鸡新城疫病毒YT毒株、其全基因组序列及其应用

摘要

本发明公开了一株分离的鸡新城疫病毒毒株、其全基因组序列及其应用，属于鸡新城疫病毒毒株的分离和应用领域。本发明首先公开了分离的鸡新城疫病毒毒株的全基因组序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了一株鸡新城疫病毒YT株，其微生物保藏编号为：CGMCC No.8789。免疫原性比较结果显示，本发明所分离的YT株有良好的免疫原性，能提供较La Sota疫苗更好的临床保护率且能有效降低排毒率。交叉血凝抑制实验显示，本发明YT株抗血清对YT抗原及La Sota抗原均有很好的交叉反应性。本发明鸡新城疫病毒YT株及其基因组序列能够用于制备预防鸡新城疫病毒疫苗和抗鸡新城疫病毒的中和抗体。

权利要求

1.编码鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus)YT株的全基因，其特征在于：所述全基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

2.一株分离的鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus)毒株，其特征在于：其微生物保藏编号为：CGMCC No.8789。

3.权利要求1所述的全基因在制备预防鸡新城疫疫苗中的用途。

4.权利要求2所述的鸡新城疫病毒毒株在制备预防鸡新城疫疫苗中的用途。

5.权利要求1所述的全基因在制备抗鸡新城疫病毒中和抗体试剂或药物中的用途。

6.权利要求2所述的鸡新城疫病毒毒株在制备抗鸡新城疫病毒中和抗体试剂或药物中的用途。

7.一种防治鸡新城疫的疫苗组合物，其特征在于，包括：预防或治疗上有效量的权利要求2所述的鸡新城疫病毒毒株的灭活株以及药学上可接受的佐剂。

说明书

鸡新城疫病毒YT毒株、其全基因组序列及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及鸡新城疫病毒株，尤其涉及一株鸡新城疫病毒毒株及其全基因组序列，本发明还涉及该鸡新城疫病毒毒株及其全基因组序列在制备预防鸡新城疫疫苗和制备抗鸡新城疫病毒中和抗体中的应用，属于鸡新城疫病毒毒株的分离和应用领域。

背景技术

[0002] 新城疫(newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病。以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征，具有很高的发病率和病死率，是危害养禽业的一种主要传染病。国际兽医局(OIE)将其列为A类疫病。

[0003] 新城疫病毒属于副粘病毒科、腮腺炎病毒属的I型禽副粘病毒，为单股不分节段的负链RNA病毒。整个基因组长度约为15kb，包含6个功能基因：3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，分别编码6个主要蛋白质(NP蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、HN蛋白和L蛋白)。NDV的血清型只有一种，但是其生物学特性在不同毒株间差异较大。为了能更好区分不同毒株间的差异，A.Ballagi-Pordány等应用限制性内切酶进行绘制融合糖蛋白(F蛋白)的基因分型和序列分析，把NDV划分为9个基因型(I～IX)(A.Ballagi-Pordány,E.Wehmann,J Herczeg,et al.Identification and grouping of Newcastle disease virus strains by restriction site analysis of a region from the F gene[J].Arch Virol,1996,141(2):243-261.)。

[0004] 目前，在中国流行的新城疫毒株主要是以基因VII型为主，同时也暴发基因VI、VIII和IX型。中国现行的疫苗株为I系、II系(B1)、III系(F)、IV系(La Sota)和V4株等，均属于经典型(基因I型、II型)。虽然Ⅱ型与Ⅶ型同属一个血清型，但在遗传距离上相差较远，抗原有一定的差异性。而疫苗株与当前流行株之间的基因型和抗原差异性，是导致新城疫免疫失败的重要原因(秦卓明，徐怀英，刘玉山，黄兵，李玉峰，黄迪海.疫苗免疫压力下新城疫病毒的动态演化[J].中国兽药杂志,2013,47(02):1-6.)。因此，研制一种针对新城疫病毒基因VII型的疫苗具有重要的现实意义。

