一雌性哺乳动物100-180μg或例如像每一雌性100-150μg。在另一实施方案中可按每一雌性哺乳动物一次团注
40-120μg施用绒促卵泡素，例如像每一雌性哺乳动物60-100μg或例如像每一雌性哺乳动物
70-90μg。在再一实施方案中，按每一雌性哺乳动物一次团注120-240μg施用绒促卵泡素，例如像每一雌性哺乳动物140-220μg、例如像每一雌性哺乳动物160-200μg或例如像每一雌性哺乳动物170-190μg。绒促卵泡素的批准剂量是60kg以下的女性为100μg，60kg以上的女性为150μg。
40-120μg施用绒促卵泡素，例如像每一雌性哺乳动物60-100μg或例如像每一雌性哺乳动物
70-90μg。在再一实施方案中，按每一雌性哺乳动物一次团注120-240μg施用绒促卵泡素，例如像每一雌性哺乳动物140-220μg、例如像每一雌性哺乳动物160-200μg或例如像每一雌性哺乳动物170-190μg。绒促卵泡素的批准剂量是60kg以下的女性为100μg，60kg以上的女性为150μg。
[0369] 按一次团注施用绒促卵泡素优选在月经周期的第1-3天，例如像在月经周期的第1天、第2天或第3天。
[0370] 因此，在一个优选的实施方案中，FSH是长效FSH，如绒促卵泡素，优选在月经周期的第1-3天按每一雌性哺乳动物一次团注40-240μg施用。
[0371] 在其中FSH(或类似物)与COS技术或方案联合使用的方面中，适当剂量和施用方案对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且可使用任何适当的剂量和施用方案。
[0372] 例如，可以按在卵泡阶段期间给出每升1-50IU FSH的血清水平的剂量施用FSH，例如像每升2-40IU FSH、例如像每升3-35IU FSH，例如每升4-30IU FSH，例如像每升5-25IU FSH，例如每升7-20IU FSH，例如像每升10-15IU FSH。
[0373] 优选按在卵泡阶段期间给出每升5-25IU FSH、优选每升10-15IU的血清水平的剂量施用FSH。
[0374] 在一个实施方案中可按每天50-600IU FSH、优选每天100-300IU FSH的日剂量施用FSH，如150-225IU/天。在显示出对FSH响应减少的一些患者中，可取的是使用高达每天600IU FSH的剂量。典型的方案如下：患者开始于每天150IU FSH。如果卵泡发育充分，则可维持150IU FSH/天的剂量。如果卵泡发育不充分，则可将剂量增至225、300、375、450、525或
600IU FSH/天。理想地，FSH的累积剂量不应超过6000IU/周期。
600IU FSH/天。理想地，FSH的累积剂量不应超过6000IU/周期。
[0375] 在本发明方法中使用的FSH可以有任何来源。这些来源是排卵诱导和COS程序领域的技术人员所熟知的。可使用FSH的尿制剂，例如按1:1比例含有FSH和LH活性的hMG。
[0376] 因此，在本发明的一个实施方案中，FSH是按每天50-600IU FSH的日剂量施用的重组或尿源FSH，优选每天100-300IU FSH，如150-225IU/天。
[0377] 可以在月经周期的第1-3周期日开始施用FSH，例如像在月经周期的第1周期日、例如在月经周期的第2周期日或例如在月经周期的第3周期日。
[0378] 当至少一个卵泡具有12-14mm、例如像12-13mm或例如13-14mm的直径时停止施用FSH。例如可在月经周期的第4、5、7或8周期日停止施用FSH。在本发明的典型例子中，在月经周期的第6周期日停止施用FSH。停止FSH施用的目的是阻止进一步的卵泡生成，并允许最大的卵泡成熟。本领域中已知的是，卵泡数目与OHSS危险之间有关联。
[0379] 当施用的FSH是重组或尿源FSH时，停止FSH施用仅需不进一步施用FSH。然后FSH的血清水平将在未来的几天中下降到不会再刺激卵泡生成的水平。当施用长效FSH(例如绒促卵泡素α)时，停止FSH施用意指应停止施用，使得在第一个卵泡已经达到如上所述的直径后一或两天，血清FSH活性的水平不再刺激卵泡生成。在施用例如绒促卵泡素α的情况下，优选在刺激方案的第一天只施用一个剂量的绒促卵泡素α。如果需要进一步的卵泡生成，可以稍后在刺激周期但在卵泡达到12-14mm尺寸前施用重组或尿源FSH。按这种方式可以更容易地控制FSH的血清水平。
[0380] 一般来说，血清FSH活性的水平(以IU或μg每升为单位)应下降到在刺激方案的头1-6天期间低于血清水平的50％的水平。更优选低于25％，如低于10％。
[0381] 促黄体激素(LH)
[0382] LH是由垂体前叶腺产生的激素，并且对于男性和女性的生育是必不可少的。在女性中，在月经来潮之时，FSH引发卵泡生长，特别是影响颗粒细胞。随着雌激素的升高，LH受体也表达于成熟中的卵泡上，成熟中的卵泡产生增加量的雌二醇。最终在卵泡成熟之时，雌激素升高经由下丘脑界面导致“正反馈”效果，经24到48小时时间释放LH。这种“LH激增”引发排卵，从而不仅释放卵子，而且还引发将残余卵泡转化为黄体，这继而产生孕酮，以为可能的着床准备子宫内膜。LH对于头两周维持黄体功能是必要的。在怀孕的情况下，黄体功能将由来自刚刚确实的妊娠的hCG(非常类似于LH的激素)的作用进一步得以维持。LH在巢卵中支持泡膜细胞，其为雌二醇产生提供雄激素和激素前体。LH是异二聚糖蛋白。每个单体单元是一个或多个寡糖链共价连接至氨基酸侧链的蛋白质分子；这些单体单元中的两个构成完整的功能性蛋白。蛋白二聚体含有2个多肽单元，以α和β亚基标记。LH、FSH、TSH和hCG的α亚基是完全相同的，并且含有92个氨基酸。LH具有141个氨基酸的β亚基(LHB)，这些氨基酸赋予其特定的生物学作用，并负责与LH-受体的相互作用。此β亚基含有显示出与hCG的β亚基的序列有同源性并且均刺激相同受体的氨基酸序列。然而，hCGβ亚基含有另外24种氨基酸，并且两种激素的糖部分的组成不同。
[0383] 本发明的LH的β链选自与SEQ ID NO 4、5、6、7和8具有至少80％、更优选85％、更优选90％、更优选95％的序列同一性的序列。优选地，变体在SEQ ID NO 4的位置和间距处包含保守的半胱氨酸残基。在特别优选的实施方案中，LH包含具有SEQ ID NO 4的人α-亚基。
[0384] 这些寡糖的不同组成影响生物活性以及降解和消除速度。LH的生物学半衰期为20分钟，这比FSH(3-4小时)和hCG(24-30小时)的要短得多。
[0385] 本领域技术人员要理解的是，LH可被生物学活性类似物或者被刺激内源性LH分泌的化合物替代。LH的类似物包括施加与LH相同的生理、生化或生物效果和/或结合至与LH相同的受体的所有分子。LH的一些类似物还可包括单链LH。已知hCG与LH分担一些生理作用。LH的类似物的一些例子在以下文献中有公开：例如欧洲专利EP 0 322 226(Applied Research Systems)、WO 92/22568(University of Medicine&Dentistry of New Jersey)、WO 96/05224(Washington University)、WO 90/09800(Washington
University)、WO 93/06844(Washington University)、WO 98/43999(Washington University)、WO 99/25849(Washington University)、WO 00/61586(Akzo Nobel)。
University)、WO 93/06844(Washington University)、WO 98/43999(Washington University)、WO 99/25849(Washington University)、WO 00/61586(Akzo Nobel)。
[0386] LH及其类似物或LH激动剂可选自有机小分子、肽、多肽、蛋白质，并且可以通过合成方法、通过重组手段来产生，或者由其天然来源获得，例如由尿、组织或血液获得。
[0387] 在一个特定的实施方案中，LH激动剂是重组或尿源LH。在另一实施方案中，LH激动剂是非哺乳动物来源的。在另一特定的实施方案中，LH激动剂是哺乳动物来源的，如通过重组手段获得的蛋白质。在进一步的实施方案中，LH激动剂选自哺乳动物绒膜促性腺激素(CG)或哺乳动物LH。当LH激动剂是哺乳动物CG时，其通常为灵长类动物CG，例如人CG，但也可选自其它哺乳动物物种，如马CG。
[0388] 在进一步的实施方案中，LH激动剂选自哺乳动物LH的类似物或者哺乳动物LH的类似物。当LH激动剂是哺乳动物LH的类似物时，该类似物优选与促黄体激素的相应哺乳动物序列具有至少80％同一性，如85％同一性、90％同一性、95％同一性、98％同一性。序列变化可以在α链中、β链中或在这两者中。LH激动剂可以是人CG的类似物，其与绒膜促性腺激素的相应人序列具有至少80％同一性，如85％同一性、90％同一性、95％同一性、98％同一性。当LH激动剂是哺乳动物LH的类似物时，该类似物与促黄体激素的相应哺乳动物序列具有至少80％同一性，如85％同一性、90％同一性、95％同一性、98％同一性。通常，LH激动剂是人LH的类似物，其与促黄体激素的相应人序列具有至少80％同一性，如85％同一性、90％同一性、95％同一性、98％同一性。
[0389] 当LH激动剂选自多肽或蛋白质时，如哺乳动物CG的类似物或哺乳动物LH的类似物，其可以被糖基化。通常，LH激动剂是被糖基化的hCG。也可以是像这样的LH化合物被糖基化，并且糖基化可以在LH激动剂上，或者在药学上可接受的分子上(当所述分子选自多肽或蛋白质，如人白蛋白时)。可以按多种方式将LH激动剂连接至药学上可接受的分子，如直接通过价键，或者间接地通过连接子，该连接子通常为双官能连接子，虽然它也可以是多官能连接子。在进一步的实施方案中，连接子选自化学连接子、糖部分、二硫桥、融合连接子、亲水连接子、可水解的连接子。在进一步的实施方案中，LH激动剂通过肽连接子融合至药学上可接受的分子。在又进一步的实施方案中，LH激动剂直接融合至药学上可接受的分子，以便通过由宿主细胞(如CHO细胞或酵母细胞)表达LH化合物来产生一种多肽或蛋白质。在进一步的实施方案中，LH激动剂通过稳定的连接子连接至药学上可接受的分子。在另一实施方案中，LH激动剂通过不稳定的连接子连接至药学上可接受的分子。因此，可以采用现有技术中熟知的技术，按多种方式将LH激动剂连接至药学上可接受的分子，并且本发明还包括其中一种或多种LH激动剂连接至一种或多种药学上可接受的分子的情况，如两种LH激动剂连接至一种药学上可接受的分子，或者一种LH激动剂连接至两种药学上可接受的分子。在进一步的实施方案中，LH激动剂连接至一种或两种药学上可接受的分子，优选一种药学上可接受的分子。
[0390] 当LH激动剂是哺乳动物LH时，其通常为人LH，但也可选自其它哺乳动物物种，如母牛LH、猪LH、马LH、绵羊LH、狗LH、猫LH和山羊LH。通常，LH激动剂是人LH或人hCG。通常情况下，IVF涉及在胚胎转移后的头2周期间采用孕酮的每日黄体阶段支持治疗。如果确认在周期的第28天妊娠，则可以将采用孕酮的每日黄体阶段支持治疗再延长5-10周。然而在本发明中，LH的施用可以代替这种采用孕酮的每日治疗。通过施用一个或多个剂量的LH激动剂提供黄体和妊娠阶段支持可导致卵母细胞更好地发育，卵母细胞更健康，增加胚胎着床和保留，降低生化怀孕危险，并且可减少OHSS的危险。
[0391] 在一个实施方案中，单独用于黄体支持的LH激动剂是LH类似物而不是hCG或hCG类似物。这首先是因为在黄体阶段中施用hCG可能会干扰通常涉及检测由黄体分泌的尿hCG的生化怀孕测试。此外，预期在黄体阶段中施用LH而不是hCG可减少发生OHSS的危险，这是由于这两种蛋白质的受体亲和力不同。
[0392] 在另一实施方案中，单独用于妊娠支持的LH激动剂是LH类似物而不是hCG或hCG类似物。这首先是因为在妊娠阶段中施用hCG可能会干扰通常涉及检测由黄体分泌的尿hCG的生化怀孕测试。此外，预期在妊娠阶段中施用LH而不是hCG可减少发生OHSS的危险，这是由于这两种蛋白质的受体亲和力不同。
[0393] 虽然LH和hCG两者都结合并激活LH-受体，但这两种激素作为一个家族的异激素存在，它们的寡糖组成不同。每种不同的亚型以特定的方式影响受体，并且可引起可变的细胞响应(Burgon PG et al.,Endocrinology,1996；137:4827；Stanton PG et al.,Mol Cell Endocrinol.1996；125:133-141.)，如也已对不同的FSH亚型显示的那样(Barrios-de-Tomasi J,et al.Mol Cell Endocrinol.2002；186:189-98,Yding Andersen C&Ezcurra D,Reproductive Biology Insights 2011:4,1-10)。因此LH和hCG的更精细和微调的效果可能实际上不同。在斯德哥尔摩的ESHRE会议(2011年7月)上介绍的近期研究实际上表明LH的作用比hCG快得多，但在受体水平上效率较低(L.Casarini et al.,ESHRE Stockholm 2011-P312,Universita degli Studi di Modena,Italy)。Peter Humaindan教授的展示(ESHRE Stockholm 2011)进一步表明，与补充的等效剂量的hCG相比，在COS期间对重组FSH补充重组LH显著提高了卵母细胞产量，在受体水平上显示出特定的LH效果。hCG是在怀孕后大约8天继胚胎着床而分泌的妊娠相关蛋白。hCG能够刺激黄体保持活性并使之继续分泌孕酮及其它必要的物质，以便能够发生怀孕。当开始由着床的胚胎分泌hCG时，LH以可观的量存在，但这些水平不足以进一步刺激黄体，并且除非妇女发生怀孕，否则黄体将会退化，将会发生月经出血，并且开始新的月经周期。因此在此阶段hCG优先刺激黄体。虽然LH与hCG之间的这种差异已经困扰了科学界有些时间，但现已证实在黄体阶段期间LH-受体(LH-R)发生变化。当存在hCG时，功能性全长受体保持其表达，而LH无法做到这点(Dickinson RE et al.,Endocrinology 150:2873-2881,2009)。这显示了在黄体阶段期间LH和hCG效果的差异。
[0394] 本文描述的雌性哺乳动物中的辅助生育治疗方法可在一个实施方案中进一步包括通过施用一个或多个剂量的LH激动剂代替目前的孕酮黄体阶段支持来提供黄体阶段支持。
[0395] 通常按药典以IU给出LH活性。现在也可以生产出LH的纯制剂，并且活性以质量给出(例如μg每小瓶)。在本发明中要理解的是，以IU给出的活性同以其它单位(如摩尔单位)给出的LH活性有关联。
