用于预测癌症复发的方法和装置

摘要

本发明涉及作为用于预测癌症患者的癌症复发的生物标志物的微RNA。本发明也涉及用于该目的的方法、装置和试剂盒。

权利要求

1.单链核酸分子在制备用于预测癌症患者的非小细胞肺癌(NSCLC)复发的装置中的用途，所述单链核酸分子是能够与第一生物标志物hsa-miR-513b的核苷酸或其互补序列特异性杂交的寡核苷酸探针，其中所述单链核酸分子可用于确定所述第一生物标志物在来自所述患者的样品中的表达水平。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述装置还包含以下单链核酸分子，所述单链核酸分子是能够与来自所述癌症患者的所述样品中至少一个第二生物标志物的核苷酸或其互补序列特异性杂交的寡核苷酸探针，所述第二生物标志物选自hsa-miR-650、hsa-miR-324-

3p和hsa-miR-1307，所述单链核酸分子可用于确定所述第二生物标志物在来自所述患者的样品中的表达水平。

3.根据权利要求1所述的用途，其中该样品是组织样品。

4.根据权利要求3所述的用途，其中该样品是肿瘤样品。

5.根据权利要求1所述的用途，其中该预测在第一癌症治疗之后，在所述患者中发生。

6.根据权利要求1所述的用途，其中该预测在第一癌症治疗之前，在所述患者中发生。

7.根据权利要求1所述的用途，其中该预测在第一癌症治疗之后，但是在第二癌症治疗之前，在所述患者中发生。

8.根据权利要求1所述的用途，其中该预测在第二癌症治疗之后，在所述患者中发生。

9.根据权利要求5-8中的任一项所述的用途，其中所述治疗包括外科手术、放射疗法和化学疗法中的一种或多种。

10.根据权利要求1所述的用途，其中如下确定所述样品中的所述生物标志物的表达水平：从所述样品收集核酸分子，并使用定量逆转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR) 来扩增所述核酸分子。

11.根据权利要求1所述的用途，其中所述单链核酸分子具有在10-100个核苷酸范围内的长度。

12.根据权利要求1所述的用途，其中该装置是微阵列装置。

13.根据权利要求1所述的用途，所述装置当在允许发生杂交的条件下与从样品制备的不同核酸分子群体接触时，允许确定所述第一生物标志物的表达水平。

14.根据权利要求2所述的用途，所述装置当在允许发生杂交的条件下与从样品制备的不同核酸分子群体接触时，允许确定所述第二生物标志物的表达水平。

说明书

用于预测癌症复发的方法和装置

技术领域

[0001] 本发明涉及用于预测癌症患者的癌症复发的方法、装置和试剂盒。

背景技术

[0002] 对得自患者的肿瘤样品进行基因表达分析已经被用于促进癌症预后和诊断。基因表达谱可以揭示患者中癌症的存在，其类型、分期阶段和起源，以及是否涉及基因突变。基因表达甚至可能在预测化学疗法的效力中起作用。

[0003] 近年来，已经发现了一类新的调节分子，即微RNA。确定它们在癌细胞中的浓度或表达已经揭示了其在癌症中的作用。已经证实，微RNA的检测可以用于确定癌症的起源部位，且可以用于区分侵袭性癌症和非侵袭性癌症。在基因和微RNA的表达水平中所含的信息是互补的，在预测或诊断方法中组合该信息可以产生在临床上更准确的和有用的结果。

[0004] 肺癌是具有高死亡率的疾病。即使在外科手术以后，大多数肺癌患者经历复发和死亡。如果切除的肿瘤的直径超过3 cm，护理标准是给患者提供化学疗法以预防复发。如果肿瘤的直径小于3 cm且没有观察到肿瘤的扩散(也被称作Ia期)，则不给患者提供进一步治疗。仍然有超过半数的肺癌患者经历复发，并在5年内死亡。

[0005] 需要在一种或多种针对癌症的医学治疗（包括外科手术）以后预测癌症患者的癌症复发的方法。

发明内容

[0006] 本发明包括用于在一种或多种癌症治疗(例如，外科手术、放射疗法和/或化学疗法)之前或之后预测癌症患者的癌症复发的方法，所述方法通过确定至少一种生物标志物(例如，超过一种生物标志物，诸如2、3或4种或更多种生物标志物)的表达水平进行，其中所述生物标志物与hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307(分别是SEQ ID NO: 1-4)中的任一个的序列具有至少85% (例如，85%、90%、95%、97%、99%或100%) 序列同一性。在一个实施方案中，所述方法涉及或者单一地或者以2种、3种或所有4种生物标志物的任意组合(同时地或依次地)确定生物标志物的表达水平，所述生物标志物具有hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b和hsa-miR-1307中的任一个的序列。

[0007] 在另一个实施方案中，本发明的方法可以包括：确定hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b和hsa-miR-1307生物标志物(或与hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b和hsa-miR-1307生物标志物中的任一个的序列具有至少85%、90%、95%、97%、99%或
100%序列同一性的生物标志物)的配对组合的表达水平。在另一个实施方案中，本发明的方法可以包括：确定hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b和hsa-miR-1307生物标志物(或与hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b和hsa-miR-1307生物标志物中的任一个的序列具有至少85%、90%、95%、97%、99%或100%序列同一性的生物标志物)的三联或四联组合的表达水平。本发明的方法可以包括：同时或依次确定2种或更多种生物标志物(例如，2、3或4种生物标志物)的表达水平。

[0008] 本发明的方法包括：确定得自癌症患者的样品中的生物标志物的表达水平。所述样品可以是血液样品或组织样品，例如，肿瘤样品。本发明的方法可以用于在癌症患者的第一癌症治疗之前或之后预测任意类型的癌症（例如，肺癌，诸如非小细胞肺癌）的复发。在本发明的一个实施方案中，预测癌症患者的癌症复发的方法可以发生在第一癌症治疗之后。可替换地，所述预测可以发生在第一癌症治疗之前。在另一个实施方案中，所述预测可以发生在在第一治疗之后但是在第二治疗之前。可替换地，所述预测可以发生在第二癌症治疗之后。在本发明中描述的癌症治疗可以包括以下的一种或多种：外科手术、放射疗法和化学疗法和/或本领域已知的用于治疗癌症的任意其它疗法。在本发明的一个方面，化学治疗剂可以包括以下的一种或多种：药物、抗体和寡核苷酸。

[0009] 在所述方法的一个方面，至少一种生物标志物(例如，与hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307(分别是SEQ ID NO: 1-4)中的任一个的序列具有至少85% (例如，85%、90%、95%、97%、99%或100%)序列同一性的生物标志物) 的表达水平的增加或下降，指示没有癌症复发的良好预后。可替换地，一种或多种生物标志物(例如，与hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307(分别是SEQ ID NO: 1-4)中的任一个的序列具有至少85% (例如，85%、90%、95%、97%、99%或100%)序列同一性的生物标志物)的表达水平的增加或下降指示癌症复发的不良预后。

[0010] 本发明的方法可以包括：基于癌症患者样品中的至少一种生物标志物(例如，与hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307(分别是SEQ ID NO: 1-4)中的任一个的序列具有至少85% (例如，85%、90%、95%、97%、99%或100%) 序列同一性的生物标志物)的表达水平与得自正常患者的样品或得自第一(或后续)癌症治疗以后的患者的样品中的一种或多种生物标志物的表达水平的对比，预测癌症复发。可替换地，一种或多种生物标志物的表达的检测会单独提供足够预测癌症复发的信息。

[0011] 本发明的方法可以包括：从患者(例如，癌症患者)样品(例如，组织样品，诸如肿瘤样品)收集核酸分子，并任选地使用定量逆转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR) 来扩增核酸分子，随后检测样品中的一种或多种生物标志物(例如，1、2、3或4种生物标志物)，或确定样品中的至少一种生物标志物(例如，1、2、3或4种生物标志物)的表达水平。

[0012] 本发明涉及装置，其可以用于检测至少一种生物标志物(例如，超过一种生物标志物，诸如2、3或4种或更多种生物标志物)的表达或确定所述生物标志物的表达水平，且可以包括：至少一种(例如，超过一种，诸如2、3或4种或更多种)单链核酸分子(也被称作寡核苷酸探针)，所述单链核酸分子与生物标志物的序列或它的互补序列具有至少85% (例如，85%、90%、95%、97%、99%或100%)序列同一性。所述生物标志物的序列包括hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307(分别是SEQ ID NO: 1-4)中的任一个的序列的至少5个(例如，5、6、7、8、10、12、15、20或22个) 连续核苷酸。例如，所述装置可以包括寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针可以用于检测得自患者(例如，癌症患者)的组织样品中的hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物标志物(分别是SEQ ID NO: 1-4) 或与这些生物标志物互补的序列中的任一个的表达。

[0013] 在一个实施方案中，所述装置包括寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针与hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物标志物中的任意一个或多个的序列或它们的互补序列具有至少100%序列同一性。所述装置可以包括寡核苷酸探针的配对、三联或四联组合，所述寡核苷酸探针与hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物标志物(分别是SEQ ID NO: 1-4)中的任一个的序列或它们的互补序列具有至少85%、90%、95%、97%、99%或100%序列同一性。

[0014] 所述装置允许所述装置的单链核酸分子(例如，寡核苷酸探针)与一种或多种生物标志物或它的一个或多个互补序列之间的特异性杂交。所述装置包括至少一种单链核酸分子，所述单链核酸分子具有在10-100个核苷酸范围内的长度(例如，10、20、25、30、40、60、80或100个核苷酸的长度，或在5-50、20-50或20-100个核苷酸范围内的长度)。当使所述装置与从样品制备的不同核酸分子群体在允许杂交的条件下接触时，所述装置中的寡核苷酸探针与它们的靶生物标志物杂交，并且可以检测至少一种生物标志物(例如，1、2、3或4种生物标志物)在样品(例如，患者组织样品)中的存在。可替换地，所述装置可以用于确定一种或多种(例如，1、2、3或4种)上述生物标志物的表达水平。在本发明的一个实施方案中，所述装置是微阵列装置。