发明内容

[0005] 本发明的目的之一是提供一株分离的鸡新城疫病毒YT毒株；

[0006] 本发明的目的之二是提供从该鸡新城疫病毒YT毒株中分离的全基因组序列；

[0007] 本发明的目的之三是将所述鸡新城疫病毒YT毒株及其全基因应用于制备防治鸡新城疫疫苗；

[0008] 本发明的目的之四是将所述鸡新城疫病毒YT毒株及其全基因应用于制备抗鸡新城疫病毒中和抗体。

[0009] 本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

[0010] 本发明于2011年11月从山东烟台某鸡场病死鸡的肠道、肺脏、脑等组织中分离得到一株鸡新城疫病毒YT毒株。本发明将分离的鸡新城疫病毒YT毒株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.8789；分类命名为：鸡新城疫病毒。保藏单位：中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2014年02月14日；保藏地址：
中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

[0011] 对鸡新城疫病毒YT毒株进行全基因组序列测定，其基因组全长为15192bp，其基因组核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

[0012] 本发明对蚀斑纯化后的病毒YT毒株进行了致病力和序列分析，鉴定所分离的YT毒株为普遍流行的新城疫基因VIId型强毒株。

[0013] 为了验证本发明分离的YT毒株的免疫保护效力，本发明分别将YT毒株制备成灭活疫苗，将所制备的灭活疫苗与商品化的La Sota疫苗一同进行免疫保护效力测定。本发明用同等病毒滴度的La Sota疫苗及YT疫苗免疫鸡群后，分别测定抗体增长情况。从实验结果可以看出，YT疫苗和La Sota疫苗免疫14天后的抗体都达到新城疫抗体能够保护的水平4log2以上。YT疫苗免疫后抗体增长比较快，而且较La Sota疫苗免疫后的抗体水平高。证明本发明所分离的YT株有良好的免疫原性。通过攻毒保护结果分析发现，YT疫苗和La Sota疫苗都能够提供90％以上的保护。La Sota免疫组分别用F48E8标准强毒、WFD株和基因VII型YT株攻毒后均死亡1只，共死亡3只，而YT免疫组无鸡只死亡。从病毒分离情况可看出，YT免疫组病毒分离率均在25％以下，远低于La Sota免疫组58％～75％的病毒分离率。说明接种YT疫苗能够提供更好的临床保护率并且能够降低排毒率。

[0014] La Sota疫苗及YT疫苗免疫后的抗血清分别与YT和La Sota抗原进行交叉血凝抑制反应。结果表明，用YT抗原测定免疫La Sota的血清HI效价比用La Sota抗原测定免疫La Sota株的血清HI效价低，平均低3log2，说明La Sota株的抗血清与YT抗原交叉反应性较低。YT株抗血清与两毒株的抗原血凝抑制反应效价也有差异，但HA效价测定值都比较高，说明与La Sota株抗血清相比，YT株抗血清对YT抗原及La Sota抗原的交叉反应性更好。

[0015] 本发明还提供了鸡新城疫病毒YT毒株在制备防治鸡新城疫疫苗中的应用。

[0016] 为此，本发明提供了一种防治鸡新城疫的疫苗组合物，包括：预防或治疗上有效量的本发明所分离的鸡新城疫病毒YT灭活株以及药学上可接受的佐剂白油。

[0017] 本发明进一步提供了一种制备所述预防鸡新城疫的疫苗组合物的方法，该方法包括：

[0018] 将鸡新城疫病毒YT毒株增殖获得病毒液；将病毒液灭活后与佐剂混合均匀，乳化，即得。

[0019] 优选的，按体积比计，将灭活后的病毒液与白油佐剂按照2：3的比例混合即制备成灭活疫苗。

[0020] 本发明所制备的疫苗能够有效预防基因VII型鸡新城疫病毒。

[0021] 本发明还提供了鸡新城疫病毒全基因在制备预防鸡新城疫病毒疫苗中的应用。

[0022] 本发明进一步从鸡新城疫病毒YT毒株全基因组序列中找到能诱生中和抗体的编码蛋白的基因片段，表达和纯化该编码蛋白，该编码蛋白可用于制备疫苗，预防鸡新城疫病毒。

[0023] 本发明还提供了鸡新城疫病毒全基因在制备抗鸡新城疫病毒中和抗体中的应用，包括：从鸡新城疫病毒YT毒株全基因组序列中找到能诱生中和抗体的编码蛋白的基因片段，表达和纯化该编码蛋白，免疫BALB/c小鼠。纯化后的编码蛋白能在小鼠体内诱导出中和抗体。通过单克隆抗体技术可以制备抗鸡新城疫病毒的中和抗体。