[0396] 在卵泡阶段期间可以按给出的响应等同于由本文所述的尿和重组hCG的剂量提供的生物响应的剂量施用尿或重组或长效LH代替hCG(尿或重组或长效的)。
[0397] 一个或多个剂量的LH激动剂应足以提供至少5nmol/L、如至少10nmol/L、如至少15nmol/L或如至少20nmol/L的血清孕酮浓度，至少直到排卵或取得卵母细胞后5天、至少直到取得卵母细胞后10天，优选至少直到排卵或取得卵母细胞后14天，更优选至少直到排卵或取得卵母细胞后21天，更优选至少直到排卵或取得卵母细胞后28天。优选地，LH激动剂的施用可持续到超过排卵或取得卵母细胞后28天，如长达5周、如长达6周，例如长达7周，如长达8周，例如长达9周，如长达10周或更长时间。
[0398] 在一个特别优选的实施方案中，辅助生育治疗方法进一步包括通过施用足以在取得卵母细胞后第7天提供至少20nmol/L的血清孕酮浓度的一个或多个剂量的LH激动剂来提供黄体支持。
[0399] 优选的是，黄体阶段中的所述一个或多个剂量足以维持至少在20nmol/L的血清孕酮水平，至少直到取得卵母细胞后10天、优选至少直到取得卵母细胞后14天、更优选至少直到取得卵母细胞后21天、更优选至少直到取得卵母细胞后28天。
[0400] 优选的是，所施用的LH激动剂足以提供类似于在黄体阶段期间由每升4-12IU重组或尿LH的血清浓度、更优选4-12IU/L(如8-12IU/L)的血清浓度所提供的响应的生物响应。
[0401] 在优选的实施方案中，在黄体阶段中按每天100-600IU LH的日剂量施用重组或尿源LH，优选每天150-450IU LH，如每天200-400IU LH，例如250-350IU/天。
[0402] LH激动剂可在一个实施方案中为显示出延长的血清半衰期的长效LH。该长效LH可包含连接至诸如药学上可接受的分子的化学部分的LH或LH激动剂，当与按同LH化合物相同的方式施用的LH激动剂的血清半衰期相比时，或者当与内源性绒膜促性腺激素(CG)的体内血浆半衰期相比时，所述药学上可接受的分子提供大幅度增加的LH激动剂或LH化合物的血清半衰期。当与常规的孕酮施用相比时，据信在卵泡阶段中或作为黄体阶段支持给予的修饰的LH改善患者方便性和治疗结果。
[0403] 在一个优选的实施方案中，LH激动剂是包含连接至化学部分的促黄体激素的长效LH。在另一优选的实施方案中，LH激动剂是包含连接至化学部分的人绒膜促性腺激素的长效hCG。
[0404] 为了产生可在与辅助生育技术(ART)程序有关的黄体阶段期间一次或两次施用的长期LH化合物，这种长期LH化合物在对哺乳动物施用时应导致LH激动剂或LH化合物具有的血清半衰期为LH的半衰期的至少1.5倍，如至少2倍、至少3倍、至少4倍，优选至少5倍、更优选至少6倍，如为LH的半衰期的1.5倍至25倍。
[0405] 在优选的实施方案中，LH激动剂是包含连接至化学部分的促黄体激素的长效LH，其中长效LH具有的血清半衰期为LH的半衰期的至少6倍。
[0406] 当长效LH包含连接至化学部分的人绒膜促性腺激素时，长期LH的血清半衰期可以例如为hCG的半衰期的至少1.2倍，如hCG的半衰期的至少1.3倍、hCG的半衰期的至少1.5倍、hCG的半衰期的至少2倍，或者如hCG的半衰期的至少3倍。
[0407] LH激动剂可在一个优选的实施方案中为包含连接至化学部分的人绒膜促性腺激素的长效hCG，其中长效hCG具有的血清半衰期为hCG的半衰期的至少1.5倍。
[0408] 在检测到生化怀孕之前对妇女给予黄体支持，胚胎着床和怀孕可能是不确定的，并且女性可能在给定的周期中不会怀孕。因此，雌性哺乳动物可能必须要经历另外的刺激或排卵周期，并且优选的是，在黄体阶段期间施用的LH激动剂的半衰期不超过10天，优选不超过5天，以使得所述水平可降到某一水平以下，在雌性哺乳动物必须要在下一周期中得到新的治疗的情况下，该某一水平能干扰随后的排卵或刺激周期。
[0409] 长效LH和hCG的例子见于所附的实施例。
[0410] 人绒膜促性腺激素(hCG)
[0411] 人绒膜促性腺激素(hCG)是在怀孕期间产生的糖蛋白激素，其是由在怀孕后的发育胚胎以及后来由合体滋养细胞(胎盘的一部分)生成。其作用是防止卵巢的黄体解体，并从而维持在人怀孕期间至关重要的孕酮产生。hCG可具有另外的功能：比如，据认为hCG影响怀孕的免疫耐受性。早孕测试一般来说是基于hCG的检测或测量。
[0412] 人绒膜促性腺激素与LHCG受体相互作用，并且在怀孕开始期间促进黄体的维持，使之分泌激素孕酮。孕酮使子宫富有血管和毛细血管厚内层，使得其可支撑生长的胎儿。由于其高度的负电荷性，hCG可排斥母亲的免疫细胞，在第一孕期保护胎儿。还推测hCG可能是产生局部母体免疫耐受性的胎盘纽带(link)。例如，经hCG处理的子宫内膜细胞诱导T细胞凋亡(T-细胞溶解)的增加。这些结果表明，hCG可能是滋养层周围免疫耐受性产生的纽带，并且可促进滋养细胞侵入，已知这能加速子宫内膜中的胎儿发育。还已经提出，hCG水平与孕妇晨吐的严重性有关联。
[0413] 人绒膜促性腺激素是由244个氨基酸组成的糖蛋白，分子质量为36.7kDa。它是异二聚的，α-亚基与促黄体激素(LH)、卵泡-刺激激素(FSH)、甲状腺刺激激素(TSH)的完全相同，而β-亚基是hCG(SEQ ID NO:9)独特的。
[0414] α-亚基为92个氨基酸长。hCG的β-亚基含有由六个高度同源的基因编码的145个氨基酸，这些基因串联布置并且倒转对在染色体19q13.3-CGB(1,2,3,5,7,8)上。两个亚基产生被球的2.8倍的高的表面积与体积比所包围的小疏水核心。外层氨基酸中的绝大多数是亲水的。
[0415] 本发明的优选hCG的β链选自与SEQ ID NO 9具有至少80％、更优选85％、更优选90％、更优选95％的序列同一性的序列。优选地，变体在SEQ ID NO 9的位置和间距处包含保守的半胱氨酸残基。在特别优选的实施方案中，hCG包含具有SEQ ID NO 9的人α-亚基。
[0416] hCG与LH的区别可在于β-亚基中存在由SEQ ID NO 9的氨基酸112-145构成的C末端肽，CTP。可按免疫学方法并通过测序进行区分。
[0417] 所使用的hCG可来自任何来源，前提条件是其不被任何物质(特别是其它促性腺激素)污染，这些物质将显著地影响其作用。可以使用尿hCG，虽然优选的是使用重组hCG(rhCG)，因为其纯度高。类似的条件适用于在本发明中使用的hCG的来源。
[0418] 通常按药典以IU给出hCG活性。现在也可以生产出hCG的纯制剂，并且活性以质量给出(例如μg每小瓶)。在本发明中要理解的是，以IU给出的活性同以其它单位(如摩尔单位)给出的hCG活性有关联。
[0419] hCG的类似物包括施加与hCG相同的生理、生化或生物效果和/或结合至与hCG相同的受体的所有分子。已知促黄体激素(LH)与hCG分担一些生理作用。hCG的一些类似物包括单链hCG，其中[β]-亚基的C-末端融合至[α]-亚基的N-末端(Sugahara et al.,PNAS,92,1995,2041-2045)。类似物的其它例子在以下文献中有公开：例如欧洲专利EP 0 322 226(Applied Research Systems)、WO 92/22568(University of Medicine&Dentistry of New Jersey)、WO 96/05224(Washington University)、WO 90/09800(Washington University)、WO 93/06844(Washington University)、WO 98/43999(Washington University)、WO 99/25849(Washington University)。
[0420] 有关生育能力治疗，以肠胃外的方式广泛使用人绒膜促性腺激素作为排卵诱导物代替促黄体激素。在一个或多个成熟卵泡的存在下，可通过施用hCG引发排卵。由于排卵将发生在注射hCG后24-36小时，因此可安排好程序以利用这一时序。因此，经历IVF的患者在一般情况下接受hCG以引发排卵过程，但要在注射后约36小时取出她们的卵子，这是在卵子实际上将从卵巢中释放出来之前的几个小时。
[0421] 在本发明的方法中，在刺激或月经周期的第1-9天施用至少一个剂量的hCG，该剂量足以刺激卵泡发育直到排卵引发。优选的是施用的hCG足以提供类似于在黄体阶段期间由每升4-15IU LH的血清浓度、更优选4-12或5-12IU/L(如5-8IU/L)的血清浓度所提供的响应的生物响应。
[0422] 如上所述，hCG可以是重组的或尿源的。因此，在一个实施方案中，按重组或尿源hCG的日剂量施用hCG。可例如进行hCG的每日施用，直到引发卵泡成熟，或者以hCG的常规药团诱导/引发排卵。
[0423] 对于卵泡阶段期间hCG的每日施用，剂量范围应该在25-4000IU hCG/天，优选25-1000IU hCG/天，更优选30-1000或30-500IU hCG/天，最优选每天25-400IU，如每天50-
300IU，更优选每天100-300IU，如每天150-250IU，例如每天175—225IU。也可以按更低的频度施用hCG，例如每两天、三天或四天施用，优选每两天施用，直到排卵被引发。在这种方案中，可使用如上面概述的剂量，虽然50-400IU hCG的剂量是优选的。
300IU，更优选每天100-300IU，如每天150-250IU，例如每天175—225IU。也可以按更低的频度施用hCG，例如每两天、三天或四天施用，优选每两天施用，直到排卵被引发。在这种方案中，可使用如上面概述的剂量，虽然50-400IU hCG的剂量是优选的。
[0424] 因此，在一个优选的实施方案中，当在黄体阶段中施用时的日剂量是每天25-400IU hCG，优选每天50-200IU hCG，例如75-200IU/天，如100-150或120-170IU/天。
[0425] 在本发明的一个实施方案中，hCG是显示出延长的血清半衰期的长效hCG。长效hCG可包含连接至诸如药学上可接受的分子的化学部分的hCG，与按同长效hCG相同的方式施用的hCG的血清半衰期相比，所述药学上可接受的分子提供大幅度增加的hCG化合物的血清半衰期。
[0426] 长效hCG的半衰期可例如为hCG的半衰期的至少1.2倍，如hCG的半衰期的至少1.3倍、hCG的半衰期的至少1.5倍、hCG的半衰期的至少2倍，或者如hCG的半衰期的至少3倍。
[0427] 在一个优选的实施方案中，hCG是血清半衰期为hCG的半衰期的至少1.5倍的长效hCG。
[0428] 在一个实施方案中，在排卵诱导阶段和/或随后的黄体和/或妊娠阶段期间，每2天施用长效hCG，如每3天施用，例如每4天施用，如每5天施用，例如每6天施用，如每7天施用，例如每8天施用，如每9天施用，例如每10天施用。在进一步的实施方案中，在排卵诱导阶段和/或随后的黄体阶段和/或随后的妊娠阶段期间也可以每14天施用长效hCG，如每21天施用，例如每月施用，或者以甚至更小的频度施用。如上面所提到的那样，优选的是在黄体阶段中从hCG施用转换成LH施用。在一个实施方案中，在卵泡阶段期间按单次团注施用长效hCG，该剂量足以支持卵泡发育，并且优选也足以提供黄体支持。
[0429] 在本发明的一个实施方案中，当至少一个卵泡具有至少8mm的直径时按单次团注施用长效hCG，如至少9mm、至少10mm，例如像至少11mm，如至少13mm、至少14mm，或者例如像至少15mm。
[0430] 在一个优选的实施方案中，当至少一个卵泡具有至少12mm的直径时按单次团注施用长效hCG。
[0431] 在一个实施方案中，在FSH施用期间按单次团注施用长效hCG。
[0432] 优选的是，卵泡阶段中的hCG剂量足以提供类似于在卵泡阶段期间由每升1-12IU hCG的血清浓度所提供的响应的生物响应。
[0433] 进一步优选的是按每天25-300IU hCG的日剂量施用其中是重组或尿源hCG的hCG，优选50-200IU/天，如125-200IU/天，例如150-200IU/天。
[0434] 优选地，从卵泡阶段的第5天施用hCG，并且直到排卵引发。
[0435] 可以从卵泡阶段的第2天进一步施用hCG，使得从卵泡阶段的第2天施用hCG直到排卵。
[0436] 排卵引发
[0437] 通过卵泡直径的UV测量来确定排卵引发的确切施用时间。通常当至少一个卵泡具有至少15mm的平均直径时进行引发治疗。优选当至少一个卵泡具有16mm、更优选17mm的直径时进行引发治疗。在许多情况下，当至少2个卵泡已经达到指定尺寸时、更优选当至少3个卵泡已经达到指定尺寸时进行引发治疗。在特别优选的实施方案中，当三个或更多个卵泡具有17mm的直径时诱导排卵引发。在本发明的一个方面中，通过施用治疗有效剂量的如本文所述的GnRH激动剂引发排卵。在本发明的另一方面中，通过相对低剂量的hCG或hCG类似物或变体或长效hCG引发排卵。当使用重组或尿hCG时，引发剂量为2000IU或更少，如1500IU或更少，例如1000IU或更少。可用GnRH激动剂的剂量补充hCG或类似物/变体/长效hCG的低剂量。
[0438] 促性腺激素释放激素激动剂
[0439] 促性腺激素-释放激素激动剂(GnRH激动剂，GnRH-A)是模仿下丘脑神经激素GnRH的合成肽，后者与促性腺激素-释放激素受体相互作用以引发生物响应、垂体激素FSH和LH的释放。激动剂不会迅速与GnRH受体解离。其结果是当起初施用GnRH激动剂时，FSH和LH分泌(所谓的“突发效应”)有增加。然而在约十天后，经由通过受体内化的受体下调获得了深度的性腺低能效果(即，FSH和LH减少)。一般来说这一诱导的且可逆性的性腺低能就是治疗的目标。
[0440] 在本发明的一个方面中，施用GnRH激动剂以便引发排卵。
[0441] 批准的GnRH激动剂的例子包括：亮丙瑞林(Lupron,Eligard)；布舍瑞林(Suprefact,Suprecor)；那法瑞林(Synarel)；组氨瑞林(Supprelin)；戈舍瑞林(Zoladex)；
地洛瑞林(Suprelorin,Ovuplant)；曲普瑞林。
地洛瑞林(Suprelorin,Ovuplant)；曲普瑞林。
[0442] 适当剂量和施用方案对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且可使用任何适当的剂量和施用方案。激动剂可皮下施用或通过鼻内喷雾施用。
[0443] 要举例的话，布舍瑞林的常用和治疗有效的剂量为0.5mg(皮下)或0.2mg(鼻内)。曲普瑞林可以按0.2mg剂量皮下施用，亮丙瑞林可以按1.0mg剂量皮下施用。
[0444] 促性腺激素释放激素拮抗剂
[0445] 促性腺激素-释放激素(GnRH)拮抗剂(受体阻滞剂)是一类在结构上类似于天然GnRH(由下丘脑中的神经元所产生的激素)的化合物，但具有拮抗效应。GnRH拮抗剂是由多种通常是合成产生的氨基酸组成的肽分子。GnRH拮抗剂与天然GnRH竞争对GnRH受体的结合，因此在体内减少或阻滞GnRH作用。