[0015] 本发明包括用于预测癌症患者的癌症复发的方法，所述方法通过下述进行：使用上述装置来检测患者样品(例如，肿瘤样品)中的至少一种生物标志物(例如，与hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307(分别是SEQ ID NO: 1-4)中的任一个的序列具有至少85% (例如，85%、90%、95%、97%、99%或100%)序列同一性的生物标志物)或确定所述生物标志物的表达水平，使得一种或多种(例如，1、2、3或4种)生物标志物的检测或表达水平预示患者中的癌症复发的预后。所述样品可以得自被诊断出本文中描述的任一种癌症(例如，肺癌，更具体地，非小细胞肺癌)的患者。所述装置可以用于在第一癌症治疗之前或之后预测癌症患者的癌症复发。可替换地，所述装置可以用于在第一癌症治疗之后、但是在第二治疗之前预测癌症复发。在本发明的另一个方面，所述装置可以用于在第二癌症治疗之后预测癌症复发。

[0016] 所述方法的装置可以用于检测至少一种上述生物标志物(例如，1、2、3或4种生物标志物) 的表达水平的增加或下降，所述增加或下降指示没有癌症复发的良好预后。可替换地，所述装置可以用于检测一种或多种上述生物标志物(例如，1、2、3或4种生物标志物)的表达水平的增加或下降，所述增加或下降指示癌症复发的不良预后。

[0017] 所述装置可以用于预测癌症复发，这基于癌症患者样品中的一种或多种生物标志物的表达水平与得自正常患者的样品或得自第一癌症治疗之后的患者的样品中的表达水平的对比。可替换地，所述装置对一种或多种生物标志物的表达的检测，可以用于预测癌症复发。

[0018] 本发明也涉及试剂盒，其可以包括：用于从得自癌症患者的样品收集核酸分子的试剂，用于扩增从样品收集的核酸分子以产生扩增的样品的试剂，和至少一种用于检测扩增的样品中的至少一种生物标志物(例如，1、2、3或4种生物标志物)的表达水平的装置，所述生物标志物具有SEQ ID NO: 1-4中的任一个的序列。在一个实施方案中，可以使用定量逆转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR)来产生扩增的样品。所述试剂盒可以进一步包括关于基于至少一种生物标志物(例如，具有SEQ ID NO: 1-4中的任一个的序列的生物标志物的一种或多种或全部)的表达水平来预测癌症患者的癌症复发的说明书。

[0019] 在一个实施方案中，所述试剂盒可以包括上述的装置(例如，微阵列装置)，以检测样品中的至少一种(例如，1、2、3或4种)生物标志物(例如，具有SEQ ID NO: 1-4中的任一个的序列的生物标志物)，或确定样品中的至少一种(例如，1、2、3或4种)生物标志物的表达水平。所述试剂盒可以进一步包括关于将从样品收集的核酸分子应用于所述装置的说明书，和/或关于检测至少一种寡核苷酸探针与至少一种生物标志物或它的互补序列的杂交以便检测样品中的至少一种生物标志物的表达或确定所述生物标志物的表达水平的说明书。所述试剂盒可以进一步包括关于基于使用所述装置检测的所述至少一种生物标志物的表达水平来预测癌症患者的癌症复发的说明书。

[0020] 与预测癌症复发有关的生物标志物被鉴别为，在需要（warranted）预测的相关组之间差异表达的那些。例如，可以针对本发明的生物标志物测定得自癌症患者的样品，以根据患者在癌症治疗（例如，外科手术、放射疗法和/或化学疗法）以后是否经历复发而将患者分组。从样品提取总RNA（包括mRNA和微RNA），并根据标准操作进行标记。用一个或多个DNA微阵列（其含有与所述mRNA和/或微RNA互补的探针）测量得自每个已知基因的mRNA的量，或得自每个已知微RNA物种的微RNA的量。

[0021] 该方案可以用于mRNA生物标志物以及用于微RNA生物标志物。预后是基于mRNA生物标志物、微RNA生物标志物或它们的组合，其都是使用一个或多个DNA微阵列(或RT-PCR)针对提取自得自患者肿瘤的样品的标记的RNA来进行测量的。

[0022] 本发明的方法可以用于在治疗之前或之后预测癌症(例如，肺癌)复发。目前没有良好且准确的方法确定癌症会否复发。本文所述的方法可以被例如肿瘤科医生使用，以基于个别肿瘤的基因构成选择对于患者而言最适当的治疗。知晓复发的可能性将允许肿瘤科医生选择一种或多种适当的化学疗法方案，或外科手术、化学疗法和放射疗法的组合。

[0023] 本文中使用的“癌症患者”表示主体，例如，人类主体，其患有或曾患有癌症，且可能已经或尚未针对该癌症进行治疗。

[0024] 本文中使用的核酸序列的“互补物”或“互补”核酸序列表示这样的寡核苷酸：当它与核酸序列对齐时，处于“反向平行缔合”，使得一个序列的5'末端与另一个序列的3'末端配对。核苷酸和其它碱基可以具有互补物，且可以存在于互补核酸中。可以被包括在本发明的核酸中的天然核酸中不常见的碱基包括，例如，肌苷和7-脱氮鸟嘌呤。“互补性”可以是不完美的；互补核酸的稳定双链体可以包含错配碱基对或未配对碱基。核酸技术领域的技术人员可以根据经验考虑许多变量来确定双链体稳定性，所述变量包括例如寡核苷酸的长度、寡核苷酸中胞嘧啶和鸟嘌呤碱基的浓度百分比、离子强度和错配碱基对的发生率。

[0025] 当互补核酸序列形成稳定双链体时，它们被说成“杂交的”或彼此“杂交”，或者说“杂交”已发生。如果核酸包含根据沃森-克里克碱基配对规则（例如，G与C、A与T，或A与U）可以形成氢键的核苷酸或核苷酸类似物或其它氢键合基序（例如二氨基嘌呤与T、5-甲基C与G、2-硫胸苷与A、肌苷与C、假异胞嘧啶与G等），则所述核酸被称为“互补的”。反义RNA可以与其它寡核苷酸（例如，mRNA）互补。

[0026] 本文中使用的“生物标志物”表示基因或主体的遗传材料的其它部分：其以可以测量的形式表达(例如，作为mRNA、微RNA或蛋白质)，且其表达指示患者中的癌症复发的良好或不良预后。

[0027] 本文中使用的“标记基因”或“生物标记基因”是指细胞中的基因，所述基因的表达与细胞（且因此与从其获得细胞的患者）对治疗（例如，暴露于化合物）的敏感性或抗性关联。

[0028] 本文中使用的“微阵列”是指由任何每次定量一种或多种受试寡核苷酸（例如，DNA或RNA，或其类似物）的方法所采用的装置。微阵列的一个示例性种类由附着于玻璃或石英表面的DNA探针组成。例如，许多微阵列（包括由Affymetrix制备的那些）使用几种探针来确定单一基因的表达。DNA微阵列可以包含寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针可以是例如与RNA互补的全长cDNA，或与RNA的一部分杂交的cDNA片段。DNA微阵列还可以含有修饰形式的DNA或RNA，诸如锁定核酸或LNA。示例性的RNA包括mRNA、miRNA和miRNA前体。示例性微阵列还包括具有多个与底物结合的核酸的“核酸微阵列”，与多个被结合的核酸中的每一个的杂交是可分别检测的。底物可以是固体或多孔的、平面或非平面的、归一（unitary）或分散的。示例性核酸微阵列包括在下述参考文献中通常描述的所有装置：Schena (编), DNA Microarrays: A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford 
University Press (1999); Nature Genet. 21(1)(增刊):1-60 (1999); Schena (编), Microarray Biochip: Tools and Technology, Eaton Publishing Company/
BioTechniques Books Division (2000)。此外，示例性核酸微阵列包括多个与底物结合的核酸，其中多个核酸设置在多个珠上而不是归一的平面底物上，如特别是Brenner等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4):1665-1670 (2000)中描述的。核酸微阵列的例子可以在下述美国专利号中找到：6,391,623、6,383,754、6,383,749、6,380,377、6,379,897、6,
376,191、6,372,431、6,351,712 6,344,316、6,316,193、6,312,906、6,309,828、6,309,
824、6,306,643、6,300,063、6,287,850、6,284,497、6,284,465、6,280,954、6,262,216、6,
251,601、6,245,518、6,263,287、6,251,601、6,238,866、6,228,575、6,214,587、6,203,
989、6,171,797、6,103,474、6,083,726、6,054,274、6,040,138、6,083,726、6,004,755、6,
001,309、5,958,342、5,952,180、5,936,731、5,843,655、5,814,454、5,837,196、5,436,
327、5,412,087、5,405,783，它们的公开内容通过引用整体并入本文。

[0029] 示例性微阵列还可以包括具有多个与底物结合的多肽的“肽微阵列”或“蛋白质微阵列”，寡核苷酸、肽或蛋白质与多个被结合的多肽中每一个的结合是可分别检测的。可替代地，肽微阵列可以具有多个结合剂，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、噬菌体展示结合剂、酵母双杂交结合剂、适体，其可以特异性地检测特定寡核苷酸、肽或蛋白质的结合。肽阵列的例子可以在WO 02/31463、WO 02/25288、WO 01/94946、WO 01/88162、WO 01/
68671、WO 01/57259、WO 00/61806、WO 00/54046、WO 00/47774、WO 99/40434、WO 99/
39210、WO 97/42507和美国专利号6,268,210、5,766,960、5,143,854中找到，它们的公开内容通过引用整体并入本文。