[0024] 本发明还提供了一种抗体，抗分离的鸡新城疫病毒YT毒株。该抗体具有较好的交叉反应，不仅对基因VII型毒株的攻击产生免疫保护作用，而且也对基因II型常用疫苗毒株有一定保护作用。

[0025] 本发明所涉及到的术语定义

[0026] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

[0027] 术语“新城疫”意指由新城疫病毒引起禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病。

[0028] 术语“基因组”意指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子(部分病毒是RNA)。

[0029] 术语“核苷酸序列”意指DNA或RNA中碱基的排列顺序。

[0030] 术语“疫苗”意指将病原微生物(如细菌、立克次氏体、病毒等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。

[0031] 术语“佐剂”意指非特异性免疫增强剂，当与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。

[0032] 术语“病毒滴度”意指病毒的毒力或毒价，衡量病毒滴度的单位有最小致死量(MLD)、最小感染量(MID)和半数致死量(LD50)。

[0033] 术语“免疫”意指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。

[0034] 术语“抗体”意指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。

[0035] 术语“中和抗体”意指当病原微生物侵入机体时会产生相应的抗体，能够与病原微生物表面的抗原结合，从而阻止该病原微生物黏附靶细胞受体，防止侵入细胞。

[0036] 术语“抗原”意指能够刺激机体产生(特异性)免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应(特异性反应)的物质。

[0037] 术语“免疫原性”意指能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力，即指抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质抗体和致敏淋巴细胞的特性，也指抗原刺激机体后，机体免疫系统能形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫反应。

[0038] 术语“抗血清”意指一种含有多克隆抗体的血清。

[0039] 术语“SPF鸡”意指生长在屏障系统或隔离器中、无国际、国内(尤其是国内)流行的主要鸡传染病病原的鸡群。

[0040] 术语“血凝现象”意指有血凝素(HA)的病毒能凝集人或动物红细胞。

[0041] 术语“血凝抑制实验”意指相应抗体与病毒结合后，阻止病毒表面血凝素(HA)与红细胞结合，血凝现象能被相应抗体抑制。

附图说明

[0042] 图1为分离的鸡新城疫病毒YT毒株接种CEF细胞后显微镜下的空斑图。

[0043] 图2为用RT-PCR方法对分离的鸡新城疫病毒YT毒株进行鉴定的电泳图，其中M：DL2000DNA marker；泳道1～5分别代表用不同的扩增引物对样品的扩增结果，其中泳道1表示用H5亚型禽流感(简称H5)特异性引物扩增结果；泳道2表示用H9亚型禽流感(简称H9)特异性引物扩增结果；泳道3表示ND(样品)扩增结果；泳道4表示用传染性支气管炎病毒(简称IB)特异性引物扩增结果；泳道5表示用传染性法氏囊病病毒(简称IBD)特异性引物扩增结果)。

[0044] 图3为鸡新城疫病毒YT毒株F基因的扩增，其中M：Marker2000；1和2为扩增的F基因片段。

[0045] 图4为鸡新城疫病毒YT毒株的F基因的系统进化分析。

[0046] 图5为鸡新城疫病毒YT毒株的F基因同源性比较分析。

[0047] 图6为La Sota疫苗及YT疫苗免疫后抗体增长情况。

[0048] 图7为用La Sota和YT疫苗免疫后的抗血清分别与YT和La Sota抗原进行交叉血凝抑制反应的结果。

具体实施方式

[0049] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

[0050] 1、实验材料及动物

[0051] 新城疫WFD株由华都诗华生物制品有限公司研发部分离鉴定；NDV La Sota株和F48E8株均购自中国兽医药品监察所(NDV La Sota株的商品编号为AV1615；F48E8株的商品编号为AV1611)；SPF鸡胚购自梅里亚维通实验动物中心；6周龄SPF鸡，购自梅里亚维通实验动物中心；鸡胚成纤维细胞；雏鸡(1日龄)；非免疫鸡胚；RNA提取试剂盒购自Omega公司；GoTaqMix购自Promega公司。