[0446] GnRH拮抗剂竞争性地并且可逆性地结合至垂体腺中的GnRH受体，阻滞促黄体激素(LH)和卵泡-刺激激素(FSH)从垂体中的释放。在妇女中，LH的减少随后导致雌激素从卵巢中释放的抑制。
[0447] 与引起下丘脑-垂体-性腺轴(HPGA)的初始刺激而导致雌激素水平激增的GnRH激动剂不同，GnRH拮抗剂有立竿见影的作用，迅速减少性激素水平而没有初始的激增。
[0448] 目前批准的适合用于本发明方法的GnRH拮抗剂包括以下：西曲瑞克；加尼瑞克；阿巴瑞克；地加瑞克。适当剂量和施用方案对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且可使用任何适当的剂量和施用方案。
[0449] 以上实施方案以及下文要描述的实施方案应被视为指的是本文描述的任一方面以及本文描述的任一项实施方案，除非指定一项实施方案涉及本发明的某一方面或某些方面。
[0450] 本文中引述的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利以引用的方式并入，其程度如同单独和明确地指出将每一参考文献以引用的方式并入并且全文给出在本文中。
[0451] 本文中所用的所有标题和小标题仅为方便，不应被解释为以任何方式限制本发明。
[0452] 本发明涵盖上述要素以其所有可能的变化形式的任意组合，除非本文指出另外的情况，或者另外上下文明显矛盾。
[0453] 除本文中另指出外，本文中数值范围的叙述仅旨在作为单独提到属于所述范围内的每个单独值的简便方法，并且将每个单独值并入说明书中，如同其在本文中被单独引述。除另有说明外，本文中提供的所有精确值代表相应的近似值(例如，有关特定的因素或测量提供的所有精确的示例性值可以被认为也提供了相应的近似测量值，在适当的情况下被“约”修饰)。
[0454] 可按任意合适的顺序实施本文描述的所有方法，除非本文指出另外的情况，或者另外上下文明显矛盾。
[0455] 除另指出外，使用本文中提供的任何及所有的实施例或示例性语言(例如，“如”)仅旨在更好地阐述本发明，并不构成对本发明范围的限制。说明书中的语言都不应被解释为表示任何要素对于本发明的实践是必不可少的，除非有尽可能多的明确说明。
[0456] 本文中专利文件的引述和并入仅是为了方便起见而进行的，并不反映这些专利文件的有效性、可专利性和/或可执行性的任何观点。
[0457] 本文中关于一个要素或多个要素使用诸如“包含”、“具有”、“包括”或“含有”的措辞对任何方面或实施方案进行的描述旨在对本发明的“由该特定的一个(多个)要素组成”、“基本上由该特定的一个(多个)要素组成”或“基本上包括该特定的一个(多个)要素”的类似方面或实施方案提供支持，除非另有说明，或者上下文明显矛盾(例如，本文描述的包含特定要素的组合物应被理解为还描述了由该要素组成的组合物，除非另有说明，或者上下文明显矛盾)。
[0458] 本发明在适用法律允许的最大程度上包括本文中提出的各方面或权利要求中叙述的主题的所有修改形式和等效形式。
[0459] 通过以下实施例对本发明进行进一步的说明，然而这些实施例不应被解释为限制保护范围。在前文描述和以下实施例中公开的特征可以(单独地以及以其任意组合的形式)是用于以其不同形式实现本发明的内容。
[0460] 实施方案一览
[0461] 1.一种长效生物学活性促黄体激素(LH)化合物，其包含连接至药学上可接受的分子的LH激动剂，与按同LH化合物相同的方式施用的LH激动剂的体内血浆半衰期相比，所述药学上可接受的分子提供大幅度增加的LH激动剂或LH化合物的体内血浆半寿期。
[0462] 2.实施方案1的LH化合物，其中LH激动剂选自哺乳动物CG或其类似物或者哺乳动物LH或其类似物，如重组hLH或hGH。
[0463] 3.前述前述实施方案中任一项的LH化合物，其中LH激动剂任选通过双官能连接子化学连接至药学上可接受的分子。
[0464] 4.前述实施方案中任一项的LH化合物，其中药学上可接受的分子提供足以驱动窦状卵泡从直径约10mm直到直径约15-30mm的排卵前阶段的LH激动剂或LH化合物的生物体组合物或浓度，在排卵前阶段中成熟中的卵母细胞可完成成熟，以为减数分裂的恢复做好准备。
[0465] 5.前述实施方案中任一项的LH化合物，其中药学上可接受的分子提供足以支持促性腺激素分泌不足的性腺低能受试者的LH激动剂或LH化合物的生物体组合物或浓度。
[0466] 6.前述实施方案中任一项的LH化合物，其中药学上可接受的分子提供足以维持哺乳动物受试者围排卵阶段、排卵阶段和排卵后阶段中的孕酮的LH激动剂或LH化合物的生物体组合物或浓度，目的是调节子宫内膜和子宫以允许哺乳动物胚泡的着床。
[0467] 7.前述实施方案中任一项的LH化合物，其中当在月经周期的卵泡阶段期间与促卵泡激素(FSH)治疗有关地给予注射时，优选在开始进行FSH治疗后5-10天，药学上可接受的分子提供LH激动剂或LH化合物的血浆浓度以支持黄体(Corpus Luteum/corpora lutea，CL)的形成和维持。
[0468] 8.前述实施方案中任一项的LH化合物，其中LH激动剂选自人CG或人LH的序列、母牛CG或母牛LH的序列、猪CG或猪LH的序列、马CG或马LH的序列、绵羊CG或绵羊LH的序列、狗CG或狗LH的序列、猫CG或猫LH的序列和山羊CG或山羊LH的序列。
[0469] 9.前述实施方案中任一项的LH化合物，其中类似物与绒膜促性腺激素或促黄体激素的相应哺乳动物序列具有至少80％同一性，如85％同一性、90％同一性、95％同一性、98％同一性。
[0470] 10.前述实施方案中任一项的LH化合物，其中LH激动剂或LH化合物体内血浆半衰期增加至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍，如1.5倍至25倍。
[0471] 11.前述实施方案中任一项的LH化合物，其中LH激动剂或LH化合物是糖基化的。
[0472] 12.前述实施方案中任一项的LH化合物，其中药学上可接受的分子选自白蛋白或聚合物，如与FcRn结合增加的修饰的白蛋白、人白蛋白、重组人白蛋白或PEG。
[0473] 13.一种药物组合物，其包含前述实施方案中任一项的LH化合物。
[0474] 14.前述实施方案中任一项的LH化合物，用于促进哺乳动物受试者的生育能力，如辅助生育技术治疗。
[0475] 15.一种修饰的促黄体激素，包含连接至药学上可接受的分子的哺乳动物LH或其类似物，所述药学上可接受的分子提供哺乳动物LH或其类似物或者修饰的LH的体内血浆半衰期，其在哺乳动物中为2至48小时。
[0476] 16.实施方案15的修饰的LH，用于提供范围在2至30IU/L的修饰的LH、哺乳动物LH或其混合物在哺乳动物中的体内血浆浓度。
[0477] 17.前述实施方案15-16中任一项的修饰的LH，其中哺乳动物LH或其类似物是重组LH，例如rhLH。
[0478] 18.前述实施方案15-17中任一项的修饰的LH，其中修饰的LH包含哺乳动物LH的类似物，其中类似物与LH的相应哺乳动物序列具有至少80％同一性。
[0479] 19.前述实施方案15-18中任一项的修饰的LH，其中哺乳动物LH选自人LH的序列和马LH的序列。
[0480] 20.前述实施方案15-19中任一项的修饰的LH，其中药学上可接受的分子选自有机小分子、肽、寡肽、多肽、蛋白质、受体、糖基化、酰化基团、糖、聚合物(例如聚乙二醇，PEG)、核酸(例如DNA和RNA)中的任一种，通常药学上可接受的分子是且不限于白蛋白(如人白蛋白)、重组白蛋白、白蛋白的变体、其中n是4至40的CH3(CH2)nCO-或聚合物，如PEG，例如分子量为至少5kDa的PEG，如10kDa至150kDa，通常为10至40kDa。
[0481] 21.前述实施方案15-20中任一项的修饰的LH，其中哺乳动物LH或其类似物任选通过双官能连接子化学连接至药学上可接受的分子，或者任选通过肽连接子融合至药学上可接受的分子。
[0482] 22.前述实施方案15-21中任一项的修饰的LH，其中哺乳动物LH或其类似物或者修饰的LH是糖基化的。
[0483] 23.前述实施方案15-22中任一项的修饰的LH，其中哺乳动物LH或其类似物连接至一种或两种药学上可接受的分子，优选一种药学上可接受的分子。
[0484] 24.一种药物组合物，其包含前述实施方案15-23中任一项的修饰的LH。
[0485] 25.一种药物组合物，其包含前述实施方案15-23中任一项的修饰的LH和FSH或具有FSH活性的分子。
[0486] 26.前述实施方案15-23中任一项的修饰的LH，以与FSH或具有FSH活性的分子结合使用，用于同时、按顺序或分开使用以在哺乳动物雌性受试者的无排卵治疗中诱导卵泡发育，如少量卵泡生成或单一卵泡生成，或者在哺乳动物雌性受试者的月经周期的卵泡阶段中诱导COS。
[0487] 27.实施方案26的修饰的LH，其中施用FSH:LH的IU比例范围在20:1至1:20。
[0488] 28.实施方案25-27中任一项的修饰的LH，其中FSH选自哺乳动物的FSH，如人FSH，特别是重组FSH，例如rhFSH。
[0489] 实施例
[0490] 实施例1
[0491] 产生长效hCG的方法
[0492] 长效hCG是通过将hCG化学缀合至人血清白蛋白或人血清白蛋白的变体产生的，具有选定的对新生儿Fc受体增加或减少的亲和力。
[0493] 可使用本领域中已知的多种不同的化学物质和连接子进行化学缀合，包括具有高共价稳定性的连接子和具有较低共价稳定性的连接子，后者具有从白蛋白分子中释放活性组分的潜力，通常是通过不稳定化学键的水解。
[0494] 从下面的表中可显见白蛋白分子上的合适的附接基团。
[0495]
[0496]
[0497]
[0498] 特别合适的是偶联至白蛋白分子上的游离半胱氨酸残基(Cys 34)，例如通过WO2010092135中所述的方法，特别是使用PDPH(3-(2-吡啶基二硫代)丙酰肼)经由对hCG的腙连接将白蛋白连接至hCG的方法。在另一方面中，采用WO2010092135中的方法，使用EMCH((3,3'-N-(ε-马来酰亚胺基己酸)酰肼)经由对hCG的腙连接将白蛋白连接至hCG。
[0499] hCG分子上的合适附接基团包括在上表中的那些，并且包括用于偶联至hCG分子的糖基化部分的化学物质。偶联至糖基化部分是优选的，因为预期这样不会发生与hCG受体的直接相互作用，并且因此偶联将不会产生功能干扰。
[0500] 然而，Neose描述了采用酶促糖缀的另一种偶联技术(参见例如US2004/0126838)。此技术可用于使用合适的连接子将例如白蛋白连接至hCG。
[0501] 在其中化学缀合至hCG分子强烈降低功能活性的特殊情况下，优选的是使用可释放功能hCG的不稳定连接子。优选每个hCG分子仅附接一个白蛋白分子。
[0502] 在另一例子中，可通过两分子的基因融合来进行hCG和白蛋白分子的偶联。由于hCG分子有两个链，因此有四种不同取向的可能性：
[0503] 白蛋白-hCG(α链)
[0504] 白蛋白-hCG(β链)
[0505] hCG(α链)-白蛋白
[0506] hCG(β链)-白蛋白
[0507] 可购得Merck Serono生产的在预填充针筒中封装的重组hCG的 产品，其含有0.5mL溶液，重组hCG为250μg。可通过透析和凝胶过滤除去配制赋形剂。可如WO2010092135中所述产生白蛋白或白蛋白变体。可如WO2010092135中所述使用PDPH或EMCH化学物质将hCG和白蛋白缀合。
[0508] 实施例2
[0509] 序列表及其UniProt(www.uniprot.org)ID(名称)和AC(登录号)
[0510] 糖蛋白激素α链：
[0511] 人 GLHA_HUMAN P01215 SEQ ID NO 1
[0512] 小鼠 GLHA_MOUSE P01216 SEQ ID NO 2
[0513] 大鼠 GLHA_RAT P11962 SEQ ID NO 3
[0514] >GLHA_HUMAN P01215_成熟25-116
[0515] APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCC
[0516] VAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKS
[0517] >GLHA_MOUSE P01216_成熟25-120
[0518] LPDGDFI IQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNARVENHTECHCSTCYYHKS
[0519] >GLHA_RAT P11962_成熟25-120
[0520] LPDGDLI IQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKSFTKATVMGNARVENHTDCHCSTCYYHKS
[0521] 促黄体激素β链
[0522]
[0523] >LSHB_HUMAN P01229_成熟21-141
[0524] SREPLRPWCHPINAILAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPTMMRVLQAVLPPLPQVVCTYRDVRFESIRLPGCPRGVDPVVSFPVALSCRCGPCRRSTSDCGGPKDHPLTCDHPQLSGLLFL
[0525] >LSHB_PANTR Q2QlP2_成熟21-141
[0526] SREPLRPWCHPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPTMMRVLQAVLPPLPQVVCTYRDVRFESIRLPGCPRGVDPVVSFPVALSCRCGPCRRSTSDCGGPKDHPLTCDHPQLSGLLFL
[0527] >LSHB_GORGO Q2QlPl_成熟21-141
[0528] SREPLRPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPTMMRVLQGVLPPLPQVVCTYRDVRFESIXLPGCPRGVDPMVSFPVALSCRCGPCHRSTSDCGGPNDHPLTCDHPQLSGLLFL
[0529] >LSHB_MOUSE O09108_成熟21-141
[0530] SRGPLRPLCRPVNATLAAENEFCPVCITFTTSICAGYCPSMVRVLPAALPPVPQPVCTYRELAFASVRLPGCPPGVDPIVSFPVALSCRCGPCRLSSSDCGGPRTQPMACDLPHLPGLLLL
[0531] >LSHB_RAT P01230_成熟21-141
