对大田罗布麻锈病进行预测的方法及其专用装置

摘要

本发明公开了一种对由罗布麻栅锈菌所引起的罗布麻锈病进行预测的方法以及该方法所专用的装置，主要通过载体制作、取样装置准备、孢子的取样捕捉、离体培养、致病力测算步骤实现的。可较为准确地预测预报出大田种植罗布麻的栅锈病发生情况，进而有效地制订出防治预案。与现有技术相比，本发明解决了在测定病原菌数量的同时，能有效地测定具有侵染能力的病原菌数量，特别是解决了在空气微生物取样器完成取样的罗布麻离体叶片培养时易受污染腐烂的问题，适合于大田商业化种植罗布麻的栅锈病预测预报。

权利要求

1.一种对大田罗布麻锈病菌致病力进行检测的方法，其特征在于主要是通过以下步骤实现的：载体制作，取样装置准备，孢子的取样捕捉，离体培养，致病力测算，具体操作过程如下：载体制作:在无菌环境中培育罗布麻植株并取其叶片作为捕捉载体；

a、培养基制作：选择蛭石充分灭菌后作为培养基；

b、催芽：将罗布麻种子，用浓度为0.1～0.5%次氯酸钠溶液消毒3～5 min，用纱布过滤后再用无菌水冲洗3～5次，然后将种子在38～42℃的水浴锅中催芽12～15h，待种子芽苞出现露白，倒去水备用；

c、定植：将催芽后的种子于10 h内在所述培养基中定植；

d、育苗：当植株生长到3轮以上叶片即可；

取样装置准备：在专用的取样装置中安放取样载体；

a、取样装置的准备：用上部开口并设有盖， 直径或边长为9～15cm，高2～5cm的盒体，在盒体内设置一块载玻片和一块保湿体，将载玻片通过不干胶或粘性硅胶一类的物体粘连于盒体的底部，同时，与载玻片并列将保湿体安放在盒体的底部；

b、制作孢子捕捉玻片：在载玻片上下缘10～15mm之间的区域内均匀涂抹一层凡士林作为孢子捕捉玻片；

c、制作孢子捕捉叶片：取所培育的罗布麻植株顶部向下第3～5轮处的健康叶片作为孢子捕捉叶片，将选取的罗布麻叶片叶背向上安置于保湿体上，罗布麻叶片的叶梗处压盖小块脱脂棉，用胶带沿叶尖上缘0.5～1cm处将保湿体和叶片粘紧，同样用胶带将叶片下端压盖的脱脂棉粘紧，将取样装置直立，向保湿体上缘注无菌水，至下缘出现滴水为止，盖上盖保存即可；

取样：将安放了取样载体的取样装置置于大田中进行取样；

a、设置取样点：选择取样点后，在锈病发生前开始取样；

b、安放取样装置：使用定容式空气微生物取样器，固定在距地面高度为30～50cm支架上；

c、安装取样装置：将安放了制作孢子捕捉玻片和制作孢子捕捉叶片的取样装置安放在仪器内，取样时间为每天8～10点开始取样，下午1～3点和傍晚7～9点各换取一次取样装置，雨天不取样；

d、统计载玻片取样孢子数：将取样完毕的取样装置盖上盖子，带回室内，将载玻片取下，置于存贮盒中保存30天后，在显微镜下统计载玻片上的夏孢子数；

离体培养：将取样后的孢子捕捉叶片进行离体培养；

a、培养装置：用上部开口并设有盖，直径或边长为9～15cm，高2～5cm的盒体作为培养皿，在盒体底部设置呈栅栏状排列的条状体作为衬底；

b、离体培养：将取样后的罗布麻叶片放置于培养装置的衬底上，叶片方向与条状体方向纵向相交，叶梗部用脱脂棉包裹并用条形滤纸覆盖，条形滤纸至少有一处端部与培养装置底部接触，然后向培养装置中加无菌水至与衬底平齐，再向滤纸滴加用无菌水配置的浓度为80～100ppm 的苯骈咪唑溶液，至有水滴出现为止，再向叶面均匀喷洒无菌水2～3次，盖上培养装置上盖后置于培养箱中20～23℃下培养8～10天，并按10～12 h光暗交替，光照强度8000～12000LUX；

之后进行致病力测算。

2.根据权利要求1所述的对大田罗布麻锈病菌致病力进行检测的方法，其特征在于：所述的取样每次设置10～12个循环，每个循环取样80～120L空气，循环间隔15～20min。

3.根据权利要求2所述的对大田罗布麻锈病菌致病力进行检测的方法，其特征在于：按照病害发生状况，所述的取样为：病害发生初期每个循环取样100～120L空气，病害发生中期每个循环为90～100L空气，病害发生盛期每个循环为80～90L空气，病害发生末期为90～100L空气。