[0052] 实施例1 鸡新城疫病毒YT株的分离及纯化

[0053] 1、实验方法

[0054] 1.1病料采集及处理

[0055] 2011年11月山东烟台某鸡场爆发以神经症状为主要特征的传染性疾病，解剖发现病死鸡除嗉囊有大量粘液以外，无典型病变。采集病死鸡的肠道、肺脏、脑、气管、肝脏、肾脏、脾脏，-20℃保存。

[0056] 在生物安全柜中将每种病料取大约2g加入到灭菌研磨器中；研磨器中加入4ml灭菌PBS液，手动研磨约5分钟；将研磨好的病料悬浊液倒入离心管中，4℃5000rpm离心10min；在生物安全柜中将离心后的病料上清液吸入2个有外螺旋盖的冻存管中；一管上清液冻存于-20℃作为备份，另一管存于4～8℃以备接种。

[0057] 1.2病毒YT株的分离

[0058] 在生物安全柜中将病料上清液用0.2μm滤膜无菌过滤；经尿囊腔接种9～11日龄的SPF鸡胚，每胚0.2mL；37℃孵化，每日照蛋2次，将24h内死亡的鸡胚弃掉；24h后，每3～5h照蛋1次，死亡的鸡胚随时取出，直至120h；不论死亡或存活，取出所有鸡胚，气室向上直立，置2～8℃冰箱冷却8～16h，收获尿囊液。

[0059] 1.3分离病毒YT株的空斑纯化

[0060] 将鸡胚成纤维细胞(CEF)在6孔板中培养成单层，吸弃营养液，用Hanks’液洗-5 -6 -72次。用不含血清的维持液将收获的尿囊液作10倍连续稀释，分别取10 ，10 ，10 3个稀释度接种鸡胚成纤维细胞，接种后置37℃感作1小时，吸出病毒液，每孔加3mL的琼脂糖-MEM(50mL离心管中加入20mL2×MEM、20mL1.6％的琼脂糖、6mL7.5％NaHCO3混匀并立即放入45℃水浴锅中待用)覆盖，将板置于室温放置，待琼脂糖凝固后，将板倒置于37℃，5％CO2的温箱中培养，每日观察细胞形态，直到出现空斑。连续纯化3次，即得到纯化的鸡新城疫病毒YT毒株。

[0061] 2、实验结果

[0062] 采集病死鸡的肠道、肺脏、脑等组织，将每种病料研磨离心，将病料上清液经尿囊腔接种SPF鸡胚，收集尿囊液，即获得分离的病毒YT株。将分离的病毒YT株接种到状态良好的CEF细胞上，经孵育得到了大小均一的空斑，在显微镜下观察到形成的空斑周围的细胞由于病毒的侵染而死亡(图1)。如此经CEF细胞纯化3次后，得到了纯净的鸡新城疫病毒YT毒株。

[0063] 实验例1 鸡新城疫病毒YT株的基因型分析

[0064] 1、实验方法

[0065] 1.1病毒YT株的PCR鉴定

[0066] 病毒基因组RNA提取按照Omega Total RNA KIT II提取试剂盒的使用说明进行操作。以所提取的RNA样品为模板，采用RT-PCR方法合成单链cDNA。以此cDNA为模板，利用下述引物(该引物为新城疫病毒的特异性鉴别引物，用此引物可以鉴别是否是新城疫病毒)，在Taq酶的作用下进行PCR扩增鉴定。

[0067] 引物序列为：

[0068] 上游引物：5’-ACGGGTAGAAGGTGTGAA-3’；

[0069] 下游引物：5’-CCTTGCTGCATRTACTT-3’。

[0070] PCR反应体系：

[0071] dNTP(2.5pmol/μL) 4.0μL

[0072] 10×PCR buffer 5.0μL

[0073] Taq DNA聚合酶 0.5μL

[0074] 上游引物 2.0μL

[0075] 下游引物 2.0μL

[0076] 模版cDNA 2.0μL

[0077] ddH2O up to50μL

[0078] PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，循环32次；然后72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测。