[0532] SRGPLRPLCRPVNATLAAENEFCPVCITFTTSICAGYCPSMVRVLPAALPPVPQPVCTYRELRFASVRLPGCPPGVDPIVSFPVALSCRCGPCRLSSSDCGGPRTQPMTCDLPHLPGLLLF
[0533] 绒膜促性腺激素β(hCG-B)：
[0534] 人：CGHB_HUMAN P01233 SEQ ID NO 9
[0535] >CGHB_HUMAN P01233_成熟21-165
[0536] SKEPLRPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPTMTRVLQGVLPALPQVVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCALCRRSTTDCGGPKDHPLTCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ[0537] 促卵泡激素
[0538] 促卵泡素亚基β
[0539]
[0540] >FSHB_HUMAN P01225_成熟19-129
[0541] NSCELTNITIAIEKEECRFCI SINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE
[0542] >FSNB_MOUSE Q60687_成熟21-130
[0543] SCELTNITI SVEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNTQKVCTFKELVYETVRLPGCARHSDSLYTYPVATECHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFSEMKE
[0544] >FSHB_RAT P18427_成熟21-130
[0545] SCELTNITI SVEKEECRFCISINTTWCEGYCYTRDLVYKDPARPNTQKVCTFKELVYETIRLPGCARHSDSLYTYPVATECHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE
[0546] >FSHB_GORGO AlBN60_成熟21-129
[0547] CELTNITIAIEKEECRFCI SINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE
[0548] >FSHB PANTR Q2PUH2成熟21-129
[0549] CELTNITIAIEKEECRFCI SINTTWCAGHCYTRDLVYKDPARPNIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE
[0550] 绒促卵泡素α
[0551] 绒促卵泡素α由促性腺激素α链(SEQ ID NO 1 )和FSH的β链+hCG的C-末端28个氨基酸(以粗体标记)组成。
[0552] SEQ ID NO:15
[0553] NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKESSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ
[0554] 实施例3
[0555] 产生长效hLH的方法
[0556] 通过将hLH化学缀合至对新生儿Fc受体具有选定增加或减少的亲和力的人血清白蛋白或人血清白蛋白的变体来产生长效hLH。
[0557] 可使用本领域中已知的多种不同的化学物质和连接子进行化学缀合，包括具有高共价稳定性的连接子和具有较低共价稳定性的连接子，后者具有从白蛋白分子中释放活性组分的潜力，通常是通过不稳定化学键的水解。
[0558] 从下面的表中可显见白蛋白分子上的合适的附接基团。
[0559]
[0560]
[0561]
[0562] 特别合适的是偶联至白蛋白分子上的游离半胱氨酸残基(Cys 34)，例如通过WO2010092135中所述的方法，特别是使用PDPH(3-(2-吡啶基二硫代)丙酰肼)经由对hCG的腙连接将白蛋白连接至hCG的方法。在另一方面中，采用WO2010092135中的方法，使用EMCH((3,3'-N-(ε-马来酰亚胺基己酸)酰肼)经由对hLH的腙连接将白蛋白连接至hCG。
[0563] hLH分子上的合适附接基团包括在上表中的那些，并且包括用于偶联至hLH分子的糖基化部分的化学物质。偶联至糖基化部分是优选的，因为预期这样不会发生与hLH受体的直接相互作用，并且因此偶联将不会产生功能干扰。
[0564] 然而，Neose描述了采用酶促糖缀的另一种偶联技术(参见例如US2004/0126838)。此技术可用于使用合适的连接子将例如白蛋白连接至hLH。
[0565] 在其中化学缀合至hLH分子强烈降低功能活性的特殊情况下，优选的是使用可释放功能hLHCG的不稳定连接子。优选每个hLH分子仅附接一个白蛋白分子。
[0566] 在另一例子中，可通过两分子的基因融合来进行hLH和白蛋白分子的偶联。由于hLH分子有两个链，因此有四种不同取向的可能性：
[0567] 白蛋白-hLH(α链)
[0568] 白蛋白-hLH(β链)
[0569] hLH(α链)-白蛋白
[0570] hLH(β链)-白蛋白
[0571] 可购得EMD Serono生产的作为冻干粉末封装的重组hLH的 产品，并且可以在含82.5IU重组hLH的1.0mL溶液中进行重构。可通过透析和凝胶过滤除去配制赋形剂。可如WO2010092135中所述产生白蛋白或白蛋白变体。可如WO2010092135中所述使用PDPH或EMCH化学物质将重组hLH和白蛋白缀合。
[0572] 实施例4
[0573] SPA-PEG共价附接至hLH或其变体
[0574] 如下所述将人LH及其变体共价连接至SPA-PEG 5000、SPA-PEG 12000和SPA-PEG 20000(NOF公司)(hLH及其变体在溶液中PEG化)。
[0575] hLH及其变体在溶液中PEG化
[0576] 在50mM磷酸钠,100mM NaCl,pH 8.5中按250μg/ml浓度将人LH及其变体PEG化。相对于蛋白质上的PEG化位点，PEG的摩尔过剩为5-100倍。于37℃、1200rpm下将反应混合物在热混合器中放置30分钟。30分钟后，通过添加摩尔过量的甘氨酸猝灭反应。
[0577] 应用阳离子交换色谱法从反应混合物中除去过量的PEG、甘氨酸及其它副产物。以20mM柠檬酸钠pH 2.5稀释PEG化反应混合物，直到离子强度小于7mS/cm。使用5N HCl将pH调至2.5。将混合物施加至用20mM柠檬酸钠pH 2.5平衡过的SP-琼脂糖FF柱。使用4个柱体积的平衡缓冲液将未结合的物质洗离柱。通过添加20mM柠檬酸钠、750mM氯化钠在三个柱体积中洗脱PEG化蛋白质。浓缩纯的PEG化hLH，并使用VivaSpin浓缩装置进行缓冲液交换，截留分子量(mwco)：10kDa。
[0578] 实施例5
[0579] hCG与重组人白蛋白或人白蛋白的K573P变体之间的1:1缀合物的生产和表征[0580] 材料
[0581] 供应的重组人白蛋白(Recombumin,Novozymes Biopharma)为200mg/ml溶液。在层流柜中将原始小瓶分装成50x1ml等分试样。冷冻储存等分试样。
[0582] 可如WO2011051489中所述产生重组人白蛋白变体K573P。冷冻储存化合物(112mg/ml)。
[0583] 由Ovitrelle产品(Merck Serono)产生重组hCG，并且通过缓冲液更换除去配制赋形剂，如对于每种缀合物描述的那样，使用GE Healthcare一次性PD-10脱盐柱。
[0584] PDPH((3-[2-吡啶基二硫代]丙酰肼)、EMCH(N-[马来酰亚胺基己酸]酰肼))、SPDP(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯)和EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)购自Thermo Fisher Scientific Inc。
[0585] 所有其它化学品和材料均为标准实验室质量的。
[0586] 方法
[0587] 尺寸排阻HPLC(SEC-HPLC)：
[0588] 使用配有多波长检测器的Agilent HP1100机器进行分析SEC-HPLC。使用的分析柱为：
[0589] 具有TSK-SWXL保护柱的TSK g3000 SWXL(7.8mm id x30cm长)
[0590] 具有TSK-SWXL保护柱的TSK g3000 SWXL(7.5mm id x60cm长)
[0591] 使用Waters HPLC系统进行制备规模的HPLC。使用的制备柱为：
[0592] Superdex 200 26/600 Hiload
[0593] Superdex 200 10/300 GL
[0594] 除另有说明外，所有柱均在0.2μm过滤的PBS(pH 7.4)中试验。
[0595] 在280nm检测。
[0596] 典型试验条件/分析时间示于下表。
[0597]
[0598] SDS非还原凝胶：
[0599] 使用Novex 4-12％Tris-甘氨酸凝胶实现SDS非还原凝胶的最佳分离/解析。电泳缓冲液为Tris乙酸盐SDS电泳缓冲液。样品制备如下：
[0600] 将5μl LDS样品加到15μl样品中。在室温下培养5分钟。
[0601] 将10μl样品加载到凝胶上面。
[0602] 所有凝胶在150V恒定电压下试验，试验时间～60分钟。
[0603] 凝胶用去离子水洗涤5分钟，用Gel Code Blue Safe-Stain(ThermoFisher)染色，使用去离子水脱染。
[0604] SDS还原凝胶：
[0605] 使用Novex 4-12％Tris-甘氨酸凝胶实现SDS非还原凝胶的最佳分离/解析。电泳缓冲液为Tris-甘氨酸SDS电泳缓冲液。样品制备如下：
[0606] 5μl LDS样品缓冲液
[0607] 2μl NuPAGE还原剂
[0608] 15μl样品。
[0609] 将样品加热到85摄氏度达两分钟，并将10μl样品加载到凝胶上面。所有凝胶在150V恒定电压下试验，试验时间～60分钟。洗涤凝胶并且如对于非还原性凝胶那样染色/脱染。
[0610] 分光光度法(A280)：
[0611] 使用具有1cm石英微量吸收池的岛津UV-160分光光度计在220-320nm范围进行测量，针对样品缓冲液按基线校正。
[0612] 内毒素测量：
[0613] 使用具有1-0.01EU/mL的Charles River便携式测试系统(PTS)进行内毒素测量。样品在用1/10比例的分散试剂(0.05mL样品+0.1mL分散剂+0.35mL LAL水)稀释后分析。使用PTS内毒素盒来分析样品后稀释物。
[0614] A：缀合物l的产生
[0615] 缀合物1为1:1:1hCG-PDPH-白蛋白缀合，通过以下方式产生，即将PDPH连接子缀合至hCG上的氧化的唾液酸，并进一步通过与在rHA处的游离半胱氨酸形成二硫键将hCG-PDPH偶联至rHA，如PDPH的制造商所描述的那样。
[0616] hCG的制备：
[0617] 汇集三十个针筒的Ovitrelle(共计15ml，7.5mg hCG)并使用台式离心机(在13,000rpm下)中的vivaspin 500离心浓缩器浓缩至-5mg/ml。使用在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水中平衡过的三个PD-10脱盐柱对浓缩溶液进行缓冲液更换。将500μl溶液加载到每个柱上面，并用2.5ml PBS洗涤。在1ml PBS中洗脱hCG。通过A280测量确定缓冲液更换的hCG浓度，对于1mg/ml溶液使用0.459的消光系数。
[0618] hCG的高碘酸盐氧化：
[0619] 制备高碘酸钠在H2O中的1mg/ml溶液。将此加到冷冻的hCG溶液(44μl每mg hCG)中，用箔包裹以进行避光保护，并在冰上放置35分钟。使用两个在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水中平衡过的PD-10脱盐柱从反应混合物中除去未反应的高碘酸盐。将反应混合物分成两份同样的等分试样，加载到柱上面并用PBS洗涤成2.5ml总体积。在PBS的500μl等分试样中洗脱氧化的hCG。通过A280测量和汇集鉴定含峰组分的蛋白质。通过A280测量确定hCG浓度。使用vivaspin 500离心浓缩器将氧化的hCG溶液浓缩至-8mg/ml hCG。
[0620] 氧化的hCG与PDPH的反应：
[0621] 制备PDPH在二甲亚砜(DMSO)中的100mg/ml溶液。将此加到氧化的hCG溶液中以得到32.5倍摩尔过量的PDPH(3μl PDPH溶液每mg hCG)，轻轻混合并在25摄氏度水浴中放置3小时。为除去未反应的交联剂，将反应混合物加载到在PBS中平衡过的PD-10柱上面，并用PBS洗涤成2.5ml总体积。在500μl的PBS等分试样中洗脱hCG-PDPH。通过A280测量和汇集鉴定峰组分。
[0622] rHA的制备：
[0623] 在与hCG-PDPH反应之前纯化重组rHA以除去rHA二聚体。
[0624] 将rHA(500μl)加载到Superdex 200 10/300 GL柱上面，并在PBS中洗脱，如上所述。收集单体峰。通过A280测量确定rHA浓度，使用0.51的1mg/ml消光系数。使用台式离心机(在13,000rpm下)中的vivaspin 500离心浓缩器将纯化的rHA浓缩至-200mg/ml。
[0625] hCG-PDPH与rHA的反应：
[0626] 将纯化的rHA加到hCG-PDPH溶液中以得到5倍摩尔过量的rHA(12.8mg rHA每mg hCG)，轻轻混合并在25摄氏度水浴中放置3小时。
[0627] 1:1:1缀合物的纯化：
[0628] 将反应混合物分成两个500μl等分试样。将第一个等分试样加载到Superdex 200 10/30 0GL柱上面，并在PBS中洗脱，如上所述。收集缀合物峰。用反应混合物的第二个等分试样重复此过程。汇集缀合物峰并通过A280测量确定缀合物浓度，使用0.496的1mg/ml消光系数。
[0629] 使用vivaspin500离心浓缩器将缀合物溶液再浓缩十倍，到700μl体积。如以前那样，使用Superdex 200 10/300 GL柱，在100μl等分试样中纯化此浓缩的缀合物溶液。
[0630] 通过0.2μm过滤器过滤纯化的缀合物溶液，移取到无菌500μl微量离心管(eppendorf tube)中的50μl等分试样里并冷冻。