[0030] 本文中使用的“基因表达”是指在细胞、组织、生物体或主体中的基因产物的量，例如DNA、RNA或蛋白质的量，DNA、RNA或蛋白质的修饰（例如剪接、磷酸化、乙酰化或甲基化）的量，或与给定基因相关的DNA、RNA或蛋白质的活性的量。

[0031] “治疗”或“医学治疗”是指给主体或活生物体施用化合物或使细胞或肿瘤暴露于化合物（例如，药物、蛋白质、抗体、寡核苷酸、化学治疗剂和放射性试剂）或用于治疗或预防癌症(例如，肺癌)或癌症征状的某些其它形式的医学干预(例如，冷冻疗法和放射疗法)。放射疗法包括给患者施用辐射，所述辐射从诸如粒子加速器和相关的医学装置来源产生，所述相关的医学装置发射X射线、γ射线或电子（β射线）束。治疗可以进一步包括外科手术，例如从主体或活生物体除去肿瘤。

[0032] 从以下的详细描述、附图和权利要求书会看到本发明的其它特征和优点。

附图说明

[0033] 图1的图显示了使用60-微RNA模型在留一法（leave-one-out）交叉验证中预测的78位非小细胞肺癌(NSCLC) 患者的复发的卡普兰-迈耶图。

[0034] 图2的图显示了使用4-微RNA模型在独立验证中预测的30位NSCLC患者的总存活率的卡普兰-迈耶图。

[0035] 详细描述

[0036] 本发明涉及用于在癌症治疗(例如，外科手术和/或使用一种或多种，并优选2种或更多种化学治疗剂和/或辐射的治疗)之前或之后确定得自患者样品的一种或多种生物标志物的表达水平以预测癌症患者的癌症复发的方法。本发明也涉及包括核酸探针的装置(例如，微阵列)，所述核酸探针可以检测来自患者样品的一种或多种生物标志物的表达。所述装置可以用于在治疗之前或之后预测患者中的癌症是否将复发。本发明也涉及试剂盒，其用于确定来自患者样品的一种或多种生物标志物的表达水平以预测癌症患者的癌症复发。根据本发明的方法可以使用在仪器上运行的软件来实现，所述仪器与检测装置（诸如微阵列）结合地用于测量基因表达。被包含在用于处理得自主体的肿瘤样品的试剂盒中的检测装置(例如，微阵列，诸如DNA微阵列)，以及用于读出所述装置和将结果转换成主体的预后的仪器，可以用于实现本发明的方法。

[0037] 癌症

[0038] 本发明的方法、装置和试剂盒可以用于预测患者的癌症复发，所述患者遭受或被诊断出癌症，例如，乳房、前列腺、肺(例如，非小细胞肺癌)、支气管、结肠、直肠、膀胱、皮肤、肾、胰腺、口腔、咽、卵巢、甲状腺、副甲状腺、胃、脑、食管、肝、肝内胆管、子宫颈、喉、心脏、睾丸、小肠、大肠、肛门、肛管、肛门直肠、外阴、胆囊、胸膜、骨、关节、下咽、眼和/或眼眶、鼻、鼻腔、中耳、鼻咽、输尿管、腹膜、网膜、肠系膜和/或胃肠的癌症，以及任意形式的癌症，包括，例如，慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、黑素瘤、癌、基底细胞癌、恶性间皮瘤、神经母细胞瘤、多发性骨髓瘤、白血病、视网膜母细胞瘤、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、霍奇金淋巴瘤、类癌瘤、急性肿瘤和/或软组织肉瘤(例如，优选地，癌症是膀胱、乳房、结肠、直肠、子宫、肾、肺、皮肤(例如，黑素瘤)、胰腺、前列腺、血液和/或骨髓(例如，白血病)、淋巴细胞(例如，非霍奇金淋巴瘤)和/或甲状腺的癌症)。

[0039] 癌症治疗

[0040] 本发明的方法、装置和试剂盒可以用于在第一治疗之前或之后确定癌症患者（例如，肺癌患者）中的癌症的复发潜力。所述第一治疗可以包括，例如，外科手术、放射疗法和/或化学疗法中的一种或多种。所述化学疗法可以包括，施用一种或多种(例如，2种或更多种) 下述药剂：长春新碱、顺铂、依托泊苷、氮杂鸟嘌呤、卡铂、阿霉素、阿柔比星、米托蒽醌、米托蒽醌、丝裂霉素、紫杉醇、吉西他滨、泰索帝、地塞米松、阿糖胞苷、甲泼尼龙、甲氨蝶呤、博来霉素、丙酮双脒腙、贝林司他、卡铂、5-fu (5-氟尿嘧啶)、伊达比星、美法仑、IL4-PR38、丙戊酸、全反式视黄酸(ATRA)、环磷酰胺、托泊替康、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA，伏立诺他)、缩酚酸肽(FR901228)、硼替佐米、瘤可宁、氟达拉滨、长春碱、白消安、达卡巴嗪、奥沙利铂、羟基脲、替加氟、柔红霉素、雌莫司汀、氮芥、链佐星、卡莫司汀、洛莫司汀、巯嘌呤、替尼泊苷、更生霉素、维A酸、异环磷酰胺、他莫昔芬、伊立替康、氟尿苷、硫鸟嘌呤、PSC 833、厄洛替尼（erlotinib）、赫赛汀、贝伐单抗、塞来考昔、氟维司群、易瑞沙、阿那曲唑、来曲唑、西妥昔单抗、利妥昔单抗、辐射、组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂和5-氮杂-2'-脱氧胞苷(地西他滨)。

[0041] 本发明的一个有益方面是，所述方法、装置和试剂盒可以用于在一种/次或多种/次针对癌症的治疗(例如，2、3、4、5、10、20、30种/次或更多种/次针对癌症的治疗)之前或之后如下所述预测癌症患者的癌症复发：同时或依次测定一种或多种(例如，2、3或4种) 选自hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307的生物标志物的表达水平。已经确定，这些生物标志物中的每一种的表达预示患者的癌症复发的预后。可以用于预测患者的癌症复发的其它生物标志物包括在下面表1和2中列出的生物标志物中的一种或多种。

[0042] 本发明的方法、装置和试剂盒还可以用于鉴别对一种或多种治疗有应答的患者亚群，所述治疗被认为对于治疗一般群体中的疾病(例如，癌症)是无效的。更一般而言，用一种或多种疗法治疗的癌症患者的癌症复发的预测，可以通过使用生物标志物的表达来实现，不论对患者的先前癌症治疗的认识如何。本发明的方法可以使用在仪器上运行的软件来实现，所述仪器与微阵列结合地用于测量基因表达。本发明的装置(例如，微阵列，诸如DNA和/或RNA微阵列)可以被包含在用于处理得自主体的肿瘤样品(例如，细胞、组织或器官样品，其含有肿瘤或肿瘤细胞)的试剂盒中，以及用于读出所述装置和将结果转换成主体的预后谱（prognosis profile）的仪器可以用于实现本发明的方法。

[0043] 本发明的生物标志物

[0044] 本发明涉及生物标志物，其与hsa-miR-513b (5’UUCACAAGGAGGUGUCAUUUAU3’；SEQ ID NO:1)、hsa-miR-650 (5’AGGAGGCAGCGCUCUCAGGAC3’；SEQ ID NO: 2)、hsa-miR-324-3p (5’ACUGCCCCAGGUGCUGCUGG3’；SEQ ID NO: 3)，和hsa-miR-1307 (ACUCGGCGUGGCGUCGGUCGUG；SEQ ID NO 4)中的任一个的序列具有至少85% (例如，85%、
90%、95%、97%、99%或100%)序列同一性。在下面的表1和2中列出了可以用于本发明的方法、装置和试剂盒中的其它生物标志物。这些其它生物标志物可以单独使用，或者与特定生物标志物联合使用，所述特定生物标志物与hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307中的任一个的序列具有85%或更多的序列同一性(例如，100%序列同一性)。优选地，本发明的生物标志物具有hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b和hsa-miR-
1307的序列，且可以用在下述的任意组合中(同时或依次)。此外，这4种生物标志物的任意组合可以与在表1和2中列出的一种或多种生物标志物一起使用(同时或依次)。

[0045] 所述方法的生物标志物可以用在下述的方法、装置和试剂盒中，以在一种或多种针对癌症的治疗（诸如上面列出的癌症治疗）之前或之后确定患者的癌症(例如，肺癌)的复发潜力。

[0046] 使用本发明的生物标志物预测癌症患者的癌症复发的方法

[0047] 本发明涉及用于在一种或多种针对癌症的治疗（例如，外科手术、放射疗法和/或化学疗法）之前或之后预测患有癌症的患者的癌症复发的方法，所述方法通过测量一种或多种(例如，1、2、3或4种)生物标志物的表达水平进行，所述生物标志物与hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307中的任一个的序列具有至少85% (例如，85%、90%、95%、97%、99%或100%)序列同一性。优选地，所述方法涉及单独地或以2种、3种或所有4种的任意组合(同时或依次)，确定具有hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b和hsa-miR-1307(分别是SEQ ID NO: 1-4)中的任一个的序列的生物标志物的表达水平。优选地，在至少一种针对癌症的治疗以后在患者中执行所述方法。

[0048] 例如，本发明的方法可以包括：确定hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b和hsa-miR-1307生物标志物(或与hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b和hsa-miR-1307生物标志物中的任一个的序列具有至少85%、90%、95%、97%、99%或100%序列同一性的生物标志物) 的配对组合的表达水平。具体地，可以同时或依次测量下述生物标志物配对组合的表达水平：