[0079] 1.2病毒YT株的基因型分析

[0080] 病毒基因组RNA提取按照Omega Total RNA KIT II提取试剂盒的使用说明进行操作。RNA的反转录按照如下体系进行：5×Buffer4μL；2.5mMdNTPs6μL；RP2μL；AMV1μL。将混合液在漩涡仪上混匀，经掌上离心机短暂离心，甩下管盖及管壁上的液体。常温放置
5min后；然后42℃水浴1h即反转成cDNA。

[0081] 根据国内外已发表的F基因核甘酸序列，设计一对引物，

[0082] Pl：5’-TTAGAAAAAACACGGGTAGAAGA；

[0083] P2：5’-ACAAARTGRTGCATCTTCCC。

[0084] 按如下的顺序加样进行PCR反应：Promega go Taq(Mix)12.5μL；ddH2O9.5μL；P11μL；P21μL；TemPlate1μL。混匀后，稍微离心迅速置于冰上，进行下列循环反应：94℃反应3min使模板变性。循环为30个，在每一循环中，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，循环结束后，终延伸为94℃，10min。将扩增后的产物送华大基因进行测序，测序后序列用DNA Star Lasergene5.1进行比对。

[0085] 1.3病毒YT株的全基因组测序

[0086] 提取病毒基因组RNA，反转录成cDNA，对鸡新城疫病毒YT株进行全基因序列测定。

[0087] 2、实验结果

[0088] 2.1病毒YT株的PCR鉴定

[0089] 提取病毒YT株的RNA，采用RT-PCR法，利用特异引物进行PCR扩增，扩增出了预期目的片段，凝胶电泳图见图2。

[0090] 2.2病毒YT株的基因型分析

[0091] 病毒基因组RNA经RT-PCR成功扩增出约500bp的F基因片段(图3)。将片段进行纯化测序，经序列分析，该毒株具有NDV强毒株特征性序列(112-R-R-Q-K-R-F-117)，且具有NDV基因VII型的特征性氨基酸，即101位的K和121位的V。经系统进化分析发现该毒株为基因VIId型毒株(图4)，为现阶段中国最普遍流行的毒株，可以作为普遍流行的基因VII型毒株的代表来进行相关疫苗研究。

[0092] 2.3病毒YT株的全基因组测序

[0093] 对鸡新城疫病毒YT株的全基因序列测定已经完成，基因组全长为15192bp，其基因组核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

[0094] 实验例2 鸡新城疫病毒YT株的致病力测定实验

[0095] 1、实验方法

[0096] 1.1病毒YT株的MDT测定

[0097] 将40枚鸡胚分为两组，每组20枚，分别标记为“A”组和“B”组。将病毒YT株稀-7 -8 -9释为10 ，10 ，10 的稀释度接种鸡胚，首先接种“A”组，8h后接种“B”组，尿囊腔接种9～
11日龄鸡胚，0.1mL/枚，每个稀释度接种5枚。24h内死亡的鸡胚弃去，统计能够将鸡胚全部致死的最大稀释度的死亡时间，计算病毒的最小致死量的平均死亡时间。公式为MDT＝(x小时×x小时死胚数+y小时×y小时的死胚数+z小时×z小时的死胚数+....../死亡鸡胚总数。

[0098] 按照鸡新城疫病毒YT株的MDT方法测定了F48E8、La Sota株的MDT数据。

[0099] 1.2脑内接种致病指数ICPI的测定

[0100] 雏鸡(1日龄)10只，脑内接种10倍稀释后的病毒液0.05mL，另外10只雏鸡注射同等剂量的生理盐水作对照。接种24h后，观察雏鸡死亡情况，24h内死亡视为非特异性死亡。每24h观察一次，连续观察8天。每次观察应给鸡打分。打分标准如下：正常鸡计为0分，发病一只鸡记录为1分，死亡一只鸡记录2分。每天记录一次(如第一天死亡，则连续6天，每天记录各2分)。ICPI值＝每只鸡在8天内的所有分数的总和/(10只鸡×8天)。

[0101] 1.3静脉接种致病指数IVPI的测定

[0102] 用0.1mL/羽翅静脉接种6周龄SPF鸡10只。另外10只鸡注射同等剂量的生理盐水作对照。每日观察鸡的发病及死亡情况，连续观察10d。根据每只鸡的症状用数字方法每天进行记录：正常鸡计为0，病鸡(鸡只蜷缩在一起不愿运动，不愿采食或饮水，但无明显的翅、腿麻痹表现)计为1，重病鸡(翅、腿明显不协调，翅膀下垂)计为2，死亡鸡计为3。