[0631] 通过还原及非还原SDS-PAGE(图8a和8b)并通过SEC-HPLC(图8c)分析样品。
[0632] 在四种不同的条件下对缀合物1稳定性进行96小时的分析：5摄氏度(pH 7.4)、37摄氏度(pH 7.4)、37摄氏度(pH 6.4)和37摄氏度(pH 5.4)。通过SEC-HPLC分析样品。
[0633]
[0634] 稳定性分析结果，非缀合的hCG以每天大约40％的初始速度释放。
[0635] B：缀合物3的产生
[0636] 缀合物3为1:1:1hCG-SPDH-白蛋白缀合，通过以下方式产生，即将SPDP连接子缀合至hCG上的游离胺(在N-末端上或者在赖氨酸侧链上)，并进一步通过与在rHA处的游离半胱氨酸形成二硫键将hCG-SPDP偶联至rHA，如SPDP制造商所描述的那样。
[0637] hCG的制备：
[0638] 汇集二十个针筒的Ovitrelle(10ml，5mg hCG)并使用台式离心机(在13,000rpm下)中的6个Vivaspin500离心浓缩器浓缩至大约2ml。使用在pH 5.9的柠檬酸盐缓冲液中平衡过的2个PD-10脱盐柱对浓缩溶液进行缓冲液更换。将溶液的一半加载到每个柱上面，并用柠檬酸盐缓冲液洗涤成2.5ml总体积。在500μl柠檬酸盐缓冲液的等分试样中洗脱hCG。通过A280测量和汇集鉴定峰组分。使用0.459的消光系数通过A280测量确定hCG浓度，并用柠檬酸盐缓冲液稀释至1mg/ml的浓度。
[0639] hCG与SPDP的反应：
[0640] 制备SPDP在DMSO中的2.5mg/ml溶液。将此加到hCG溶液中以得到10倍摩尔过量的SPDP(50μl SPDP溶液每mg hCG)，轻轻混合并在25摄氏度水浴中放置1小时。为除去未反应的交联剂，将反应混合物的一半加载到在pH7.4的磷酸盐缓冲盐水中平衡过的两根PD10柱的每一根上面，并用PBS洗涤成2.5ml总体积。在500μl的PBS等分试样中洗脱hCG-SPDP缀合物。通过A280测量和汇集鉴定含峰组分的蛋白质。
[0641] rHA的制备：
[0642] 使用Superdex 200 26/600 Hiload柱纯化rHA。将rHA(3ml)加载到柱上面，并在PBS中洗脱，如上所述。收集单体峰。如以前那样通过A280测量确定rHA浓度。
[0643] hCG-SPDP与rHA的反应：
[0644] 将纯化的rHA加到hCG-SPDP溶液中以得5倍摩尔过量的rHA(12.8mg rHA每mg hCG)，轻轻混合并在25摄氏度水浴中放置过夜。将反应混合物(3ml)加载到Superdex 200 26/600 Hiload柱上面，并在PBS中洗脱，如上所述。收集缀合物峰。将溶液无菌过滤，并在37摄氏度培养器中放置48小时，用于水解弱结合的交联剂。
[0645] 1:1:1缀合物的最终纯化：
[0646] 水解后使用vivaspin500离心浓缩器将溶液浓缩至大约3ml体积。将浓缩溶液加载到Superdex 200 26/600 Hiload柱上面，并在PBS中洗脱。收集缀合物峰。使用0.496的消光系数，通过A280测量确定缀合物浓度。如前面那样将纯化的缀合物溶液浓缩至大约1mg/ml，通过0.2微米过滤器过滤，移取到无菌500μl微量离心管中的50μl等分试样里并冷冻。
[0647] 通过还原及非还原SDS-PAGE(图9a和9b)并通过SEC-HPLC(图9c)分析样品。
[0648] 在37摄氏度(pH 7.4)下对缀合物3稳定性进行96小时的分析。通过SEC-HPLC分析样品：
[0649]时间 高MW(％) 缀合物(％) rHA+hCG单体(％)
0(开始) 4.5 95.5 0
24小时 2.5 95.2 2.3
48小时 2.2 94.5 3.3
72小时 4.7 91.0 4.3
96小时 3.4 91.0 5.7
0(开始) 4.5 95.5 0
24小时 2.5 95.2 2.3
48小时 2.2 94.5 3.3
72小时 4.7 91.0 4.3
96小时 3.4 91.0 5.7
[0650] 稳定性分析结果是，缀合物3是合理稳定的，并且非缀合的hCG以每天大约2％的初始速度释放。
[0651] C：缀合物4的产生
[0652] 缀合物4为1:1:1hCG-PDPH-白蛋白缀合，通过以下方式产生，即将PDPH连接子缀合至用EDC激活的hCG，由此hCG中的羧酸基团将与PDPH反应。进一步通过与在rHA处的游离半胱氨酸形成二硫键将hCG-PDPH偶联至rHA，如PDPH和EDC制造商所描述的那样。
[0653] hCG的制备：
[0654] 汇集二十个针筒的Ovitrelle(10ml，5mg hCG)并使用台式离心机(在13,000rpm下)中的6个Vivaspin500离心浓缩器浓缩至大约1.5ml的体积。使用在pH 5.3的MES缓冲液中平衡过的3个PD-10柱对浓缩的hCG溶液进行缓冲液更换。将大约500μl溶液加载到每个柱上面，并用MES缓冲液洗涤成3ml总体积。在1.0ml MES缓冲液中洗脱hCG。使用0.459的消光系数通过A280测量确定hCG浓度。
[0655] hCG与EDC和PDPH的反应：
[0656] 制备PDPH在DMSO中的50mg/ml溶液。将此加到hCG溶液中以得到在反应混合物(1.15mg/ml PDPH)中的5mM PDPH并轻轻混合。制备EDC在MES缓冲液中的50mg/ml溶液并立即加到hCG/PDPH溶液中以得到在反应混合物(0.48mg/ml EDC)中的2.5mM EDC。将反应混合物轻轻混合，并在25摄氏度水浴中放置30分钟。为除去未反应的交联剂，将反应混合物的一半加载到在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水中平衡过的两根PD-10柱的每一根上面，并用PBS洗涤成2.5ml总体积。在500μl的PBS等分试样中洗脱hCG-PDPH。通过A280测量和汇集鉴定含峰组分的蛋白质。
[0657] rHA的制备：
[0658] 使用Superdex 200 26/600 Hiload柱纯化rHA。将rHA(3ml)加载到柱上面，并在PBS中洗脱。收集单体峰。如前面那样通过A280测量确定rHA浓度。
[0659] hCG-PDPH与rHA的反应：
[0660] 将纯化的rHA加到hCG-PDPH溶液中以得到5倍摩尔过量的rHA(12.8mg rHA每mg hCG)，轻轻混合并在25摄氏度水浴中放置三小时。三小时后将反应混合物的一半加载到Superdex 200 26/600 Hiload柱上面。在完成第一周期的情况下，两个小时后加载第二个一半。使用vivaspin500离心浓缩器将缀合物溶液浓缩至大约3ml的体积。将溶液无菌过滤，并在37摄氏度的培养器中放置36小时，用于水解弱结合的交联剂。
[0661] 1:1缀合物的最终纯化：
[0662] 将水解的缀合物溶液(3ml)加载到Superdex 200 26/600 Hiload柱上面并在PBS中洗脱，如上所述。收集缀合物峰。
[0663] 使用0.496的1mg/ml消光系数，通过A280测量确定缀合物浓度。如前面那样将纯化的缀合物溶液浓缩至大约1mg/ml，通过02μm过滤器过滤，移取到无菌500μl微量离心管中的50μl等分试样里并冷冻。
[0664] 通过还原及非还原SDS-PAGE(图10a和10b)并通过SEC-HPLC(图10c)分析样品。
[0665] 在37摄氏度(pH 7.4)下对缀合物4稳定性进行96小时的分析。通过SEC-HPLC分析样品。
[0666]培养时间(h) ％单体
0(开始) 0
24 2.7
48 3.7
72 4.6
96 4.5
0(开始) 0
24 2.7
48 3.7
72 4.6
96 4.5
[0667] 稳定性分析结果是，缀合物3是合理稳定的，并且非缀合的hCG以每天大约2％的初始速度释放。
[0668] D：缀合物3V1的产生
[0669] 缀合物3V1是rhCG-SPDP-rHA(K573P)。
[0670] 使用SPDP交联剂，采用如上所述用于产生缀合物3的方法制备hCG和rHA变体(K573P)的缀合物。通过还原及非还原SDS-PAGE(图11a和11b)并通过SEC-HPLC(图11c)分析样品。
[0671] 在37摄氏度(pH 7.4)下对缀合物3V1稳定性进行96小时的分析。通过SEC-HPLC分析样品。
[0672]培养时间(h) ％单体
0(开始) 0
24 3.7
48 4.8
72 5.5
96 6.2
0(开始) 0
24 3.7
48 4.8
72 5.5
96 6.2
[0673] 稳定性分析结果是，缀合物3V1是合理稳定的，并且非缀合的hCG以每天大约2％的初始速度释放。
[0674] E：缀合物4V1的产生
[0675] 缀合物4V1是rhCG-PDPH-rHA(K573P)。
[0676] 使用EDC和PDPH交联剂，采用如上所述用于产生缀合物4的方法制备hCG和rHA变体(K573P)的缀合物。通过还原及非还原SDS-PAGE(图12a和12b)并通过SEC-HPLC(图12c)分析样品。
[0677]培养时间(h) ％单体
0(开始) 0
24 2.8
48 3.3
72 4.3
96 5.7
0(开始) 0
24 2.8
48 3.3
72 4.3
96 5.7
[0678] 稳定性分析结果是，缀合物4V1是合理稳定的，并且非缀合的hCG以每天大约2％的初始速度释放。
[0679] 实施例6
[0680] hCG-白蛋白融合物和hLH-白蛋白融合物的产生。
[0681] 表达质粒的构建
[0682] 通过采用聚合酶链反应(PCR)组装合成的寡核苷酸来构建编码促性腺激素共同α-亚基、hCGβ-亚基和hLHβ-亚基以及这三种在3'-端或在5'-端与人血清白蛋白的基因的融合物的基因。包括为相关基因的天然人信号序列编码的序列，并且对于人血清白蛋白，包括为天然前肽编码的基因。为在哺乳动物细胞中的高表达而优化基因的密码子使用。相关的基因是：
[0683]
[0684] 通过GeneArt AG合成基因序列并分别亚克隆到pEE12.4和pEE6.4载体当中，如下表所示。
[0685]产品编号 产品名称 第一基因 第二基因
1 hCG 基因1 基因2
2 hCG-wtA-α-N 基因4 基因2
3 hCG-wtA-β-N 基因1 基因6
4 hCG-wtA-α-C 基因5 基因2
5 hCG-wtA-β-C 基因1 基因7
6 LH 基因1 基因3
7 LH-wtA-α-N 基因4 基因3
8 LH-wtA-β-N 基因1 基因8
9 LH-wtA-α-C 基因5 基因3
10 LH-wtA-β-C 基因1 基因9
1 hCG 基因1 基因2
2 hCG-wtA-α-N 基因4 基因2
3 hCG-wtA-β-N 基因1 基因6
4 hCG-wtA-α-C 基因5 基因2
5 hCG-wtA-β-C 基因1 基因7
6 LH 基因1 基因3
7 LH-wtA-α-N 基因4 基因3
8 LH-wtA-β-N 基因1 基因8
9 LH-wtA-α-C 基因5 基因3
10 LH-wtA-β-C 基因1 基因9
[0686] 使用N-末端限制位点Hind III和C-末端限制位点EcoRI。简言之，将通过GeneArt产生的5μg冻干穿梭载体重新悬浮在50μl不含内毒素的无菌水中。将所产生的100ng/ml DNA溶液10μl与EcoRI和Hind III高保真限制性内切酶各2.5μl、10x NEB缓冲液5μl和在冰上的30μl不含内毒素的无菌水混合。然后将样品在37℃下培养2小时。添加8.3μl的6x DNA加载缓冲液，并且将样品在用溴化乙锭染色的1％w/v琼脂糖凝胶上进行120V下的电泳40-60分钟。使用10μl Lonza SimplyLoad Tandem DNA梯作为参比梯。使用BioSpectrum成像系统(UVP)将琼脂糖凝胶成像。
[0687] 根据制造商的说明书使用QIAquick凝胶提取试剂盒对相关的片段进行凝胶提取。使用1:6和1:12比例的载体主干与插入DNA、1μl T4快速连接酶、20μl的2x T4快速连接缓冲液设置连接(Ligation)，必要时将反应体积用不含内毒素的无菌水调至20μl，并且将样品在室温下培养15分钟。根据制造商的说明书采用热休克方法，将10μl连接反应的等分试样用于转化One Shot Top 10 Chemically Competent大肠杆菌细胞。将细胞铺展在含氨比西林(50g/ml)的Luria Bertani琼脂板上面，并在37℃培养过夜，直到细菌菌落明显。为筛选重组体，将单一细菌菌落挑选到含有50μg/ml氨比西林的15ml Luria Bertani(LB)培养基当中，并在37℃摇动培养6小时。使用QIAGEN小量制备系统从10ml这些生长培养物中分离载体DNA，并在30μl EB缓冲液中洗脱。
[0688] 通过用HindIII和EcoRI消化鉴定阳性重组体。将生成载体的等分试样送至第3方使用载体特异性正向(GCTGACAGACTAACAGACTGTTCC)和反向(CAAATGTGGTATGGCTGA)引物进行基因测序。下表显示用于每一基因的GS载体。
[0689]基因 亚克隆到
1 pEE12.4
2 pEE6.4
3 pEE6.4
4 pEE12.4
5 pEE12.4
6 pEE6.4
7 pEE6.4
8 pEE6.4
9 pEE6.4
1 pEE12.4
2 pEE6.4
3 pEE6.4
4 pEE12.4
5 pEE12.4
6 pEE6.4
7 pEE6.4
8 pEE6.4
9 pEE6.4
[0690] DNA扩增：
[0691] 对于DNA扩增，使用在克隆筛选期间产生的生长培养物5ml接种含50μg ml氨比西林的1.5L Luria Bertani(LB)培养基，并在37℃和220rpm摇动的条件下培养过夜。使用QIAGEN Plasmid Plus Gigaprep系统分离载体DNA。在所有情况下，使用Nanodrop 1000分光光度计(Thermo-Scientific)测量DNA浓度并用不含内毒素的无菌水调至1mg/ml。图13显示基因大小的确认。
[0692] CHOK1SV细胞的常规培养：
[0693] 在补充有6mM谷氨酰胺的CD-CHO培养基中培养CHOK1SV细胞。在36.5℃、10％CO2、85％湿度、140rpm条件下在摇动培养器中培养细胞。每3-4天对细胞进行常规传代培养，以
2x105细胞/ml接种，并进行繁殖以便有足够的细胞可用于转染。经由通道20丢弃细胞。
2x105细胞/ml接种，并进行繁殖以便有足够的细胞可用于转染。经由通道20丢弃细胞。
[0694] CHOK1SV细胞的瞬时转染：