[0049] 1) hsa-miR-513b和hsa-miR-650；

[0050] 2) hsa-miR-513b和hsa-miR-324-3p；

[0051] 3) hsa-miR-513b和hsa-miR-1307；

[0052] 4) hsa-miR-650和hsa-miR-513b；

[0053] 5) hsa-miR-650和hsa-miR-324-3p；

[0054] 6) hsa-miR-650和hsa-miR-1307；

[0055] 7) hsa-miR-324-3p和hsa-miR-513b；

[0056] 8) hsa-miR-324-3p和hsa-miR-650；

[0057] 9) hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307；

[0058] 10) hsa-miR-1307和hsa-miR-513b；

[0059] 11) hsa-miR-1307和hsa-miR-650；和

[0060] 12) hsa-miR-1307和hsa-miR-324-3p。

[0061] 本发明的方法也可以包括：确定hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b和hsa-miR-1307生物标志物(或与hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物标志物中的任一个的序列具有至少85%、90%、95%、97%、99%或100%序列同一性的生物标志物)的三联组合的表达水平。具体地，可以同时或依次测量下述生物标志物三联组合的表达水平：

[0062] 1) hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p；

[0063] 2) hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-1307；

[0064] 3) hsa-miR-513b、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-650；

[0065] 4) hsa-miR-513b、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-1307；

[0066] 5) hsa-miR-513b、hsa-miR-1307、hsa-miR-650；

[0067] 6) hsa-miR-513b、hsa-miR-1307、hsa-miR-324-3p；

[0068] 7) hsa-miR-650、hsa-miR-513b、hsa-miR-324-3p；

[0069] 8) hsa-miR-650、hsa-miR-513b、hsa-miR-1307；

[0070] 9) hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513；

[0071] 10) hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-1307；

[0072] 11) hsa-miR-650、hsa-miR-1307、hsa-miR-513b；

[0073] 12) hsa-miR-650、hsa-miR-1307、hsa-miR-324-3p；

[0074] 13) hsa-miR- 324-3p、hsa-miR-513b、hsa-miR-650；

[0075] 14) hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b、hsa-miR-1307；

[0076] 15) hsa-miR-324-3p、hsa-miR-650、hsa-miR-513；

[0077] 16) hsa-miR-324-3p、hsa-miR-650、hsa-miR-1307；

[0078] 17) hsa-miR-324-3p、hsa-miR-1307、hsa-miR-513b；

[0079] 18) hsa-miR-324-3p、hsa-miR-1307、hsa-miR-650；

[0080] 19) hsa-miR-1307、hsa-miR-513b、hsa-miR-650；

[0081] 20) hsa-miR-1307、hsa-miR-513b、hsa-miR-324-3p；

[0082] 21) hsa-miR-1307、hsa-miR-650、hsa-miR-513b；

[0083] 22) hsa-miR-1307、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p；

[0084] 23) hsa-miR-1307、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b；和

[0085] 24) hsa-miR-1307、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-650。

[0086] 本发明的方法也可以包括：确定hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b和hsa-miR-1307生物标志物(或与hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物标志物中的任一个的序列具有至少85%、90%、95%、97%、99%或100%序列同一性的生物标志物)的四联组合的表达水平。具体地，可以同时或依次确定下述生物标志物四联组合的表达水平：

[0087] 1) hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-1307；

[0088] 2) hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-1307、hsa-miR-324-3p；

[0089] 3) hsa-miR-513b、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-650、hsa-miR-1307；

[0090] 4) hsa-miR-513b、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-1307、hsa-miR-650；

[0091] 5) hsa-miR-513b、hsa-miR-1307、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p；

[0092] 6) hsa-miR-513b、hsa-miR-1307、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-650；

[0093] 7) hsa-miR-650、hsa-miR-513b、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-1307；

[0094] 8) hsa-miR-650、hsa-miR-513b、hsa-miR-1307、hsa-miR-324-3p；

[0095] 9) hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b、hsa-miR-1307；

[0096] 10) hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-1307、hsa-miR-513b；

[0097] 11) hsa-miR-650、hsa-miR-1307、hsa-miR-513b、hsa-miR-324-3p；

[0098] 12) hsa-miR-650、hsa-miR-1307、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b；

[0099] 13) hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-1307；

[0100] 14) hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b、hsa-miR-1307、hsa-miR-1307；

[0101] 15) hsa-miR-324-3p、hsa-miR-650、hsa-miR-513b、hsa-miR-1307；

[0102] 16) hsa-miR-324-3p、hsa-miR-650、hsa-miR-1307、hsa-miR-513b；

[0103] 17) hsa-miR-324-3p、hsa-miR-1307、hsa-miR-513b、hsa-miR-650；

[0104] 18) hsa-miR-324-3p、hsa-miR-1307、hsa-miR-650、hsa-miR-513b；

[0105] 19) hsa-miR-1307、hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p；

[0106] 20) hsa-miR-1307、hsa-miR-513b、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-650；

[0107] 21) hsa-miR-1307、hsa-miR-650、hsa-miR-513b、hsa-miR-324-3p；

[0108] 22) hsa-miR-1307、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b；

[0109] 23) hsa-miR-1307、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b、hsa-miR-650；和

[0110] 24) hsa-miR-1307、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-650m、hsa-miR-513b。

[0111] 本发明的方法可以包括：从样品（例如，组织样品）收集核酸样品。所述样品优选地是得自癌症患者的肿瘤样品。例如，所述样品可以得自肺癌患者，诸如患有非小细胞肺癌的患者。本发明的方法可以任选地包括：使用例如聚合酶链式反应(PCR)，扩增核酸分子，以产生扩增的溶液。本发明的方法可以进一步包括：使用从样品收集的核酸分子，或使用上述的扩增的溶液，在热循环仪中执行qRT-PCR，以测量样品中的一种或多种生物标志物的表达水平。用于执行qRT-PCR的操作描述在例如美国专利号7,101,663和美国专利申请号2006/0177837和2006/0088856中，它们中的每一篇通过引用并入本文。可以在相同反应中同时确定样品中的hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b和hsa-miR-1307生物标志物中的
2种或更多种(和任选地，在表1和2中列出的一种或多种其它生物标志物)的表达水平。可替换地，可以在不同反应中同时确定样品中的hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b和hsa-miR-1307生物标志物中的2种或更多种(和任选地，在表1和2中列出的一种或多种其它生物标志物，如果需要的话)的表达水平。此外，可以在相同反应或分开的反应中相继地确定hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b和hsa-miR-1307生物标志物中的2种或更多种(以及在表1和2中列出的一种或多种其它生物标志物，如果需要的话)的表达水平。

[0112] 本发明的方法还可以包括，在一种或多种癌症治疗（例如，外科手术、放射疗法和/或化学疗法）以后，基于样品中的hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b和hsa-miR-1307生物标志物中的一种或多种(和任选地，在表1和2中列出的一种或多种其它生物标志物，如果需要的话)的表达水平，预测癌症患者的癌症复发。

[0113] 例如，一种或多种生物标志物的表达水平的增加可以指示一种或多种癌症治疗（诸如上述的那些治疗）以后没有复发的良好预后。可替换地，一种或多种生物标志物的表达水平的下降可以指示一种或多种癌症治疗（诸如上述的那些治疗）以后没有复发的良好预后。此外，一种或多种生物标志物的表达水平的增加可以指示一种或多种癌症治疗以后癌症复发的不良预后。可替换地，一种或多种生物标志物的表达水平的下降可以指示一种或多种癌症治疗以后癌症复发的不良预后。可替换地，检测任一种生物标志物的表达可以单独地指示癌症治疗以后癌症患者中的癌症复发的预后。

[0114] 良好预后表示这样的情况：其中患者在第一癌症治疗之后将存活至少5年(例如，4、5、6、7、8、10或12年或更多年)，而不良预后表示这样的情况：其中患者在第一癌症治疗之后可能不会存活至少5年。卡普兰-迈耶曲线可以用于对比随时间的存活，如图1和2所示。

[0115] 在用于预测癌症复发的方法中，可以相对于正常细胞中的表达水平，或相对于得自已经经历第一疗程的患者的癌细胞中的表达水平，确定一种或多种生物标志物的表达水平。

[0116] 使用本发明的生物标志物进行癌症预后的装置和方法

[0117] 本发明涉及包括一种或多种寡核苷酸探针的装置，所述寡核苷酸探针具有的序列与hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物标志物中的一种或多种的序列的至少5个(例如，5、6、7、8、10、12、15、20或22个；优选22个)连续核苷酸(或核苷酸类似物)相同或互补。所述装置的寡核苷酸探针还可以包括这样的序列：与hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物标志物(分别是SEQ ID NO: 1-4)中的任一个的序列或它们的互补物在至少约5个(例如，5、6、7、8、10、12、15、20或22个；优选22个) 连续核苷酸(或核苷酸类似物)内具有至少85% (例如，85%、90%、95%、97%、99%或100%)序列同一性的序列。例如，所述装置可以包括这样的寡核苷酸探针：其可以用于检测得自患者的组织样品中的hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物标志物(分别是SEQ ID NO: 1-4)中的任意一种或多种(例如，任意组合) 或与这些生物标志物互补的序列的存在或表达水平。

[0118] 优选地，本发明的装置包括这样的寡核苷酸探针：其具有的序列与hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物标志物(分别是SEQ ID NO: 1-4)中的一种或多种的序列或它们的互补物在至少约22个连续核苷酸(或核苷酸类似物)内具有至少85%序列同一性。更优选地，所述装置包括这样的寡核苷酸探针：其与hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物标志物中的任意一个或多个的序列或它们的互补物具有至少100%序列同一性。所述装置可以包括这样的探针：其可以用于检测仅一种生物标志物的存在或表达水平，或者它们可以包括这样的探针：其可以用于检测2、3或4种生物标志物的组合的存在或表达水平。