[0103] 2、实验结果

[0104] 2.1病毒YT株的MDT测定

[0105] 病毒YT株的最小致死量的平均死亡时间(MDT)为45.8h，F48E8的MDT为43.2h，La Sota株的MDT为101.2h。

[0106] 2.2脑内接种致病指数ICPI的测定

[0107] 所有经脑内接种NDV毒株的1日龄雏鸡大多在1～2天内死亡，而生理盐水对照组在观察8天内全部正常。接毒组的部分雏鸡在接毒后开始出现症状，发病急，精神极度委靡，呆立，进而呼吸困难、伸颈，进而死亡。病毒YT株的ICPI值为1.96，证明YT毒株为新城疫强毒株。

[0108] 2.3静脉接种致病指数IVPI的测定

[0109] 静脉接毒后发病鸡开始表现为呆立，精神不振。进而有闭目嗜睡，头颈震颤，伸颈呼吸，翅下垂，瘫痪等症状，并有鸡只死亡。死亡鸡喙发绀，眼部有分泌物、眼睑粘连，嗉囊胀气。经计算静脉接种致病指数为2.59，证明本发明所分离的新城疫YT毒株为嗜神经型强毒。

[0110] 实验例3 NDV基因VII型YT株和WFD株致病力试验及其效价测定实验[0111] 一、实验目的

[0112] 本发明在分离新城疫(NDV)基因VII型YT株的过程中，同时分离了一株鸡新城疫基因VII型毒株WFD株，本实验将YT株和WFD株致病力的致病力和效价进行了测定。

[0113] 二、实验材料及方法

[0114] 1材料

[0115] 1.1攻毒种毒

[0116] 1.1.1批号、数量和分装：新城疫实验室试制产品。

[0117] 表1

[0118]毒株 毒株代次水平 总体积 分装规格 总瓶数 保存条件 制备日期
YT E10 - 1mL/管 - -80℃ 2012.10.19
WFD E5 - 1mL/管 - -80℃ 2012.12.15

[0119] 1.1.2制备过程描述

[0120] 将毒株稀释10000倍，接种10日龄SPF鸡胚，24h内死亡的鸡胚弃去，24h后死亡的鸡胚测定其HA效价，并将效价比较高的尿囊液收集并混合于无菌容器中，分装于无菌的EP管中，冻存于-80℃，备用。

[0121] 1.2试验动物

[0122] 品种：鸡，品系：SPF。来源：从北京梅里亚维通实验动物中心购买SPF鸡。年龄：1日龄30只，6周龄20只。挑选标准：发育良好的鸡。编号方式：随机分组。

[0123] 三、试验方法和考察指标

[0124] 1静脉接种致病指数(IVPI)的试验方法

[0125] 1.1将20只6周龄的鸡分为两组(10只/组)，饲养于隔离器中；

[0126] 1.2吸取9mL的生理盐水于扣塞试管中；

[0127] 1.3加入1mL病毒液于生理盐水中，震荡混匀；

[0128] 1.4将翅静脉接种部位用碘酒消毒；

[0129] 1.5用0.1mL/羽翅静脉接种6周龄SPF鸡10只，0.1mL每只；

[0130] 1.6每日观察鸡的发病及死亡情况，连续观察10d；

[0131] 1.7根据每只鸡的症状用数字方法每天进行记录：正常鸡计为0，病鸡计为1，重病鸡计为2，死鸡计为3(病鸡和重病鸡的判断主要根据临床表现。一般而言，病[0132] 鸡表现有下述一种症状，而重病鸡则表现下述多个症状，如呼吸症状、沉郁、腹泻、鸡冠/肉冉水肿发绀、脸或头部肿胀、神经症状。死亡鸡及其在其死后每次都计为3。