[0695] 使用已培养最少两周的CHOK1SV细胞进行瞬时转染。在转染之前对细胞进行传代培养24小时，并且在转染之时细胞活力>99％。使用Gene Pulse MXCell(Bio-Rad)(一种基于板的电穿孔系统)，经由电穿孔实施所有的转染。对于每次转染，将存活细胞重新悬浮在预热的培养基中至2.86x107细胞/ml。将80μg DNA(每单基因载体40μg)分装到每个孔当中，并添加700μl细胞混悬液。在300V、1300μF下对细胞进行电穿孔。将转染的细胞转移到在锥形瓶中预热的培养基中，并且将孔用预热的培养基冲洗两次，将这些也转移到烧瓶中。在36.5℃、10％CO2、85％湿度、140rpm条件下在摇动培养器中将转染的细胞培养6天。在收获之时使用Cedex HiRes自动细胞计数器(Roche)测量细胞活力。
[0696] 白蛋白连接的产品的纯化：
[0697] 对于所有的纯化，收集培养物上清液并通过在2000rpm离心10分钟进行澄清。采用使用30kDa MWCO过滤器的切向流过滤(TFF)，将澄清的上清液浓缩大约10次至大约100-150ml。使用填入10/50Tricorn柱(GE Healthcare,28-4064-14)的5ml的CaptureSelect HSA树脂(BAC,191.2970.05)以2ml/分钟的流速纯化浓缩的上清液。在加载细胞培养物上清液后将柱用50mM磷酸钠、125mM氯化钠(PBS缓冲液)，pH 7.4平衡和洗涤。用20mM Tris、2M氯化镁,pH 7.4开始进行洗脱。在每次试验后用PBS缓冲液，pH 2.0将柱清洗到位。
[0698] 野生型hCG和LH的纯化：
[0699] 采用使用10kDa MWCO过滤器的切向流过滤(TFF)将澄清的上清液浓缩大约10次至大约100-150ml。使用HiTrap Capto Q柱(5ml,GE Healthcare,11-0013-03)以5ml/分钟的流量纯化浓缩的上清液。在加载细胞培养物上清液后将柱用20mM Tris，pH 8.0平衡和洗涤。通过对20mM Tris、1M氯化钠，pH 8.0施加线性洗脱梯度经20个柱体积开始进行洗脱。在每次试验后用0.5M NaOH将柱清洗到位。
[0700] 通过SDS PAGE对产品1-10进行分析
[0701] 通过与NuPage 4x LDS样品缓冲液(Invitrogen,NP0007)和NuPage 10x样品还原剂(Invitrogen,NP0009)混合来制备用于分析的还原样品，并在70℃下培养10分钟。对于非还原样品，省略还原剂和热培养。在1.5mm NuPage 4-12％Bis-Tris Novex预制凝胶(Invitrogen,NP0315)上进行电泳，NuPage MES SDS电泳缓冲液处于变性条件下。SeeBlue Plus 2预染色分子量标准物(Invitrogen,LC5925)和1mg/ml的对照抗体或hCG蛋白的10μl等分试样包括在凝胶上。将1mg/ml的各样品10μl加载到凝胶上面。一旦进行电泳，凝胶在室温下被InstantBlue(TripleRed,ISB01L)染色30分钟。在BioSpectrum成像系统(UVP)上分析染色凝胶的图像(参见图17)。
[0702] 通过蛋白质印迹方法对产品1-10进行分析
[0703] 在25V、100-125mA条件下，使用NuPAGE转移缓冲液(Invitrogen)中的X-Cell II Blot模块(Invitrogen)，经1.5小时将如对SDS PAGE所描述的包含适当对照物(人血清白蛋白(Abeam,ab7473)或hCG(Ovitrelle,Serono)的凝胶转移到硝酸纤维素膜(0.2μm孔尺寸)上面。根据制造商的说明书使用Western Breeze显色蛋白质印迹免疫检测试剂盒(Invitrogen)进行蛋白质印迹分析。简单地说，将膜室温封闭30分钟，并洗涤2x20ml H2O。
在室温下将膜用初级抗体溶液培养1小时。将膜用4x20ml洗涤溶液进行洗涤，并在室温下用二级抗体溶液培养30分钟。将膜再次用4x20ml洗涤溶液并且接下来用2x20ml H2O进行洗涤，在5ml显色底物中进行培养，直到出现条带，然后冲洗2x20ml H2O并干燥。在BioSpectrum成像系统(UVP)上分析干燥膜的图像。
在室温下将膜用初级抗体溶液培养1小时。将膜用4x20ml洗涤溶液进行洗涤，并在室温下用二级抗体溶液培养30分钟。将膜再次用4x20ml洗涤溶液并且接下来用2x20ml H2O进行洗涤，在5ml显色底物中进行培养，直到出现条带，然后冲洗2x20ml H2O并干燥。在BioSpectrum成像系统(UVP)上分析干燥膜的图像。
[0704] 抗-HSA蛋白质印迹：
[0705] 此蛋白质印迹使用山羊抗-人血清白蛋白抗体(Abeam,ab19180)作为初级抗体。其以1:2000稀释度使用(0.5μg/ml最终浓度)。使用山羊Western Breeze显色蛋白质印迹免疫检测试剂盒(Invitrogen,WB7107)参见图14。
[0706] 抗-hCGα链蛋白质印迹：
[0707] 此蛋白质印迹使用多克隆山羊抗-hCGα链(Abeam,ab20712)作为初级抗体。其以1:10000稀释度使用(0.6μg/ml最终浓度)。使用山羊Western Breeze显色蛋白质印迹免疫检测试剂盒(Invitrogen,WB7107)，参见图15。
[0708] 抗-hCGβ链蛋白质印迹：
[0709] 此蛋白质印迹使用单克隆小鼠抗-hCGβ链抗体(Abeam,ab9582)作为初级抗体。其以1:333.33稀释度使用(0.6μg/ml最终浓度)。使用小鼠Western Breeze显色蛋白质印迹免疫检测试剂盒(Invitrogen,WB7103)，参见图16。
[0710] 蛋白质印迹分析成功地鉴定和证实了产品的个别构造块。
[0711] 通过SEC分析
[0712] 使用Zorbax GF-250 4μm 4.6mm ID x25cm柱(Agilent)或Zorbax GF-250 4μm 9.2mm ID x 25cm柱(Agilent)，在Agilent 1200系列HPLC系统上通过SE-HPLC分析平行双样品。注射之前将1mg/ml浓度样品的等分试样通过0.2μm过滤器过滤。分别注射20或100μl等分试样并以1ml/分钟试验5至15分钟。使用Chemstation软件分析可溶聚集体水平。
[0713] 实施例7
[0714] hCG-Fc融合物和LH-Fc融合物的产生
[0715] 表达质粒的构建
[0716] 采用聚合酶链反应(PCR)通过组装合成的寡核苷酸来构建编码促性腺激素共同α-亚基和连接子(GGGGSGGGGSGGGGS)与人IgG1的Fc的融合物、hCGβ-亚基和连接子(GGGGSGGGGSGGGGS)与人IgG1的Fc的融合物以及hLHβ-亚基和连接子(GGGGSGGGGSGGGGS)与人IgG1的Fc的融合物的的基因。包括为相关基因的天然人信号序列编码的序列。为在哺乳动物细胞中的高表达而优化基因的密码子使用。相关的基因是：
[0717]
[0718] 通过GeneArt AG合成基因序列并分别亚克隆到pEE12.4和pEE6.4载体当中，如下表所示。如实施例6中所述进行所有的工作。
[0719]产品编号 产品名称 第一基因 第二基因
11 hCG-Fc 基因10 基因11
12 LH-Fc 基因10 基因12
11 hCG-Fc 基因10 基因11
12 LH-Fc 基因10 基因12
[0720]基因 亚克隆到
10 pEE12.4
11 pEE6.4
12 pEE6.4
10 pEE12.4
11 pEE6.4
12 pEE6.4
[0721] 图13中显示基因大小的确认。
[0722] 如实施例6中所述进行DNA扩增、CHOK1SV细胞的培养和转染。
[0723] 纯化：
[0724] 蛋白A纯化用于纯化Fc-融合产物。在AKTA纯化器上使用预填充的5ml HiTrap MabSelect SuRE柱(GE Healthcare,11-0034-94)纯化澄清的上清液(10ml/分钟)。将柱用50mM磷酸钠、125mM氯化钠，pH 7.3平衡，用50mM磷酸钠和1M氯化钠pH 7.3洗涤，并用10mM甲酸钠，pH值3.5洗脱。将洗脱组分的pH立即调节至pH 7.3。
[0725] 通过SDS PAGE对产品11和12进行分析
[0726] 如实施例6中所述通过还原及非还原SDS PAGE分析纯化的材料(参见图18)。
[0727] 通过SEC-HPLC分析
[0728] 如实施例6中所述通过尺寸排阻色谱法进一步分析纯化的材料，确认纯度和同一性。
[0729] 实施例8
[0730] hCG和LH变体的体外活性测量：
[0731] 以适当的细胞密度接种表达LH/hCG受体的MLTC-1系(鼠睾丸间质肿瘤细胞系MLTC-1(ATCC-CRL-2065))，并在培养的第1天用LH/hCG变体攻击。响应于这种攻击，类固醇生成途径在细胞中被激活，并且产生和分泌孕酮和睾酮。
[0732] 细胞在RPMI培养基中增殖，并为测定以80000c/ml或8000c/孔的浓度接种。
[0733] 细胞培养：
[0734] 第0天：MLTC细胞的接种
[0735] 第1天-T＝0h：
[0736] 根据实验装置进行暴露
[0737] 第1天-T＝4h：
[0738] 收集孕酮和/或睾酮定量用过的培养基。
[0739] 汇集duplo孔用过的培养基并在-20℃储存。
[0740] 第2天-T＝24h：
[0741] 收集孕酮和/或睾酮定量用过的培养基。
[0742] 汇集duplo孔用过的培养基并在-20℃储存。
[0743] 用过的培养基中的类固醇定量：
[0744] 使用Meso Scale Discovery多点测定系统测量类固醇激素的水平：
[0745] 将用过的培养基加到MULTI-SPOT 96-孔人孕酮或睾酮板上。
[0746] 1.添加25μL/孔的检测试剂(含稀释的SULFO-TAG孕酮的稀释剂22的溶液)。
[0747] 2.添加25μL/孔的校准剂或样品并在室温下摇动培养1小时。
[0748] 3.准备 仪器，使得在添加Read缓冲液之后可立即读板。
[0749] 4.用PBS洗板3次。
[0750] 5.添加150L/孔1X Read缓冲液。避免气泡。建议以中等速度使用电子多移液器。
[0751] 6.在SECTOR仪器上读板。
[0752] 所有的缓冲液和参比标准物由供应商提供。
[0753] 使用Graphpad Software,Inc的Prism软件计算所有化合物的EC-50。使用有或没有固定斜率和/或最大值及最小值的非线性回归拟合图形。
[0754] 该方法适用于实施例5的化合物以及实施例6和实施例7的产品。结果示于图19a-d。
[0755] 实施例9
[0756] LH/hCG变体的体内效力
[0757] 这项研究的目的是确定hCG/LH测试物在LH测定中有关其HCG刺激活性的效力。评估了在未成熟雄性大鼠中对精囊的生长刺激的影响。采用了不同的给药方案，例如每天给药，每隔一天给药，或者在第一天、第二天、第三天或第四天给药。将在实施例5中产生的LH化合物以及在实施例6和实施例7中产生的产品与参比材料Ovitrelle进行对比。结果按在经四天进行Ovitrelle及不同水平的LH化合物的给药后精囊的重量给出。
[0758] 每天在PBS-白蛋白缓冲液(0.1％白蛋白)中对参比材料和测试材料进行重构，并且在施用之前调整浓度。在颈部以0.2ml/大鼠进行皮下施用。
[0759] 使用在获取时为21至23日龄的雄性SPF Wistar大鼠。研究中使用在剂量施用的第一天体重范围不超过10g的大鼠。在第5天，在最后一次给药后24小时通过CO2/O2过量麻醉将大鼠无痛致死。
[0760] 取出精囊，修整并吸干。测定和记录精囊的重量。
[0761] 该方法适用于实施例5的化合物以及实施例6和实施例7的产品。结果示于图20a-j。
[0762] 实施例10
[0763] 测量大鼠血清中的hCG含量。
[0764] 将收集自暴露于含LH的产品的大鼠的血清送至Bioscientia GmbH,Institut für Medizinische Diagnostik GmbH,Konrad-Adenauer-Str.17,55218Ingelheim,Germany用于分析，采用ADVIA Centaur总hCG(ThCG)测定。
[0765] ADVIA Centaur总hCG(ThCG)测定是采用化学发光测定技术的双位点夹心免疫测定，其使用恒定量的两种抗体。
[0766] Lite试剂中的第一抗体是多克隆山羊抗-hCG抗体，其已经过亲和力纯化并用吖啶酯标记。固相中的第二抗体是纯化的单克隆小鼠抗-hCG抗体，其共价偶联至顺磁颗粒。这两种抗体对于游离β亚基和完整hCG的β亚基两者上存在的不同表位是特异性的。
[0767] 该系统会自动执行以下动作：
[0768] ·分配50μL样品到比色皿当中
[0769] ·分配100μL Lite试剂和450μL固相并在37℃培养7.5分钟
[0770] ·用试剂水3分离、抽吸和洗涤比色皿
[0771] ·分配酸试剂和碱试剂各300μL以引发化学发光反应
[0772] ·如系统操作说明书或联机帮助系统中所述的那样根据所选定的选项记录结果[0773] 血清样品中存在的hCG量与由系统检测的相对光单位(RLU)量之间存在着直接的关系。
[0774] 将相应含hCG的产品的稀释曲线用于所得数据的校正。
[0775] 实施例11
[0776] 大鼠血清中LH样免疫反应性含量的测量。
[0777] 将收集自暴露于含LH的产品的大鼠的血清送至Bioscientia GmbH,Institut fur Medizinische Diagnostik GmbH,Konrad-Adenauer-Str.17,55218Ingelheim,Germany用于分析，采用 促黄体激素ECLIA(Elecsys)测定。
[0778] Elecsys LH测定使用两种专门针对人LH的单克隆抗体。所使用的两种特异性抗体识别特定的构象，生物素化的抗体检测由两种亚基构件的表位，而具有钌配合物标签的抗体检测来自β-亚基的表位。作为结果，Elecsys LH测定显示出与FSH、TSH、hCG、hGH和hPL微不足道的交叉反应性。
[0779] 测试原理
[0780] ·第1次培养：20μL样品、生物素化单克隆LH-特异性抗体和用钌配合物标记的单克隆LH-特异性抗体形成夹心配合物。
[0781] ·第2次培养：在添加包被链霉亲和素的微粒后，配合物经由生物素和链霉亲和素的相互作用变得结合至固相。
[0782] ·将反应混合物抽吸到测量池当中，微粒在这里被磁性捕获到电极的表面上。然后用ProCell/ProCell M除去未结合的物质。然后对电极施加电压诱导化学发光辐射，其通过光电倍增管测量。
[0783] ·经由仪器通过2点校正特异生成的校正曲线和经由试剂条形码提供的主曲线确定结果。
[0784] 将相应含LH的产品的稀释曲线用于所得数据的校正。
[0785] 实施例12
[0786] 切除垂体的雄性Wistar大鼠中的PK数据