[0119] 例如，所述装置可以包括寡核苷酸探针的下述配对组合，所述寡核苷酸探针与hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物标志物(分别是SEQ ID NO: 1-4)中的任一个的序列或它们的互补物在至少约5个(例如，5、6、7、8、10、12、15、20或22个；优选22个)连续核苷酸(或核苷酸类似物)内具有至少85%、90%、95%、97%、99%或100%序列同一性：

[0120] 1)hsa-miR-513b和hsa-miR-650；

[0121] 2)hsa-miR-513b和hsa-miR-324-3p；

[0122] 3) hsa-miR-513b和hsa-miR-1307；

[0123] 4) hsa-miR-650和hsa-miR-324-3p；

[0124] 5) hsa-miR-650和hsa-miR-1307；

[0125] 6) hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307。

[0126] 优选地，所述装置包括这样的寡核苷酸探针的配对组合，所述寡核苷酸探针与hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物标志物(分别是SEQ ID NO: 1-4)中的任一个的序列或它们的互补物在至少约22个连续核苷酸(或核苷酸类似物)内具有至少85%序列同一性。更优选地，所述装置包括这样的寡核苷酸探针的配对组合，所述寡核苷酸探针与hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物标志物(分别是SEQ ID NO: 1-4)中的任一个的序列或它们的互补物在至少约22个连续核苷酸(或核苷酸类似物)内具有至少100%序列同一性。

[0127] 所述装置还可以包括寡核苷酸探针的下述三联组合，所述寡核苷酸探针与hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物标志物(分别是SEQ ID NO: 1-4) 中的任一个的序列或它们的互补物在至少约5个(例如，5、6、7、8、10、12、15、20或22个)连续核苷酸(或核苷酸类似物)内具有至少85%、90%、95%、97%、99%或100%序列同一性：

[0128] 1)hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p；

[0129] 2)hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-1307；

[0130] 3) hsa-miR-513b、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-1307；和

[0131] 4) hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-1307。

[0132] 优选地，所述装置包括这样的寡核苷酸探针的三联组合，所述寡核苷酸探针与hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物标志物(分别是SEQ ID NO: 1-4)中的任一个的序列或它们的互补物在至少约22个连续核苷酸(或核苷酸类似物)内具有至少85%序列同一性。更优选地，所述装置包括这样的寡核苷酸探针的三联组合，所述寡核苷酸探针与hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物标志物(分别是SEQ ID NO: 1-4) 中的任一个的序列或它们的互补物在至少约22个连续核苷酸(或核苷酸类似物)内具有至少100%序列同一性。

[0133] 所述装置还可以包括这样的寡核苷酸探针：其与hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物标志物(分别是SEQ ID NO: 1-4)中的每一个的序列或它们的互补物在至少约5个(例如，5、6、7、8、10、12、15、20或22个)连续核苷酸(或核苷酸类似物)内具有至少85%、90%、95%、97%、99%或100%序列同一性。优选地，所述装置包括这样的寡核苷酸探针：其与hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物标志物(分别是SEQ ID NO: 1-4)中的每一个的序列或它们的互补物在至少约22个连续核苷酸(或核苷酸类似物)内具有至少85%序列同一性。更优选地，所述装置包括这样的寡核苷酸探针：其与hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物标志物(分别是SEQ ID NO: 1-4)中的每一个的序列或它们的互补物在至少约22个连续核苷酸(或核苷酸类似物)内具有至少100%序列同一性。

[0134] 上述装置的寡核苷酸探针可以具有例如5-20、25、5-50、5-100、25-100、50-100个或超过100个核苷酸的长度。所述寡核苷酸探针可以是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。

[0135] 本发明也涉及使用上述装置检测患者样品中的hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b和hsa-miR-1307生物标志物之一、或者hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b和hsa-miR-1307生物标志物中的2种或更多种的任意组合的表达或者确定其表达水平从而在癌症治疗以后预测癌症复发的方法。

[0136] 本发明的含有一种或多种寡核苷酸探针的装置可以是微阵列装置。所述微阵列装置可以含有寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针可以是，例如，与RNA(例如，mRNA)或微RNA对应或互补的cDNA，或者所述寡核苷酸探针可以是与RNA (例如，mRNA)或微RNA的一部分杂交的cDNA片段。示例性的RNA包括miRNA和miRNA前体。示例性的微阵列也包括具有多个与底物结合的核酸的“核酸微阵列”，与所述多个结合的核酸中的每一个的杂交是可单独检测的。

[0137] 本发明的微阵列可以包括一种或多种寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针的核苷酸序列与hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b和hsa-miR-1307生物标志物的例如至少5、8、12、20、22、30、40、60、80、100、150或200个连续核苷酸(或核苷酸类似物)相同或互补，和/或与下面表1和2列出的一种或多种生物标志物相同或互补。所述寡核苷酸探针可以具有在例如5-20、5-50、25-50、5-100、25-100、50-100个或超过100个核苷酸范围内的长度。所述寡核苷酸探针可以是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或其类似物，诸如LNA。用作对癌症治疗的应答性的生物标志物的寡核苷酸探针内的连续核苷酸(例如，5-20、25、5-50、
50-100，或超过100个连续核苷酸) 也可以作为本文描述的一种或多种基因中的连续核苷酸出现，其始于下面表1和2中列出的基因的例如第1个、第10个、第20个、第30个、第40个、第
50个、第60个、第70个、第80个、第90个、第100个、第150个、第200个、第500个或第1000个核苷酸处或附近。

[0138] 当将从样品（例如，患者样品）制备的不同核酸分子群体应用于上述装置时，样品中的一种或多种靶核酸分子与所述装置上的一种或多种探针杂交。这种杂交允许检测样品中的一种或多种靶核酸分子(例如，本文中描述的一种或多种生物标志物)和/或确定所述靶核酸分子的量，并提供一种或多种靶核酸分子的表达水平的读出。所述一种或多种靶核酸分子可以是上述的hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物标志物中的任一个，以及还可以包括下面表1和2中描述的任意一种或多种生物标志物。上述装置可以用于同时地(或依次地)检测这些生物标志物中的一种或多种或确定其表达水平。任选地，在使用本发明的装置进行检测之前，可以使用例如PCR扩增从样品分离出的核酸分子，以产生扩增的样品。然后可以将扩增的样品应用于本发明的装置。

[0139] 本发明的装置可以用在这样的方法中，所述方法在一种或多种癌症治疗之前和/或之后，确定样品中的hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物标志物中的一种或多种的表达水平以预测癌症患者的癌症复发。所述装置可以用于同时地(或依次地) 确定多种生物标志物（例如，2、3或4种生物标志物）的表达水平，并使用该信息来确定患者的癌症复发预后。

[0140] 在一个实施例中，在处理之前，将细胞/组织样品在液氮中快速冷冻。按照生产商的说明书，使用例如得自Invitrogen的Trizol试剂，可以提取RNA。按照生产商的说明书，使用例如得自Ambion Inc.的MessageAmp试剂盒，可以扩增RNA。使用例如RecoverAll (Ambion Inc.)，可以从福尔马林固定的石蜡包埋样品提取微RNA，并使用例如Genisphere HSR (GenisPhere Inc.)进行标记。使用生产商的说明书，使用例如得自Affymetrix Inc的HG-U133A GeneChip和相容的仪器（例如，得自Affymetrix的GCS3000Dx），可以定量扩增的RNA。使用Affymetrix miRNA 1.0或2.0版，可以定量微RNA。

[0141] 可以进一步处理得到的基因表达测量结果，例如，如在实施例1-3中所述。使用可从R-Project得到的R软件，并补充可从Bioconductor得到的包，可以实现描述的操作。

[0142] 就肺癌预后而言，hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物标志物中的任一个可足以给出准确预测。优选地，使用hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物标志物中的2种或更多种。另外，3-50种mRNA或微RNA生物标志物（诸如在表1和2中列出的那些）可以用于提供甚至更准确的预测。鉴于所需的生物标志物的数目相对地小，可以执行诸如定量逆转录酶聚合酶链式反应(qRT-PCR)等操作，以更大精确度确定在样品中表达的生物标志物的量。这将提供上述装置的使用的替代或补充。例如，可以单独地或与本文中描述的微阵列联合地执行qRT-PCR。

[0143] 用于在癌症治疗以后预测癌症患者的癌症复发的试剂盒

[0144] 本发明也涉及用于在一种或多种癌症治疗以后预测癌症患者(例如，肺癌患者)的癌症复发的试剂盒。所述试剂盒可以包括用于从得自患者的样品收集核酸分子的试剂。例如，所述试剂盒可以包括用于裂解患者样品的试剂，和/或用于从患者样品分离和纯化RNA的试剂。所述试剂盒可以进一步包括用于例如通过PCR扩增从患者样品分离出的核酸分子的试剂。所述试剂盒可以包括使用本领域已知的测定（例如，qRT-PCR）来确定一种或多种生物标志物的表达水平的试剂，所述生物标志物与hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b和hsa-miR-1307生物标志物中的任一个的序列或它们的互补物具有至少85% (例如，
85%、90%、95%、97%、99%或100%)序列同一性。所述试剂盒可以包括引物和探针，所述引物和探针用于执行qRT-PCR以确定上述生物标志物的表达水平。所述试剂盒可以包括基于使用所述试剂盒确定的一种或多种生物标志物的表达水平而预测癌症复发的说明书。