说明书

对大田罗布麻锈病进行预测的方法及其专用装置

技术领域

[0001] 本发明属于植物病预防范畴，主要涉及对罗布麻重要病害锈病进行检测预报的技术，特别是一种对由罗布麻栅锈菌所引起的罗布麻锈病进行预测的方法以及该方法所专用的装置。

背景技术

[0002] 随着罗布麻种植面积和产量日益扩大，栅锈病已经成为罗布麻种植中的主要病害，对罗布麻生长和质量造成重要的影响，特别是给生产带来极大的经济损失，严重阻碍了罗布麻产业的发展。

[0003] 罗布麻栅锈菌夏孢子是栅锈病发生发展的侵染源，因此，准确地测定大田空气夏孢子数量，特别是致病力，能够为准确及时地为预测预报罗布麻锈病提供依据，降低锈病对罗布麻生产造成的损失。

[0004] 目前主要通过空气微生物采样器进行采样，然后测定显微镜下可分辨或在培养基中可培养的目标病原菌数量，再根据该数值对植物病害及其发展进行预测预报。

[0005] 由于罗布麻栅锈菌等病原菌在自然环境中随时间的推移，活性会显著降低甚至完全丧失。因此，只测定病原菌数量并不能反映其实际的致病能力，因而常常造成误报。

[0006] 而且，目前的采样方法是直接将离体叶片放在水中或保湿物上，再通过空气微生物采样器进行采样。由于接种栅锈菌的离体叶片需要一定的湿度环境才能侵染、显症，而大田采样的罗布麻叶片容易被其它杂菌污染造成叶片快速腐烂，因此影响侵染及产孢效果，最终使整个检测与实际相谬甚远，也成为造成误报的重要原因。

[0007] 因此需要准确有效地进行采样，有效地测定出具有侵染能力的病原菌数量，才能准确有效地预测预报罗布麻锈病的发生和发展，特别是罗布麻栅锈菌夏孢子致病力的强弱，准确地做出预测预报和防治预案，进而避免或降低锈病对罗布麻生产造成损失。

[0008] 因此，一种能够准确有效地进行采样，特别是能有效地测定出具有侵染能力的病原菌数量，进而准确有效地预测预报罗布麻锈病，如对由罗布麻栅锈菌所引起的罗布麻锈病进行预测的方法就应运而生。

发明内容

[0009] 本发明的目的在于提供一种能够准确有效地进行采样，能有效地测定出具有侵染能力的病原菌数量的方法及其专用装置，进而准确有效地预测预报罗布麻锈病，特别是对由罗布麻栅锈菌所引起的罗布麻锈病进行预测，制订出有效的防治预案，保证罗布麻种植的高产、可持续性和罗布麻种植产业的健康发展。

[0010] 本发明的目的主要通过以下步骤实现的：载体制作，取样装置准备，孢子的取样捕捉，离体培养，致病力测算。具体操作过程如下：

[0011] 载体制作:在无菌环境中培育罗布麻植株并取其叶片作为捕捉载体。

[0012] a、培养基制作：选择市售的蛭石充分灭菌后作为培养基。

[0013] b、催芽：将罗布麻种子，用浓度为0.1～0.5%次氯酸钠溶液消毒3～5 min，用纱布过滤后再用无菌水冲洗3～5次，然后将种子在38～42℃的水浴锅中催芽12 ～15h，待种子芽苞出现露白，倒去水备用。

[0014] 所述的无菌水最好为浓度为80～100ppm 的苯骈咪唑溶液。

[0015] c、定植：将催芽后的种子于10 h内在所述培养基中定植，一般在5～10 h内定植。

[0016] d、育苗：当植株生长到3轮以上叶片即可。

[0017] 取样装置准备：在专用的取样装置中安放取样载体，取样载体为载玻片和罗布麻叶片。

[0018] a、取样装置的准备：用上部开口并设有盖的盒体，在盒体内设置一块载玻片和一块保湿体，所述载玻片为一矩形的片状体并通过不干胶或粘性硅胶一类的物体粘连于盒体的底部，同时，所述保湿体与载玻片并列安放在盒体的底部。