[0787] 在切除垂体的雄性Wistar大鼠中测量LH化合物的药代动力学特性(pharmacokinetic profile)。
[0788] 在时间0小时以不同的剂量皮下施用LH化合物。在不同的时间点采集大鼠血样—通过使用19G一次性使用的针头进行舌下取血采集每只大鼠的头4份血样。在麻醉下采集第5份和终末血样。
[0789] 根据以下说明准备血清：
[0790] 将血样收集在具有凝血激活剂Sarstedt RefNo.41.1500.005的SST管中。将样品倒转5x，然后使之在环境温度下凝血30分钟。凝血10分钟后立即在2500G、20℃下离心样品。将血清分入两个储存小瓶—每个小瓶50μl。向其中一个小瓶添加300μl PBS/BSA。
[0791] 在离心后60分钟内将血清样品在≤-15℃下冷冻。
[0792] 如实施例10中对含hCG的化合物所述以及如实施例11中对含LH的化合物所述测量LH化合物的血清标记。该方法适用于实施例5的化合物以及实施例6和实施例7的产品。结果示于图21a-d和图22a-h。
[0793] 实施例13
[0794] 正常成年雄性大鼠中的PK数据
[0795] 在正常Spraque Dawley雄性大鼠中测量LH化合物的药代动力学特性。
[0796] 在时间0小时以不同的剂量皮下施用LH化合物。在不同的时间点采集大鼠血样—通过使用19G一次性使用的针头进行舌下取血采集每只大鼠的头4份血样。在麻醉下采集第5份和终末血样。
[0797] 根据以下说明准备血清：
[0798] 将血样收集在具有凝血激活剂Sarstedt RefNo.41.1500.005的SST管中。将样品倒转5x，然后使之在环境温度下凝血30分钟。凝血10分钟后立即在2500G、20℃下离心样品。将血清分入两个储存小瓶—每个小瓶100μl。向其中一个小瓶添加250μl PBS/BSA。
[0799] 在离心后60分钟内将血清样品在≤-15℃下冷冻。
[0800] 如实施例10中对含hCG的化合物所述以及如实施例11中对含LH的化合物所述测量LH化合物的血清水平。该方法适用于实施例5的化合物和实施例6的产品。结果示于图23a-d。
[0801] 实施例14
[0802] 与用黄体阶段孕酮施用补充的标准GnRH拮抗剂方案相比，在卵泡阶段后期作为代替FSH给予的hCG和以每日注射低剂量r-hCG或r-LH给予的黄体阶段支持的比较
[0803] 背景
[0804] 越来越清楚的是，目前支持黄体阶段以优化着床机会和建立怀孕的方法确定性较差。进一步地，目前施用黄体阶段支持的方案看起来并没有在所有的患者中提供足够的孕酮浓度以保证取得最佳结果。此外，最常用的黄体阶段支持产品的施用模式具有降低患者配合度和接受性的一些副作用。
[0805] 本研究的目的是确定是否有可能开发出新的刺激方案，其中不需要黄体阶段孕酮施用，方式是结合卵泡阶段施用低剂量的hCG(即每天150—200IU)作为卵泡阶段后期中的FSH刺激的替代，同时采用GnRH激动剂注射用于排卵诱导。已知使用GnRH激动剂用于排卵诱导减少促性腺激素的垂体输出，导致黄体功能不充分。然而，卵巢过度刺激综合症(OHSS)的危险同时被降低到接近可忽略不计的水平。为了确保黄体阶段适当维持怀孕的建立，以及将OHSS的危险维持在较低水平，本研究将从取得卵母细胞的当天每日施用r-hCG(每天125IU)或r-LH(即每天300IU)的注射剂以刺激黄体功能并增加孕酮的内源产生，而不用与GnRH激动剂排卵引发有关地施用外源孕酮。
[0806] 材料和方法
[0807] 计划进行两项研究，针对两个诊所各一项，每个诊所共包括随机临床评价的90名妇女。
[0808] 入选标准：
[0809] 1.女性年龄在25与40岁之间
[0810] 2.基线FSH和LH<12IU/I
[0811] 3.月经周期长度在25-34天之间
[0812] 4.身体质量指数(BMI)在18与30之间
[0813] 5.存在两个卵巢并且没有子宫异常
[0814] 排除标准
[0815] 1.仅存在一个卵巢。
[0816] 2.子宫异常
[0817] 3.多囊卵巢综合症
[0818] 4.糖尿病、癫痫，肝、肾、心脏疾病，包括治疗医生确诊的代谢性疾病
[0819] 5.对用于施用的药物中存在的任何物质过敏。
[0820] 6.在研究中参与较早
[0821] 激素治疗
[0822] 治疗组-I：头4天从第二周期日按固定剂量施用重组FSH(r-hFSH；果纳芬，Merck-Serono,Hellerup,Denmark)。剂量为每天150或225IU，这取决于年龄、BMI、基础FSH、窦状卵泡计数和卵巢体积。4天后，可根据卵巢响应调整剂量。
[0823] 当至少四个卵泡达到12mm直径时，将每日FSH剂量(不论最初采用哪一种具体的剂量)与每日200IU hCG(r-hCG，Ovitrelle，Merck-Serono,Hellerup,Denmark)交换—参见下面的稀释说明。为防止过早的LH升高，在第5刺激日早上开始采用固定GnRH拮抗剂方案。在这一天，每日s.c.给予0.25mg/天的GnRH拮抗剂(西曲肽，Merck-Serono,Hellerup,Denmark)，并将持续直到且包括排卵诱导当天。当三个或更多个卵泡达到17mm直径时在所有患者中通过施用GnRH激动剂的单次药团诱导排卵，如0.5mg布舍瑞林s.c.(Suprefact；Sanofi-Aventis,HΦrsholm,Denmark)，接着34小时后取得卵母细胞(OPU)。与OPU有关，在注射布舍瑞林后35小时左右，将开始每日施用125IU IU r-hCG(r-hCG，Ovitrelle,Merck-Serono,Hellerup,Denmark)(参见下面的稀释说明)用于黄体阶段支持和刺激内源孕酮产生。施用r-hCG将持续直到进行怀孕测试。不施用外源孕酮。
[0824] 治疗组-II：从第二周期日按每日225IU固定剂量施用重组FSH(r-hFSH；果纳芬,Merck-Serono,Hellerup,Denmark)。还从第二周期日将施用每日150IU固定剂量的hCG(r-hCG，Ovitrelle,Merck-Serono,Hellerup,Denmark)—参见下面的稀释说明。为防止过早的LH升高，在第5刺激日早上开始采用固定GnRH拮抗剂方案。在这一天，每日s.c.给予0.25mg/天的GnRH拮抗剂(西曲肽,Merck-Serono,Hellerup,Denmark)并将持续直到且包括排卵诱导当天。
[0825] 当至少四个卵泡达到12-13mm直径时，停止每日FSH剂量，同时hCG的剂量将以每日150IU继续，直到排卵诱导。
[0826] 当三个或更多个卵泡达到17mm直径时，在所有患者中通过施用0.5mg布舍瑞林s.c.的单次药团GnRH拮抗剂(Suprefact；Sanofi-Aventis,HΦrsholm,Denmark)诱导排卵，接着34小时后取得卵母细胞(OPU)。与OPU有关，在注射布舍瑞林后35小时左右，将开始每日施用125IU IU r-hCG(r-hCG，Ovitrelle,Merck-Serono,Hellerup,Denmark)(参见下面的稀释说明)用于黄体阶段支持和刺激内源孕酮产生。施用r-hCG将持续直到进行怀孕测试。不施用外源孕酮。
[0827] 治疗组III：头4天从第二周期日按固定剂量施用重组FSH(r-hFSH；果纳芬,Merck-Serono,Hellerup,Denmark)。剂量为每天150或225IU，这取决于年龄、BMI、基础FSH、窦状卵泡计数和卵巢体积。4天后，可根据卵巢响应调整剂量。为防止过早的LH升高，在第5刺激日早上开始采用固定GnRH拮抗剂方案。在这一天，每日s.c.给予0.25mg/天的GnRH拮抗剂(西曲肽,Merck-Serono,Hellerup,Denmark)，并将持续直到且包括排卵诱导当天。当三个或更多个卵泡达到17mm直径时，在所有患者中通过施用0.5mg布舍瑞林s.c.的单次药团(Suprefact；Sanofi-Aventis,HΦrsholm,Denmark)诱导排卵，接着34小时后取得卵母细胞(OPU)。与OPU有关，在注射布舍瑞林后35小时左右，将开始每日施用300IU r-LH(r-LH，Luveris,Merck-Serono,Hellerup,Denmark)用于黄体阶段支持和刺激内源孕酮产生。施用r-LH将持续直到进行怀孕测试。不施用外源孕酮。
[0828] 对照组：头4天从第二周期日按固定剂量施用重组FSH(r-hFSH；果纳芬，Merck-Serono,Hellerup,Denmark)。剂量为每天150或225IU，这取决于年龄、BMI、基础FSH、窦状卵泡计数和卵巢体积。4天后，可根据卵巢响应调整剂量。为防止过早的LH升高，在第5刺激日早上开始采用固定GnRH拮抗剂方案。在这一天，每日s.c.给予0.25mg/天的GnRH拮抗剂(西曲肽,Merck-Serono,Hellerup,Denmark)，并将持续直到且包括排卵诱导当天。当三个或更多个卵泡达到17mm直径时，在所有患者中通过施用250μg r-hCG的单次药团(r-hCG,Ovitrelle,Merck-Serono,Hellerup,Denmark)诱导排卵，接着34-35小时后取得卵母细胞(OPU)。对于黄体阶段支持，在OPU后的当天开始，将阴道施用每日微粉化的孕酮，每天90mg(快孕隆；Merck-Serono,Hellerup,Denmark)，并且每天口服施用雌二醇4mg(诺坤复；Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)，并且持续直到怀孕测试当天。
[0829] 对于所有的组：实验室程序将遵循参与诊所的正常程序，并且将与随机化无关。最多两个胚胎在获取后第2天将被转移。将监测包括受精率、卵裂率在内的所有实验室参数。通过在ET后第12天的血浆β-hCG浓度≥10IU/I确定生化怀孕。临床怀孕被确定为在阳性hCG测试后3周宫内妊娠囊有心跳。
[0830] 随机化
[0831] 在刺激第1天将参与的患者随机分到四组中的一组。
[0832] 血样和激素测定
[0833] 将在1)排卵诱导当天，2)OPU的当天，3)OPU加七那天，和4)在OPU后第14天采集血样。将血清等分试样(样品被分入两个同等的安瓿)保持在-20℃下冷冻，用于随后分析LH、孕酮和hCG。将使用每个参与实验室的内部测定来测量激素。
[0834] 结果测量
[0835] 主要结果是黄体阶段中期孕酮水平。次要结果测量包括持续怀孕率、早孕流产率和OHSS发生率。
[0836] 用于刺激的r-hCG的稀释
[0837] 一安瓿的r-hCG(r-hCG，Ovitrelle,Merck-Serono,Hellerup,Denmark)含有250μg r-hCG，相当于大约6.500IU。使用带有注射针头的无菌2ml针筒，通过穿透橡胶塞应从具有10ml无菌生理盐水的瓶中取出1ml液体。随后应将安瓿的内含物注入到瓶中剩余的9ml盐水当中。在瓶中hCG的浓度现在将构成650IU/ml。为了用200IU hCG提供患者刺激，应从瓶中再取出0,3ml(或准确地说195IU)并经由无菌1ml针筒注射。
[0838] 为了获取共125IU hCG，应从瓶中再取出0,19ml并经由无菌1ml针筒注射。
[0839] 为了获取共150IU hCG，应从瓶中再取出0,23ml并经由无菌1ml针筒注射。
[0840] 应每天新准备用于刺激的r-hCG。
[0841] 参与者和临床活性
[0842] 两个生育诊所参与研究。一个生育诊所承担的试验包括治疗组I和治疗组II以及对照组，共包括90名患者(3个30名患者组)。另一生育诊所承担的试验包括治疗组I、治疗组III和对照组，共包括90名患者(3个30名患者组)。
[0843] 实施例15
[0844] 将代替按低剂量r-hCG或r-LH的每日注射剂施用的FSH和黄体阶段支持而在卵泡阶段后期施用的hCG与用黄体阶段孕酮施用补充的标准GnRH拮抗剂方案进行比较。因此，按每日小剂量施用野生型hCG以说明S-hCG的效果，如本专利申请中所描述的那样。
[0845] 背景
[0846] 越来越清楚的是，目前支持黄体阶段以优化着床机会和建立怀孕的方法确定性较差。进一步地，目前施用黄体阶段支持的方案看起来并没有在所有的患者中提供足够的孕酮浓度以保证取得最佳结果。此外，最常用的黄体阶段支持产品的施用模式具有降低患者配合度和接受性的一些副作用。
[0847] 本研究的目的是确定是否有可能开发出新的刺激方案，其中不需要黄体阶段孕酮施用，方式是结合卵泡阶段施用低剂量的hCG(即每天150—200IU)作为卵泡阶段后期中的FSH刺激的替代，同时采用GnRH激动剂注射用于排卵诱导。已知使用GnRH激动剂用于排卵诱导减少促性腺激素的垂体输出，导致黄体功能不充分。然而，卵巢过度刺激综合症(OHSS)的危险同时被降低到接近可忽略不计的水平。为了确保黄体阶段适当维持怀孕的建立，以及将OHSS的危险维持在较低水平，从取得卵母细胞的当天给本研究中的患者施用r-hCG(每天125IU)或r-LH(即每天300IU)的注射剂以刺激黄体功能并增加孕酮的内源产生，而不用与GnRH激动剂排卵引发有关地施用外源孕酮。
[0848] 材料和方法
[0849] 总共32名妇女包括在这项前瞻性随机试验中，其详情如下：
[0850] 入选标准：
[0851] 1.女性年龄在25与40岁之间
[0852] 2.基线FSH和LH<12IU/I
[0853] 3.月经周期长度在25-34天之间
[0854] 4.身体质量指数(BMI)在18与30之间
[0855] 5.存在两个卵巢并且没有子宫异常
[0856] 排除标准
[0857] 1.仅存在一个卵巢。
[0858] 2.子宫异常
[0859] 3.多囊卵巢综合症
[0860] 4.糖尿病、癫痫，肝、肾、心脏疾病，包括治疗医生确诊的代谢性疾病
[0861] 5.对用于施用的药物中存在的任何物质过敏。
[0862] 6.在研究中参与较早
[0863] 激素治疗
[0864] 治疗组-I：头4天从第二周期日按固定剂量施用重组FSH(r-hFSH；果纳芬，Merck-Serono,Hellerup,Denmark)。剂量为每天150或225IU，这取决于年龄、BMI、基础FSH、窦状卵泡计数和卵巢体积。4天后，根据卵巢响应调整剂量。