[0145] 所述试剂盒可以进一步包括上述装置中的任一种，可以向其应用得自患者的核酸样品或扩增的溶液，使得所述装置上的探针可以与样品中的靶生物标志物杂交，并提供样品中的一种或多种生物标志物(例如，hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物标志物中的一种或多种)的表达水平的读出。所述装置允许同时(或依次) 测量样品中的一种或多种生物标志物的表达水平。所述试剂盒中的装置可以是微阵列装置。所述试剂盒可以进一步包括，关于基于使用上述装置确定的一种或多种生物标志物的表达水平而预测癌症患者的癌症复发（例如，良好预后或不良预后）的说明书。另外，所述试剂盒的装置可以与基于qRT-PCR的测定联合使用，以确定一种或多种生物标志物的表达水平。此外，所述试剂盒可以包括基于生物标志物的表达水平而预测癌症复发的软件程序。

[0146] 在一个实施例中，所述试剂盒可以包括用于从肿瘤提取RNA的试剂(例如，得自Invitrogen Inc的Trizol)，用于扩增RNA的试剂(例如，得自Ambion Inc的MessageAmp)，用于确定基因表达的微阵列(例如，得自Affymetrix Inc的HG-U133A GeneChip)，微阵列杂交站和扫描仪(例如，得自Affymetrix Inc的GeneChip System 3000Dx)，和用于分析如本文中所述的生物标志物的表达水平的软件(例如，在得自R-Project的R或得自Insightful Corp.的S-Plus中实现)。实施例

[0147] 实施例1: 可用于肺癌预后的微RNA

[0148] 将得自79位具有病理学第1期 NSCLC的患者的福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织样本用于分析。从Roswell Park Cancer Institute的肿瘤登记收集临床数据，并通过病历审查（chart review）进行验证。将组织脱蜡，并提取miRNA。在提取的RNA的质量控制评估以后，执行与基于锁定核酸(LNA) 的阵列平台(Exiqon Inc.)的杂交，所述平台含有针对miRBase 11版中的所有miRs的探针。对得自阵列的数据进行背景校正和Loess标准化。在留一法交叉验证中，使用多重检验校正（剩下0.1%的假发现率），用t-检验选择在具有复发的患者和没有复发的患者之间差异表达的miRNA。对得到的miRNA进行主组分分析，并将5个最重要的组分用于训练使用分类算法K最近邻、最近形心、神经网络和支持向量机的多变量分类器。通过分类算法中的大多数投票，将留出的样品预测为良好或不良预后。针对良好和不良预后组，制备到复发的时间的卡普兰-迈耶图。进行2个组之间的差异的统计显著性的对数秩检验。

[0149] 结果–在79个样品中，78个样品通过了杂交的质量控制条件。如上详述地进行的数据分析导致60种微RNA被所有78个分类器选择。表1显示所述60种微RNA并连同在所有78个样品的分析中统计上显著的共157种微RNA (FDR=1%)，并为其计算P-值和log2倍数变化。60-基因模型以统计上显著的方式预测出结果(图1)。

[0150] 实施例2：可用于肺癌预后的微RNA

[0151] 使用少至2或3种微RNA来得到如在实施例1中描述的肺癌样品的分类是可能的。如果所述2或3种微RNA是选自hsa-miR-141、hsa-miR-22、hsa-miR-200b*、hsa-miR-630、hsa-miR-27a、hsa-miR-510、hsa-miR-30c-1*的名单，可以实现与图1所示的结果类似的分类表现。具有0的截止值的第一主要组分可以单独地用于预测复发或非复发。也可以使用基于选自表1的2或3种微RNA的表达的其它分类方法。

[0152] 实施例3：使用具有与微RNA互补的DNA探针的Affymetrix阵列

[0153] 实施例1和2涉及使用得自Exiqon的锁定核酸平台来鉴别微RNA，所述微RNA可以用于区分具有良好预后和不良预后的患者。基于DNA的平台（诸如Affymetrix）具有不同的物理和化学性能，并且将产生用于相同目的的不同的最佳微RNA名单。在Affymetrix GeneChip® miRNA 1.0阵列上，分析了在实施例1中使用的相同的FFPE样品。对于每个样品，使用恒定总RNA进行标准化。使用支持向量机svm（得自www.bioconductor.org的文库e1071，具有默认参数）来训练预测器。在交叉验证实验中，在Affy平台上的下述3种微RNA探针会最佳地分离不良预后与良好预后的患者：hsa- hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-513b。在这些中，hsa-miR-513b对预后的贡献最大，其次是hsa-miR-650，再其次是hsa-miR-324-3p（它的重要性最低）。如果需要第四种miR，可以使用hsa-miR-1307，并且可以提高一些数据集的表现。

[0154] 实施例4：得自实施例3的4-微RNA谱的独立验证

[0155] 在31位处于Ia期的NSCLC患者的组群中，独立地验证了得自实施例3的3-微RNA谱(图2)。以与实施例3中的组群相同的方式将该组群标准化。使用在得自实施例3的组群上训练过的支持向量机，预测患者具有良好预后或不良预后。在图2中的卡普兰-迈耶曲线显示了2个预测组的总存活率。在良好和不良预后组之间存在存活率的统计上显著的差异(在对数秩检验中，P=0.0001)。

[0156] 表1. 表示在miRCURY LNA阵列(v.10.0, Exiqon)上的miRNA的探针ID的名单。60-基因表示在留一法交叉验证中该miRNA是否被所有分类器选择。“是”的值指示该miRNA是更可靠和重要的。

[0157] ID      名称            log2(FC) P-值              60-基因[0158] 17327   hsa-miR-630     -0.421  2.74e-09                 是