[0019] 所述的盒体可以为为圆形或矩形中的一种，盒体直径或边长在9～15cm，高2～5cm为好。

[0020] b、制作孢子捕捉玻片：在载玻片的距上下缘10～15mm之间的区域内均匀涂抹一层凡士林作为孢子捕捉玻片。

[0021] c、制作孢子捕捉叶片：取所培育的罗布麻植株顶部向下第3～5轮处的健康叶片作为孢子捕捉叶片，将选取的罗布麻叶片叶背向上安置于保湿体上，罗布麻叶片的叶梗处压盖小块脱脂棉，用胶带沿叶尖上缘0.5～1cm处将保湿体和叶片粘紧，同样用胶带将叶片下端压盖的脱脂棉粘紧，将取样装置直立，向保湿体上缘注无菌水，至下缘出现滴水为止，盖上盖保存即可。

[0022] 取样：将安放了取样载体的取样装置置于大田中进行取样。

[0023] a、设置取样点：选择取样点后，在锈病发生前开始取样。

[0024] b、安放取样装置：使用定容式空气微生物取样器，固定在距地面高度为30～50cm支架上。

[0025] c、安装取样装置：将安放了制作孢子捕捉玻片和制作孢子捕捉叶片的取样装置安放在定容式空气微生物取样器内，取样时间为每天8～10点开始取样，下午1～3点和傍晚7～9点各换取一次取样装置，雨天不取样。

[0026] 上述的取样最好每次设置10～12个循环，即每个取样器进行一次取样按以下过程进行取样：每取样80～120L空气为一个循环，在间隔15～20min后再开始下一个循环。

[0027] 上述的取样最好按照病害发生状况，在病害发生初期每个循环取样100～120L空气，病害发生中期每个循环为90～100L空气，病害发生盛期每个循环为80～90L空气，病害发生末期为90～100L空气。

[0028] d、统计载玻片取样孢子数：将取样完毕的取样装置盖上盖子，带回室内，将载玻片取下，置于存贮盒中保存30天后，在显微镜下统计夏孢子数。

[0029] 离体培养：将取样后的孢子捕捉叶片进行离体培养。

[0030] a、培养装置：用上部开口并设有盖的盒体作为培养皿，在盒体底部设置呈栅栏状排列的条状体作为衬底。

[0031] 所述条状体最好距盒体底部0.8～1cm处呈架空状。可采用与条状体纵向的支撑条架空，也可采取将条状体两端固定于盒体侧边的方式架空。

[0032] 所述的盒体可以为圆形或矩形中的一种，盒体直径或边长在9～15cm，高2～5cm为好。

[0033] b、离体培养：将取样后的罗布麻叶片的放置培养装置的衬底上，叶片方向与条状体方向纵向相交，最好呈垂直，叶梗部用脱脂棉包裹并用条形滤纸覆盖，条形滤纸至少有一处端部与培养装置底部接触，然后向培养装置中加无菌水至与衬底平齐，再向滤纸滴加用无菌水配置的浓度为80～100ppm 的苯骈咪唑溶液，至有水滴出现为止，用喷壶向叶面均匀喷洒无菌水2～3次，盖上培养装置上盖后置于培养箱中20～23℃下培养8～10天，并按10～12 h光暗交替，光照强度8000～12000LUX。

[0034] 之后进行致病力测算。

[0035] a、统计致病孢子数：培养8～10天后统计夏孢子堆数，使用方格纸或扫描仪计算叶面积。

[0036] b、致病力计算：用以下公式进行致病力计算：

[0037] 总孢子量：S1（个/升）=（S1 *A1/a1）/V；

[0038] 致病孢子量：S2（个/升）=（S2*A1/a2）/V；

[0039] 致病力指数：S2/S1=(a1*S2)/(a2*S1)。

[0040] 上述参数定义为：A1取样装置底面积；a1载玻片涂抹凡士林区域面积；a2叶片面积；S1载玻片捕捉到的夏孢子数；S2叶片夏孢子堆数；S1每日单位体积空气中夏孢子数；S2每日单位体积空气中具致病力的夏孢子数；V空气取样体积。

[0041] 根据上述致病力指数即可较为准确地预测预报出大田种植罗布麻的栅锈病发生情况，进而有效地制订出防治预案。

[0042] 与现有技术相比，本发明解决了在测定病原菌数量的同时，能有效地测定具有侵染能力的病原菌数量，特别是解决了在空气微生物取样器完成取样的罗布麻离体叶片培养时易受污染腐烂的问题，适合于大田商业化种植罗布麻的栅锈病预测预报。

附图说明

[0043] 图1为罗布麻栅锈菌夏孢子专用取样装置的结构示意图。

[0044] 图2为图1A—A剖面的结构示意图

[0045] 图3为罗布麻栅锈菌夏孢子专用培养装置的结构示意图。

[0046] 图4为图3B—B剖面的结构示意图

[0047] 图示中：11为盒体，12为保湿体，13为载玻片，14为罗布麻叶片，15为胶带，16为脱脂棉，17为不干胶， 21为培养皿，22为衬底，23为支撑条，24为滤纸。