[0133] 2 考察指标

[0134] 根据IVPI的判定标准对鸡只的发病和死亡情况进行打分，记录和计算IVPI的值[0135] 3 试验设计

[0136] 表2 动物分组及试验安排框架

[0137]鸡只 日龄 数量 攻毒毒株 试验项目
SPF鸡 6周龄 10只 WFD株 静脉接种，接种后观察鸡只的发病和死亡情况并打分SPF鸡 6周龄 10只 YT株 静脉接种，接种后观察鸡只的发病和死亡情况并打分[0138] 四试验结果与分析

[0139] 表3 YT株静脉接种致病指数(IVPI)结果

[0140]

[0141] 通过“IVPI值＝每只鸡在所有10d内的所有数字之和/10只鸡×10d”的公式进行计算，YT株的静脉接种致病指数(IVPI)为2.59。

[0142] 表4 WFD株静脉接种致病指数(IVPI)结果

[0143]

[0144]

[0145] 通过“IVPI值＝每只鸡在所有10d内的所有数字之和/10只鸡×10d”的公式进行计算，WFD株的静脉接种致病指数(IVPI)为2.42。

[0146] 从实验结果来看，YT株的静脉接种致病指数(IVPI)为2.59，证明YT株是NDV强毒株；WFD株的静脉接种致病指数为2.42，证明其也是NDV强毒株；YT株的静脉接种指数高于WFD株的静脉接种指数。

[0147] 此外，本实验进一步测定了YT株和WFD株的HA效价，测定结果为YT株的HA效价为(log2)9.78，WFD株的HA效价为(log2)7；YT株的效价要远远高于WFD株的效价。

[0148] 实验例4 NDV基因VII型YT株和La Sota株的免疫原性比较及交叉血凝抑制[0149] 实验

[0150] 预防新城疫的最常用疫苗为La Sota株，而流行病学调查结果显示基因VII为田间主要流行的基因型，与La Sota之间存在较大差异，被认为是LaSota疫苗往往造成免疫失败的主要原因。

[0151] 虽然分子流行病学研究表明YT株和La Sota株遗传距离较远，但并没有文献报道二者在免疫原性的差异有多大，这关系到是否有必要开发出基因VII疫苗代替传统的La Sota疫苗来解决目前新城疫保护率差的状况。鉴于此，本实验选择La Sota株与YT株作比较，从F基因同源性、生物学特性(毒力等)、

[0152] 免疫原性等方面比较二者的差异。

[0153] 1、实验方法

[0154] 1.1疫苗制备

[0155] 用纯化后的YT株和La Sota株病毒分别接种一批非免疫鸡胚后，测定收获的尿囊液的病毒含量(EID50)。用灭菌生理盐水调整两株病毒YT株和La Sota株的病毒含量为8.5
10 EID50。用0.1％的甲醛灭活16h后，将灭活后的病毒液分别与白油佐剂按体积比2：3混合，制备成YT灭活疫苗和La Sota灭活疫苗。

[0156] 1.2NDV基因VII型YT株和La Sota株的免疫原性比较

[0157] 称重后，将鸡只分为A、B、C三组，A、B组每组41只，C组20只。A组颈部皮下注射YT疫苗20μL，B组颈部皮下注射La Sota疫苗20μL，C组注射PBS20μL。免疫后7天、14天、21天采血测定抗体HI效价。

[0158] 免疫21天后，将A组鸡只再分为4组，A1、A2和A3组每组12只，A4组5只；将B组鸡只再分为4组，B1、B2和B3组每组12只，B4组5只；将C组鸡只再分为4组，C1、C2、C3和C4组，每组5只。A1-A3组、B1-B3组、C1-C3组分别肌肉注射标准强毒F48E8、基因5
VII型强毒WFD株和基因VII型YT毒株，攻毒量均为10EID50；A4组、B4组和C4组注射生理盐水作为对照。观察鸡群的发病及死亡情况，攻毒后5天分别采肛门和呼吸道拭子，进行病毒分离。

[0159] 1.3交叉血凝抑制实验

[0160] 将La Sota抗原和YT抗原稀释成4单位抗原，分别和用La Sota疫苗和用YT疫苗免疫后21天的抗血清进行血凝抑制实验，按照《中国兽药典》的规定进行。