[0159] 17859   hsa-miR-200b*   -0.438  8.78e-09                 是

[0160] 42834   hsa-miR-219-2-3p -0.606  1.11e-07                 否

[0161] 42682   hsa-miR-25      0.979   1.47e-07                 否

[0162] 42957   hsa-miR-323-3p  -0.536  2.99e-07                 否

[0163] 42702   hsa-miR-30c-1*  -0.426  3.22e-07                 是

[0164] 42593   hsa-miR-623     -0.551  3.23e-07                 是

[0165] 5250    hsa-miR-105     1.14    3.75e-07                 否

[0166] 42524   hsa-miR-21*     0.77    1.46e-06                 否

[0167] 17752   hsa-let-7f      1.13    1.5e-06                  否

[0168] 10986   hsa-miR-193a-3p 1.1     2.03e-06                 否

[0169] 42811   hsa-miR-542-5p  -0.539  2.45e-06                 是

[0170] 33596   hsa-miR-126*    1.17    2.48e-06                 否

[0171] 19593   hsa-miR-27a     1.28    2.51e-06                 是

[0172] 27720   hsa-miR-15a     1.23    2.82e-06                 否

[0173] 30687   hsa-miR-93      1.14    2.85e-06                 否

[0174] 11065   hsa-miR-335     1.17    3.29e-06                 否

[0175] 11142   hsa-miR-510     -0.325  3.36e-06                 是

[0176] 42458   hcmv-miR-US25-1* -0.51   3.59e-06                 是

[0177] 14302   hsa-miR-374b    1.01    4.21e-06                 否

[0178] 27537   ebv-miR-BART13  -0.432  4.5e-06                  是

[0179] 13132   hsa-miR-519e*   -0.325  5.12e-06                 是

[0180] 27378   hsa-miR-374a    1.23    5.17e-06                 否

[0181] 10985   hsa-miR-191     1.16    5.35e-06                 是

[0182] 10995   hsa-miR-199a-3p/

[0183]       hsa-miR-199b-3p 1.26    5.37e-06                 否

[0184] 10138   hsa-miR-130a    1.13    5.92e-06                 否

[0185] 11078   hsa-miR-365     0.661   6.44e-06                 否

[0186] 27551   hsa-miR-612     -0.325  6.58e-06                 是

[0187] 13143   hsa-miR-301a    1.11    7.03e-06                 否

[0188] 17552   hsa-miR-617     -0.433  7.07e-06                 是

[0189] 11022   hsa-miR-221     0.931   8.4e-06                  否

[0190] 17836   hsa-miR-30b*    -0.392  8.52e-06                 是

[0191] 10972   hsa-miR-181b    0.596   9.57e-06                 否

[0192] 42513   hsa-miR-300     -0.339  1.16e-05                 是

[0193] 42533   hiv1-miR-H1     -0.408  1.16e-05                 否

[0194] 29562   hsa-miR-199a-5p 1.22    1.18e-05                 是

[0195] 27541   hcmv-miR-UL70-3p -0.517  1.18e-05                 否

[0196] 13175   hsa-miR-27b     1.26    1.2e-05                  是

[0197] 42838   miRPlus_42838   -0.387  1.28e-05                 是

[0198] 10998   hsa-miR-19b     1.34    1.42e-05                 否

[0199] 10967   hsa-miR-16      1.35    1.62e-05                 是

[0200] 11020   hsa-miR-22      1.03    1.74e-05                 是

[0201] 10306   hsa-miR-146b-5p 1.02    1.75e-05                 否

[0202] 42467   hsa-miR-129-5p  -0.485  1.88e-05                 是

[0203] 42843   hsa-miR-654-5p  -0.411  2.11e-05                 是

[0204] 42865   hsa-miR-181a    0.795   2.11e-05                 是

[0205] 4610    hsa-miR-126     1.08    2.11e-05                 是

[0206] 4700    hsa-miR-140-5p  0.923   2.17e-05                 否

[0207] 11023   hsa-miR-222     0.881   2.21e-05                 是

[0208] 19011   hsa_SNORD10     0.903   2.22e-05                 是

[0209] 17541   ebv-miR-BART1-5p -0.268  2.84e-05                 否

[0210] 5740    hsa-miR-21      1.5     2.91e-05                 是

[0211] 19015   hsa-miR-142-5p  1.14    3.03e-05                 否

[0212] 11182   hsa-miR-98      0.837   3.12e-05                 否

[0213] 11151   hsa-miR-516b    -0.265  3.17e-05                 是

[0214] 17608   hsa-miR-425     0.753   3.35e-05                 否

[0215] 17460   hsa-miR-657     -0.359  3.48e-05                 是

[0216] 19580   hsa-let-7i      1.03    3.63e-05                 是

[0217] 10997   hsa-miR-19a     1.35    3.67e-05                 否

[0218] 28191   hsa-miR-30e     1.13    3.71e-05                 否

[0219] 11104   hsa-miR-422a    0.423   3.78e-05                 否

[0220] 42717   hsa-miR-92b*    -0.447  3.94e-05                 是

[0221] 27565   hsa-miR-423-5p  -0.238  4.03e-05                 是

[0222] 42929   hsa-miR-25*     -0.279  4.33e-05                 是

[0223] 17445   hsa-miR-610     -0.352  4.94e-05                 是

[0224] 11279   U6-snRNA-2      0.587   5.54e-05                 是

[0225] 42532   hsa-miR-22*     0.455   5.73e-05                 否

[0226] 19005   hsa_SNORD118    0.665   5.91e-05                 是

[0227] 42738   hsa-miR-340*    -0.397  6.04e-05                 是

[0228] 19602   hsa-let-7g      0.859   6.81e-05                 否

[0229] 42831   hsa-miR-28-5p   0.953   7.32e-05                 否

[0230] 31026   hsa-miR-101     1.01    7.48e-05                 否

[0231] 19591   hsa-miR-199b-5p 1.04    7.51e-05                 否

[0232] 42758   hsa-miR-640     -0.389  7.78e-05                 是

[0233] 29460   hsa-miR-553     -0.249  7.94e-05                 否

[0234] 17328   ebv-miR-BART8*  -0.465  7.99e-05                 是

[0235] 42744   hsa-miR-23a     1.25    8.62e-05                 是

[0236] 11040   hsa-miR-29b     1.17    8.91e-05                 否

[0237] 42832   hsa-miR-638     -0.381  9.56e-05                 是

[0238] 42570   hsa-miR-194*    -0.448  9.65e-05                 是

[0239] 19604   hsa_SNORD4A     0.728   0.000105                 是

[0240] 42795   kshv-miR-K12-3  -0.326  0.000108                 是

[0241] 10962   hsa-miR-154     0.719   0.000127                 否

[0242] 42902   hsa-miR-185     0.375   0.000129                 是

[0243] 42754   hsa-miR-586     -0.31   0.000135                 是

[0244] 42887   hsa-miR-331-3p  0.473   0.000139                 是

[0245] 17561   ebv-miR-BART6-3p -0.452  0.00014                  是

[0246] 19585   hsa-miR-148b    0.757   0.000146                 否

[0247] 17567   kshv-miR-K12-1  -0.206  0.00015                  否

[0248] 42650   hsa-miR-17      1.13    0.000153                 是

[0249] 32884   hsa-miR-342-3p  0.974   0.000162                 否

[0250] 17358   ebv-miR-BART16  -0.345  0.000164                 是

[0251] 19582   hsa-miR-106b    0.96    0.000167                 是

[0252] 42652   hsa-miR-584     -0.438  0.000178                 是

[0253] 42802   hsa-miR-150     -0.236  0.000187                 是

[0254] 10928   hsa-miR-125a-5p 0.531   0.000189                 是

[0255] 33430   hsa-miR-548b-3p -0.307  0.000191                 是

[0256] 42739   hsa-miR-339-5p  0.533   0.000192                 是

[0257] 13485   hsa-miR-10a     0.882   0.000195                 否

[0258] 13148   hsa-miR-195     0.892   2e-04                    否

[0259] 11030   hsa-miR-26a     1.19    0.000203                 否

[0260] 42693   hsa-miR-326     -0.414  0.000209                 是

[0261] 10946   hsa-miR-141     1.08    0.000209                 是

[0262] 17646   ebv-miR-BHRF1-3 -0.222  0.000211                 是

[0263] 42648   hsa-miR-106a    1.16    0.000213                 是

[0264] 42564   hsa-miR-26b     1.18    0.000237                 否

[0265] 10925   hsa-miR-10b     0.781   0.00025                  否

[0266] 42700   hsa-miR-631     -0.532  0.000254                 否

[0267] 11024   hsa-miR-223     0.727   0.000273                 否

[0268] 19581   hsa-miR-100     0.796   0.000273                 否

[0269] 17280   hsa-miR-15b     1.06    0.000291                 否

[0270] 42442   hsa-miR-498     -0.252  0.000325                 否

[0271] 19008   hsa_SNORD2      0.48    0.000357                 否

[0272] 27533   hsa-miR-320a    0.543   0.00036                  否

[0273] 10919   hsa-miR-103     0.427   0.000361                 否

[0274] 42528   hsa-miR-296-3p  -0.335  0.000372                 否

[0275] 42609   hsa-miR-135a*   -0.295  0.000373                 否

[0276] 42951   ebv-miR-BHRF1-2 -0.345  0.000398                 否

[0277] 17506   hsa-miR-24      1.26    0.000411                 否

[0278] 17718   hsa-miR-92b     0.547   0.000425                 否

[0279] 29872   hsa-miR-340     0.338   0.000431                 否

[0280] 28431   miRPlus_28431   -0.167  0.000436                 否

[0281] 11053   hsa-miR-32      0.881   0.000448                 否

[0282] 42603   hsa-miR-424*    -0.291  0.00045                  否

[0283] 42965   hsa-miR-424     0.629   0.000518                 否

[0284] 42529   hsa-miR-939     -0.229  0.00053                  否

[0285] 19606   hsa_SNORD12     0.264   0.000534                 否

[0286] 17952   miRPlus_17952   -0.231  0.000534                 否

[0287] 42630   hsa-miR-140-3p  0.744   0.00056                  否

[0288] 11027   hsa-miR-23b     1.14    0.000573                 否

[0289] 42640   hsa-miR-20b     1.01    0.000582                 否

[0290] 42649   hsa-miR-20a     0.995   0.000596                 否

[0291] 11048   hsa-miR-30a     0.83    0.000605                 否

[0292] 42679   hsa-miR-642     -0.29   0.000615                 否

[0293] 42527   hsa-miR-935     -0.447  0.000622                 否

[0294] 11134   hsa-miR-502-5p  -0.152  0.000651                 否

[0295] 17613   hsa-miR-645     -0.346  0.000655                 否

[0296] 42751   hsa-miR-720     0.501   0.000717                 否

[0297] 11224   hsa-miR-30e*    0.687   0.000725                 否

[0298] 17822   hsa-miR-490-5p  -0.363  0.000729                 否

[0299] 42695   hsa-miR-596     -0.36   0.000743                 否

[0300] 42486   hsa-miR-149*    -0.238  0.000744                 否

[0301] 10978   hsa-miR-184     -0.21   0.000749                 否