[0865] 当至少四个卵泡达到12mm直径时，将每日FSH剂量(不论最初采用哪一种具体的剂量)与每日200IU hCG(r-hCG，Ovitrelle，Merck-Serono,Hellerup,Denmark)交换—参见下面的稀释说明。为防止过早的LH升高，在第5刺激日早上开始采用固定GnRH拮抗剂方案。在这一天，每日s.c.施用0.25mg GnRH拮抗剂(西曲肽，Merck-Serono,Hellerup,Denmark)，并持续直到且包括排卵诱导当天。当三个或更多个卵泡达到17mm直径时在所有患者中通过施用GnRH激动剂的单次药团诱导排卵，如0.5mg布舍瑞林s.c.(Suprefact；Sanofi-Aventis,HΦrsholm,Denmark)，接着34小时后取得卵母细胞(OPU)。与OPU有关，在注射布舍瑞林后35小时左右，开始每日施用125I U r-hCG(r-hCG，Ovitrelle,Merck-Serono,Hellerup,Denmark)(参见下面的稀释说明)用于黄体阶段支持和刺激内源孕酮产生。施用r-hCG持续直到进行怀孕测试。不施用外源孕酮。
[0866] 治疗组-II：从第二周期日按每日225IU固定剂量施用重组FSH(r-hFSH；果纳芬,Merck-Serono,Hellerup,Denmark)。还从第二周期日施用每日150IU固定剂量的hCG(r-hCG，Ovitrelle,Merck-Serono,Hellerup,Denmark)—参见下面的稀释说明。为防止过早的LH升高，在第5刺激日早上开始采用固定GnRH拮抗剂方案。在这一天，每日s.c.给予0.25mg GnRH拮抗剂(西曲肽，Merck-Serono,Hellerup,Denmark)并持续直到且包括排卵诱导当天。
[0867] 当至少四个卵泡达到12-13mm直径时，停止每日FSH剂量，同时hCG的剂量以每日150IU继续，直到排卵诱导。
[0868] 当三个或更多个卵泡达到17mm直径时，在所有患者中通过施用0.5mg布舍瑞林s.c.的单次药团GnRH拮抗剂(Suprefact；Sanofi-Aventis,HΦrsholm,Denmark)诱导排卵，接着34小时后取得卵母细胞(OPU)。与OPU有关，在注射布舍瑞林后35小时左右，开始每日施用125IU r-hCG(r-hCG，Ovitrelle,Merck-Serono,Hellerup,Denmark)(参见下面的稀释说明)用于黄体阶段支持和刺激内源孕酮产生。施用r-hCG持续直到进行怀孕测试。不施用外源孕酮。
[0869] 治疗组III：头4天从第二周期日按固定剂量施用重组FSH(r-hFSH；果纳芬,Merck-Serono,Hellerup,Denmark)。剂量为每天150或225IU，这取决于年龄、BMI、基础FSH、窦状卵泡计数和卵巢体积。4天后，根据卵巢响应调整剂量。为防止过早的LH升高，在第5刺激日早上开始采用固定GnRH拮抗剂方案。在这一天，每日s.c.给予0.25mg GnRH拮抗剂(西曲肽，Merck-Serono,Hellerup,Denmark)，并持续直到且包括排卵诱导当天。当三个或更多个卵泡达到17mm直径时，在所有患者中通过施用0.5mg布舍瑞林s.c.的单次药团(Suprefact；Sanofi-Aventis,HΦrsholm,Denmark)诱导排卵，接着34小时后取得卵母细胞(OPU)。与OPU有关，在注射布舍瑞林后35小时左右，开始每日施用300IU r-LH(r-LH，Luveris,Merck-Serono,Hellerup,Denmark)用于黄体阶段支持和刺激内源孕酮产生。施用r-LH持续直到进行怀孕测试。不施用外源孕酮。
[0870] 对照组(治疗组4)：头4天从第二周期日按固定剂量施用重组FSH(r-hFSH；果纳芬，Merck-Serono,Hellerup,Denmark)。剂量为每天150或225IU，这取决于年龄、BMI、基础FSH、窦状卵泡计数和卵巢体积。4天后，根据卵巢响应调整剂量。为防止过早的LH升高，在第5刺激日早上开始采用固定GnRH拮抗剂方案。在这一天，每日s.c.给予0.25mg GnRH拮抗剂(西曲肽，Merck-Serono,Hellerup,Denmark)，并持续直到且包括排卵诱导当天。当三个或更多个卵泡达到17mm直径时，在所有患者中通过施用250μg r-hCG的单次药团(r-hCG,Ovitrelle,Merck-Serono,Hellerup,Denmark)诱导排卵，接着34-35小时后取得卵母细胞(OPU)。对于黄体阶段支持，在OPU后的当天开始，阴道施用每日微粉化的孕酮，每天90mg(快孕隆；Merck-Serono,Hellerup,Denmark)，并且每天口服施用雌二醇4mg(诺坤复；Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)，并且持续直到怀孕测试当天。
[0871] 对于所有的组：实验室程序遵循参与诊所的正常程序，并且与随机化无关。最多两个胚胎在获取后第2天被转移。监测包括受精率和卵裂率在内的所有实验室参数。通过在ET后第12天的血浆β-hCG浓度≥10IU/I确定生化怀孕。临床怀孕被确定为在阳性hCG测试后3周宫内妊娠囊有心跳。
[0872] 随机化
[0873] 在刺激第1天将参与的患者随机分到四组中的一组。
[0874] 血样和激素测定
[0875] 在1)排卵诱导当天，2)OPU的当天，3)OPU加七那天，和4)在OPU后第14天采集血样。将血清等分试样(样品被分入两个同等的安瓿)保持在-20℃下冷冻，用于随后分析LH、孕酮和hCG。使用每个参与实验室的内部测定来测量激素。
[0876] 结果测量
[0877] 主要结果是黄体阶段中期孕酮水平。
[0878] 用于刺激的r-hCG的稀释
[0879] 一安瓿的r-hCG(r-hCG，Ovitrelle,Merck-Serono,Hellerup,Denmark)含有250μg r-hCG，相当于大约6.500IU。使用带有注射针头的无菌2ml针筒，通过穿透橡胶塞从具有10ml无菌生理盐水的瓶中取出1ml液体。随后将安瓿的内含物注入到瓶中剩余的9ml盐水当中。在瓶中hCG的浓度现在构成650IU/ml。为了用200IU hCG提供患者刺激，从瓶中再取出0,
3ml(或准确地说195IU)并经由无菌1ml针筒注射。
3ml(或准确地说195IU)并经由无菌1ml针筒注射。
[0880] 为了获取共125IU hCG，从瓶中再取出0,19ml并经由无菌1ml针筒注射。
[0881] 为了获取共150IU hCG，从瓶中再取出0,23ml并经由无菌1ml针筒注射。
[0882] 每天新准备用于刺激的r-hCG。
[0883] 结果
[0884]
[0885] 这些数据清楚地表明，在卵泡阶段中和在黄体阶段中建议的给药方案以及用于在黄体阶段中通过rhLH刺激孕酮产生的建议给药方案显示出对黄体阶段中期孕酮产生有明显的积极影响。
[0886] 药理学方法
[0887] 实施例16
[0888] 如何测定长效LH化合物的生物效力，如连接至人白蛋白的hCG(SUS-hCG)
[0889] 将采用两种确立的体内测定法之一测定SUS-hCG的生物效力。药典和官方要求Van Hell生物测定法。(Van Hell etal.,Acta Endocrin.47:409(1964)其测量精囊增重而确定含LH的促性腺激素产品的LH生物活性。卵巢抗坏血酸消耗测定，其测量响应于对假孕大鼠施用外源LH治疗的卵巢抗坏血酸的减少(Parlow AF:Bioassay of pituitary luteinizing hormone by depletion of ovarian ascorbic acid.In Human Pituitary Gonadotropins Edited by:Albert A.Springfield；CC Thomas；1961:300-320)。与头一种提到的药典描述的测定法相比，这后一种测定法显示出对检测LH生物活性更高的灵敏度，灵敏度高几乎一个数量级。
[0890] 进一步地，将采用标准细胞测定法测定SUS-hCG的体外生物活性，如公开的MA10睾丸间质细胞生物测定法Ascoli,Endocrinology 108:88(1981)，或小鼠睾丸间质细胞测定法，其中通过诸如RIA测定的标准免疫学技术测量LH诱导的通过小鼠睾丸间质细胞的体外睾酮增加(Van Damme et al.,Acta Endocrinol.(Copenh.)1974:77；655)。
[0891] 对于所有的测定，将使SUS-hCG的生物活性与重组hCG和人尿源hCG进行比较，并且通过使用国家生物标准和控制学会(NIBSC Herts,UK)适当标准。
[0892] 将采用标准的免疫学技术来测定给定组合物中的hCG蛋白量，如ELISA测定或RIA测定法，并通过蛋白质印迹实验和采用Bradford和/或Lowry测定法测量总蛋白质含量来进行表征。
[0893] 实施例17
[0894] 如何测定与FSH相结合的长效修饰的LH(S-LH)的生物效力,如连接至酰化基团、PEG或人白蛋白的hLH
[0895] 将采用两种确立的体内测定法之一测定S-LH的生物效力。药典和官方要求Van Hell生物测定法。(Van Hell 30etal.,Acta Endocrin.47:409(1964)其测量精囊增重而确定含LH的促性腺激素产品的LH生物活性。卵巢抗坏血酸消耗测定，其测量响应于对假孕大鼠施用外源LH治疗的卵巢抗坏血酸的减少(Parlow 32AF:Bioassay of pituitary luteinizing hormone by depletion of ovarian ascorbic acid.In Human Pituitary Gonadotropins Edited by:Albert A.Springfield；CC Thomas；1961:300-20 320)。与头一种提到的药典描述的测定法相比，这后一种测定法显示出对检测LH生物活性更高的灵敏度，灵敏度高几乎一个数量级。
[0896] 进一步地，将采用标准细胞测定法测定S-LH的体外生物活性，如公开的MA10睾丸间质细胞生物测定法Ascoli,Endocrinology 108:88(1981)，或小鼠睾丸间质细胞测定法，其中通过诸如RIA测定的标准免疫学技术测量LH诱导的通过小鼠睾丸间质细胞的体外睾酮增加(Van Damme et al.,Acta Endocrinol.(Copenh.)1974:77；655)。
[0897] 对于所有的测定，将使S-LH的生物活性与重组hCG、重组LH和人尿源hCG进行比较，并且通过使用国家生物标准和控制学会(NIBSC Herts,UK)适当标准。
[0898] 将采用标准的免疫学技术来测定给定组合物中的LH蛋白量，如ELISA测定或RIA测定法，并通过蛋白质印迹实验和采用Bradford和/或Lowry测定法测量总蛋白质含量来进行表征。
[0899] 相对于天然LH和hCG激素，S-LH与FSH相结合以维持体内多卵泡发育和胚胎发育的效果实验将在小鼠中进行，如Yding Andersen C et al.,Requirements for human chorionic gonadotropin and recombinant human luteinizing hormone for fol l icular development and maturation.J.Assist.Reprod.Gen.,1999,16,536-541中所述。将用固定剂量的FSH刺激小鼠以诱导多卵泡发育并与不同量的LH/hCG活性相结合。将诱导小鼠排卵并使之与雄性交配。稍后将处死小鼠，回收输卵管并冲洗以测定存在的胚泡数。胚泡数将以半定量的方式表示LH组分的效力。
[0900] 实施例18
[0901] 如何测定与FSH相结合的长效修饰的LH的生物效力，如连接至酰化基团、PEG或人白蛋白的hLH
[0902] 可以采用两种确立的体内测定法之一测定长效LH的生物效力。药典和官方要求Van Hell生物测定法。(Van Hell et al.,Acta Endocrin.47:409(1964)其测量精囊增重而确定含LH的促性腺激素产品的LH生物活性。卵巢抗坏血酸消耗测定，其测量响应于对假孕大鼠施用外源LH治疗的卵巢抗坏血酸的减少(Parlow AF:Bioassay of pituitary luteinizing hormone by depletion of ovarian ascorbic acid.In Human Pituitary Gonadotropins Edited by:Albert A.Springfield；CC Thomas；1961:300-320)。与头一种提到的药典描述的测定法相比，这后一种测定法显示出对检测LH生物活性更高的灵敏度，灵敏度高几乎一个数量级。
[0903] 进一步地，将采用标准细胞测定法测定长效LH的体外生物活性，如公开的MA10睾丸间质细胞生物测定法Ascoli,Endocrinology 108:88(1981)，或小鼠睾丸间质细胞测定法，其中通过诸如RIA测定的标准免疫学技术测量LH诱导的通过小鼠睾丸间质细胞的体外睾酮增加(Van Damme et al.,Acta Endocrinol.(Copenh.)1974:77；655)。
[0904] 对于所有的测定，将使长效LH的生物活性与重组hCG、重组LH和人尿源hCG进行比较，并且通过使用国家生物标准和控制学会(NIBSC Herts,UK)适当标准。将采用标准的免疫学技术来测定给定组合物中的LH蛋白量，如ELISA测定或RIA测定法，并通过蛋白质印迹实验和采用Bradford和/或Lowry测定法测量总蛋白质含量来进行表征。
[0905] 实施例19
[0906] 在正常和切除垂体的雄性大鼠中的组合PK/PD研究数据。
[0907] 在时间0小时以不同的剂量皮下施用LH化合物。在不同的时间点采集大鼠血样，但至少每日进行长达四周。通过使用19G一次性使用的针头进行舌下取血采集每只大鼠的第一份血样。在麻醉下采集终末血样。
[0908] 每日在PBS-白蛋白缓冲液(0.1％白蛋白)中对参比和测试材料进行重构，并在施用之前调整浓度。在颈部以0.2ml/大鼠进行皮下施用。
[0909] 对于在切除垂体的大鼠中的研究，雄性Wistar大鼠95-110g购自Taconic-M&B，并采用穿耳程序进行垂体切除。对于正常大鼠中的研究，使用体重大约250g的雄性Spraque Dawley大鼠。
[0910] 按以下说明准备血清：
[0911] 将血样收集在具有凝血激活剂Sarstedt RefNo.41.1500.005的SST管中。将样品倒转5x，然后使之在环境温度下凝血30分钟。凝血10分钟后立即在2500G、20℃下离心样品。将血清分入两个储存小瓶—每个小瓶50μl。向其中一个小瓶添加300μl PBS/BSA。
[0912] 在离心后60分钟内将血清样品在≤-15℃下冷冻。
[0913] 如实施例X和Z中所述测量LH化合物的血清水平。如实施例Y中所述测量睾酮的血清水平。
[0914] 在最后一天通过CO2/O2过量麻醉将大鼠无痛致死。取出精囊，修整并吸干。测定和记录精囊的重量。
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