[0161] 其中，La Sota抗原和YT抗原可参考以下方法进行制备：

[0162] 工作前的准备：准备一定量的ND抗原,HA价≥8㏒2为合格；高压甘油、高压离心瓶、反口塞；干烤500ml瓶和烧杯；

[0163] 制备方法

[0164] (1)将准备好的ND抗原分装到无菌的离心瓶中，2000转离心15min。

[0165] (2)取离心的抗原放到无菌容器中，加入1‰的甲醛(甲醛先配成10％溶液，再按照1:100体积加入)，放到磁力搅拌器上37℃灭活18h～20h。

[0166] (3)灭活检验：将灭活的尿囊液按1:10000倍稀释后，经尿囊腔接种11日龄SPF鸡胚,每胚0.1mL,接种后置37℃继续孵化5天,观察鸡胚发育情况并检测鸡胚尿囊液有无血凝活性。并将收获的鸡胚尿囊液在SPF鸡胚上盲传3代，检测鸡胚尿囊液均无血凝活性。说明制备的抗原灭活完全。

[0167] (4)将灭活后的抗原进行离心2000转离心15min。取上清，弃掉沉淀。

[0168] (5)称取1/10抗原体积的PEG6000和1/50抗原体积的NaCL加入到离心后的抗原里，在4℃磁力搅拌器溶解搅拌2～3h，2000转离心15min，取上清。

[0169] (6)将上清进行高速离心，20000转离心2h，弃掉上清，留下沉淀，加入PBS溶液吹开沉淀，加入PBS的体积为原抗原体积的1/10。

[0170] (7)将混匀的抗原沉淀倒入灭菌的烧杯中，冰浴。对抗原进行超声。超声条件：20KHZ20～30W90S(裂解6s，停12s)

[0171] (8)加入20％高压的甘油在4℃保存。每月测一次血凝活性。

[0172] 2、实验结果

[0173] 2.1NDV基因VII型YT株和La Sota株的免疫原性比较

[0174] 用纯化后的YT株和La Sota株病毒制备成YT疫苗和La Sota疫苗。用同等病毒滴度的La Sota疫苗及YT疫苗免疫鸡群后，分别测定7天、14天和21天的抗体增长情况(图6)。从图6中可以看出，YT疫苗和La Sota疫苗免疫14天后的抗体都达到新城疫抗体能够保护的水平4log2以上。YT疫苗免疫后抗体增长比较快，而且较La Sota疫苗免疫后的抗体水平高。YT疫苗免疫14天和21天后的抗体水平分别达到6log2和6.74log2，而La Sota疫苗免疫14天和21天后的抗体水平分别为4.67log2和5.88log2。证明NDV基因VII型YT株具有良好的免疫原性。

[0175] 通过攻毒保护结果分析发现，YT疫苗和La Sota疫苗都能够提供90％以上的保护。攻毒后的病毒分离和鸡只死亡情况见表5。从表5可以看出，La Sota免疫组，分别用F48E8标准强毒、WFD株和基因VII型YT株攻毒后均死亡1只，共死亡3只，而YT免疫组无鸡只死亡，对照组鸡只全部死亡。从病毒分离情况可看出，YT免疫组病毒分离率均在25％以下，远低于La Sota免疫组58％～75％的病毒分离率。说明接种YT疫苗能够提供更好的临床保护率并且能够降低排毒率。

[0176] 表5 免疫攻毒后的病毒分离和鸡只死亡情况汇总表

[0177]

[0178] 2.2交叉血凝抑制实验

[0179] 用La Sota疫苗和YT疫苗免疫后的抗血清分别与YT和La Sota抗原进行交叉血凝抑制反应。试验结果表明(图7)，用YT抗原测定免疫La Sota的血清HI效价比用La Sota抗原测定免疫La Sota的血清HI效价低，平均低3log2，说明La Sota株的抗血清与YT抗原交叉反应性较低。YT株抗血清与两毒株的抗原血凝抑制反应效价也有差异，但HA效价测定值都比较高，说明与La Sota株抗血清相比，YT株抗血清对YT抗原及La Sota抗原的交叉反应性更好。

[0180] 研究表明，交叉血凝抑制的结果能够和交叉中和试验的结果相吻合，从而证明了本发明分离的YT株的抗体能够具有更好的交叉反应，不仅对基因VII型毒株的攻击产生免疫保护作用，而且也对基因II型常用疫苗毒株有一定保护作用。