[0302] 11041   hsa-miR-29c     0.858   0.000763                 否

[0303] 42782   hcmv-miR-UL148D -0.303  0.00078                  否

[0304] 10947   hsa-miR-142-3p  0.962   0.000794                 否

[0305] 28302   miRPlus_28302   0.387   0.000857                 否

[0306] 42573   hsa-miR-1       0.323   0.000871                 否

[0307] 42899   hsa-miR-377*    -0.233  0.000896                 否

[0308] 42845   hsa-miR-125b-2* -0.206  0.00091                  否

[0309] 17463   hsa-miR-151-3p  0.597   0.000956                 否

[0310] 30787   hsa-miR-125b    0.753   0.000967                 否

[0311] 17470   kshv-miR-K12-2  -0.399  0.001                    否

[0312] 42812   hsa-miR-508-5p  -0.272  0.00106                  否

[0313] 17493   hsa-miR-622     -0.358  0.0011                   否

[0314] 42853   hsa-miR-433     -0.358  0.00116                  否

[0315] 11175   hsa-miR-525-5p  -0.188  0.00116                  否

[0316] 表2. 在表1中列出的成熟微RNA的序列

[0317] hsa-let-7f UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU

[0318] hsa-miR-15a UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG

[0319] hsa-miR-16 UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG

[0320] hsa-miR-17 CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG

[0321] hsa-miR-19a UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA

[0322] hsa-miR-19b UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA

[0323] hsa-miR-20a UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG

[0324] hsa-miR-21 UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA

[0325] hsa-miR-22 AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU

[0326] hsa-miR-23a AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC

[0327] hsa-miR-24 UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG

[0328] hsa-miR-25 CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA

[0329] hsa-miR-26a UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU

[0330] hsa-miR-26b UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU

[0331] hsa-miR-27a UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC

[0332] hsa-miR-28-5p AAGGAGCUCACAGUCUAUUGAG

[0333] hsa-miR-30a UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG

[0334] hsa-miR-32 UAUUGCACAUUACUAAGUUGCA

[0335] hsa-miR-93 CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG

[0336] hsa-miR-98 UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU

[0337] hsa-miR-100 AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG

[0338] hsa-miR-101 UACAGUACUGUGAUAACUGAA

[0339] hsa-miR-29b UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU

[0340] hsa-miR-103 AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA

[0341] hsa-miR-105 UCAAAUGCUCAGACUCCUGUGGU

[0342] hsa-miR-106a AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG

[0343] hsa-miR-199a-5p CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC

[0344] hsa-miR-129-5p CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC

[0345] hsa-miR-10a UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG

[0346] hsa-miR-10b UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG

[0347] hsa-miR-181a AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU

[0348] hsa-miR-181b AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU

[0349] hsa-miR-199b-5p CCCAGUGUUUAGACUAUCUGUUC

[0350] hsa-miR-221 AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC

[0351] hsa-miR-222 AGCUACAUCUGGCUACUGGGU

[0352] hsa-miR-223 UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA

[0353] hsa-let-7g UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU

[0354] hsa-let-7i UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU

[0355] hsa-miR-1 UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU

[0356] hsa-miR-15b UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA

[0357] hsa-miR-23b AUCACAUUGCCAGGGAUUACC

[0358] hsa-miR-27b UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC

[0359] hsa-miR-125b UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA

[0360] hsa-miR-130a CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU

[0361] hsa-miR-140-5p CAGUGGUUUUACCCUAUGGUAG

[0362] hsa-miR-140-3p UACCACAGGGUAGAACCACGG

[0363] hsa-miR-141 UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG

[0364] hsa-miR-142-5p CAUAAAGUAGAAAGCACUACU

[0365] hsa-miR-142-3p UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA

[0366] hsa-miR-191 CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG

[0367] hsa-miR-125a-5p UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA

[0368] hsa-miR-126 UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG

[0369] hsa-miR-150 UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG

[0370] hsa-miR-154 UAGGUUAUCCGUGUUGCCUUCG

[0371] hsa-miR-184 UGGACGGAGAACUGAUAAGGGU

[0372] hsa-miR-185 UGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGA

[0373] hsa-miR-193a-3p AACUGGCCUACAAAGUCCCAGU

[0374] hsa-miR-195 UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC

[0375] hsa-miR-320a AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGA

[0376] hsa-miR-106b UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU

[0377] hsa-miR-29c UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA

[0378] hsa-miR-219-2-3p AGAAUUGUGGCUGGACAUCUGU

[0379] hsa-miR-301a CAGUGCAAUAGUAUUGUCAAAGC

[0380] hsa-miR-296-3p GAGGGUUGGGUGGAGGCUCUCC

[0381] hsa-miR-30e UGUAAACAUCCUUGACUGGAAG

[0382] hsa-miR-365 UAAUGCCCCUAAAAAUCCUUAU

[0383] hsa-miR-374a UUAUAAUACAACCUGAUAAGUG

[0384] hsa-miR-340 UUAUAAAGCAAUGAGACUGAUU

[0385] hsa-miR-342-3p UCUCACACAGAAAUCGCACCCGU

[0386] hsa-miR-323-3p CACAUUACACGGUCGACCUCU

[0387] hsa-miR-326 CCUCUGGGCCCUUCCUCCAG

[0388] hsa-miR-151-3p CUAGACUGAAGCUCCUUGAGG

[0389] hsa-miR-148b UCAGUGCAUCACAGAACUUUGU

[0390] hsa-miR-331-3p GCCCCUGGGCCUAUCCUAGAA

[0391] hsa-miR-339-5p UCCCUGUCCUCCAGGAGCUCACG

[0392] hsa-miR-335 UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU

[0393] ebv-miR-BHRF1-2 UAUCUUUUGCGGCAGAAAUUGA

[0394] ebv-miR-BHRF1-3 UAACGGGAAGUGUGUAAGCACA

[0395] ebv-miR-BART1-5p UCUUAGUGGAAGUGACGUGCUGUG

[0396] hsa-miR-422a ACUGGACUUAGGGUCAGAAGGC

[0397] hsa-miR-423-5p UGAGGGGCAGAGAGCGAGACUUU

[0398] hsa-miR-424 CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA

[0399] hsa-miR-425 AAUGACACGAUCACUCCCGUUGA

[0400] hsa-miR-20b CAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAG

[0401] hcmv-miR-UL148D UCGUCCUCCCCUUCUUCACCG

[0402] hsa-miR-433 AUCAUGAUGGGCUCCUCGGUGU

[0403] kshv-miR-K12-1 AUUACAGGAAACUGGGUGUAAGC

[0404] kshv-miR-K12-2 AACUGUAGUCCGGGUCGAUCUG

[0405] kshv-miR-K12-3 UCACAUUCUGAGGACGGCAGCGA

[0406] hsa-miR-490-5p CCAUGGAUCUCCAGGUGGGU

[0407] hsa-miR-146b-5p UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU

[0408] hsa-miR-498 UUUCAAGCCAGGGGGCGUUUUUC

[0409] hsa-miR-525-5p CUCCAGAGGGAUGCACUUUCU

[0410] hsa-miR-516b AUCUGGAGGUAAGAAGCACUUU

[0411] hsa-miR-502-5p AUCCUUGCUAUCUGGGUGCUA

[0412] hsa-miR-508-5p UACUCCAGAGGGCGUCACUCAUG

[0413] hsa-miR-510 UACUCAGGAGAGUGGCAAUCAC

[0414] hsa-miR-553 AAAACGGUGAGAUUUUGUUUU

[0415] hsa-miR-92b UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC

[0416] hsa-miR-584 UUAUGGUUUGCCUGGGACUGAG

[0417] hsa-miR-586 UAUGCAUUGUAUUUUUAGGUCC

[0418] hsa-miR-548b-3p CAAGAACCUCAGUUGCUUUUGU

[0419] hsa-miR-596 AAGCCUGCCCGGCUCCUCGGG

[0420] hsa-miR-610 UGAGCUAAAUGUGUGCUGGGA

[0421] hsa-miR-612 GCUGGGCAGGGCUUCUGAGCUCCUU

[0422] hsa-miR-617 AGACUUCCCAUUUGAAGGUGGC

[0423] hsa-miR-622 ACAGUCUGCUGAGGUUGGAGC

[0424] hsa-miR-623 AUCCCUUGCAGGGGCUGUUGGGU

[0425] hsa-miR-630 AGUAUUCUGUACCAGGGAAGGU

[0426] hsa-miR-631 AGACCUGGCCCAGACCUCAGC

[0427] hsa-miR-638 AGGGAUCGCGGGCGGGUGGCGGCCU

[0428] hsa-miR-640 AUGAUCCAGGAACCUGCCUCU

[0429] hsa-miR-642 GUCCCUCUCCAAAUGUGUCUUG

[0430] hsa-miR-645 UCUAGGCUGGUACUGCUGA

[0431] hsa-miR-654-5p UGGUGGGCCGCAGAACAUGUGC

[0432] hsa-miR-657 GGCAGGUUCUCACCCUCUCUAGG

[0433] hsa-miR-542-5p UCGGGGAUCAUCAUGUCACGAGA

[0434] hcmv-miR-UL70-3p GGGGAUGGGCUGGCGCGCGG

[0435] ebv-miR-BART6-3p CGGGGAUCGGACUAGCCUUAGA

[0436] ebv-miR-BART13 UGUAACUUGCCAGGGACGGCUGA

[0437] ebv-miR-BART16 UUAGAUAGAGUGGGUGUGUGCUCU

[0438] hsa-miR-300 UAUACAAGGGCAGACUCUCUCU

[0439] hsa-miR-374b AUAUAAUACAACCUGCUAAGUG

[0440] hsa-miR-935 CCAGUUACCGCUUCCGCUACCGC

[0441] hsa-miR-939 UGGGGAGCUGAGGCUCUGGGGGUG

[0442] hiv1-miR-H1 CCAGGGAGGCGUGCCUGGGC

[0443] hsa-miR-720 UCUCGCUGGGGCCUCCA

[0444] hsa-miR-21* CAACACCAGUCGAUGGGCUGU

[0445] hsa-miR-22* AGUUCUUCAGUGGCAAGCUUUA

[0446] hsa-miR-25* AGGCGGAGACUUGGGCAAUUG

[0447] hsa-miR-200b* CAUCUUACUGGGCAGCAUUGGA

[0448] hsa-miR-30b* CUGGGAGGUGGAUGUUUACUUC

[0449] hsa-miR-135a* UAUAGGGAUUGGAGCCGUGGCG

[0450] hsa-miR-125b-2* UCACAAGUCAGGCUCUUGGGAC

[0451] hsa-miR-126* CAUUAUUACUUUUGGUACGCG

[0452] hsa-miR-149* AGGGAGGGACGGGGGCUGUGC

[0453] hsa-miR-194* CCAGUGGGGCUGCUGUUAUCUG

[0454] hsa-miR-30c-1* CUGGGAGAGGGUUGUUUACUCC

[0455] hsa-miR-30e* CUUUCAGUCGGAUGUUUACAGC

[0456] hsa-miR-377* AGAGGUUGCCCUUGGUGAAUUC

[0457] hsa-miR-340* UCCGUCUCAGUUACUUUAUAGC

[0458] hsa-miR-424* CAAAACGUGAGGCGCUGCUAU

[0459] hcmv-miR-US25-1* UCCGAACGCUAGGUCGGUUCUC

[0460] hsa-miR-519e* UUCUCCAAAAGGGAGCACUUUC

[0461] hsa-miR-92b* AGGGACGGGACGCGGUGCAGUG

[0462] ebv-miR-BART8* GUCACAAUCUAUGGGGUCGUAGA

[0463] 其它实施方案

[0464] 尽管在附上的权利要求书中指出了显示和描述的本发明的某些新颖特征，但本发明无意被限于详细说明的细节，因为相关领域的普通技术人员会理解，可以对举例说明的发明的形式和细节及其操作做出不同的省略、修改、置换和改变，而不以任何方式背离本发明的精神。除非明确地描述为“关键的”或“必需的”，否则本发明的特征不是关键的或必需的。

[0465] 本领域技术人员将认识到或使用不多于常规实验就能够确定本文中描述的发明的具体实施方案的许多等同方案。这样的等同方案意图被包括在本发明的范围内。

[0466] 在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，达到与明确地且单独地指出每篇独立的出版物、专利或专利申请通过引用并入相同的程度。