具体实施方式

[0048] 以下结合具体实施方式对本发明进行进一步说明。

[0049] 载体制作:在无菌环境中培育罗布麻植株并取其叶片作为捕捉载体。

[0050] a、培养基制作：选择颗粒较粗，透气性好的市售蛭石，一般选择颗粒直径在1～3mm的较好，将蛭石在烘箱120～171℃下灭菌48～72 h，取出装入育苗盘中。

[0051] b、催芽：选取当年采集的罗布麻种子80～100 g，用浓度为0.1～0.5%次氯酸钠溶液消毒3～5 min，用纱布过滤后再用无菌水冲洗3～5次。然后将种子放入三角瓶中，用封口膜扎住瓶口，放入40℃的水浴锅中催芽12 ～15h。待种子芽苞出现露白，倒去三角瓶中的水。

[0052] c、定植：催好芽的种子于5～10 h内在温室内进行定植。挑选饱满、露白的种子，用消毒后的镊子夹取点植于装好蛭石的育苗盘中，每窝10～15粒种子。用保鲜膜覆盖育苗盘，置于塑料底盘中，在底盘侧壁标记水位线，以底盘容积的1/2～2/3为宜。间隔3～5 d补水至水位线，保证蛭石水分处于饱和状态。

[0053] d、育苗：出苗后，倒掉底盘中的水，浇灌一次1/2的Hoaglandˊs营养液至水位线，间隔7～10天后待所有育苗盘中水分蒸干，浇灌第二次营养液至水位线。30～35天后开始间苗，每窝选留4～5株长势一致的幼苗。用黑色塑料薄膜包裹育苗盘，使罗布麻幼苗露出即可。设置温室白天温度20～25℃，夜间15～20℃，光照10000～12000LUX，空气相对湿度60～70%，培养7～10周。

[0054] 取样装置准备：在专用取样装置中安放取样载体。

[0055] a、准备取样装置：选用直径为9～15cm的培养皿作为盒体11（一次性医用培养皿或经过消毒的玻璃培养皿均可），取长×宽为76.2×25.4mm的玻璃片作为载玻片13，将载玻片13通过不干胶17或粘性硅胶一类的物体粘连于盒体11的底部，同时，与载玻片13并排安置长×宽为65～75×25～30mm的取样保湿体12，取样保湿体12根据实际安置1～3层吸水纸构成。

[0056] 当然，所述的载玻片13也可选用塑料片，取样保湿体12也可采用其它的有较强吸水作用的材料，如织物。

[0057] b、制作孢子捕捉玻片：在载玻片11的距上下缘10～15mm之间的区域内取豌豆粒大小的凡士林，均匀涂抹在载玻片11上作为孢子捕捉玻片。

[0058] c、制作孢子捕捉叶片：取所培育的罗布麻植株顶部向下第3～5轮处的健康叶片作为孢子捕捉叶片，将选取的罗布麻叶片14叶背向上安置于保湿体12上，罗布麻叶片14的叶梗处压盖小块脱脂棉16，用胶带15沿叶尖上缘0.5～1cm处将保湿体和叶片粘紧，同样用胶带15将叶片下端压盖的脱脂棉16粘紧，将取样装置直立，向保湿体上缘注无菌水，至下缘出现滴水为止，盖上盖保存即可。

[0059] 孢子的捕捉取样：

[0060] a、设置取样点：在锈病发生前开始取样，在大田中选择东、西、南、北及中心区域，每个方位设置3～5个取样点。

[0061] b、取样装置：使用定容式空气微生物取样器，固定在距地面高度为30～50cm支架上。

[0062] c、安装取样装置：将制作好的取样装置安放在定容式空气微生物取样器中。取样时间为：每天9点开始取样，下午2点前后和傍晚8点前后各换取一次取样装置。每次取样设置模式10～12个循环，每个循环取样80～120L空气，根据病害发生状况，初期取样100～120L，中期为90～100L，盛期为80～90L，末期为90～100L，循环间隔15～20min，雨天不取样。

[0063] d、统计总孢子数：将取样完毕的取样装置盖上盖子，带回室内，将载玻片取下，置于存贮盒中保存30天后，在显微镜下统计夏孢子数。

[0064] 离体培养：将取样后的孢子捕捉叶片进行离体培养。

[0065] a、叶片离体培养装置：用上部开口并设有盖，直径或边长为9～15cm，高2～5cm的盒体作为培养皿21，在盒体底部设置竹签或塑料棒呈栅栏状排列作为衬底22，竹签或塑料棒采用纵向的支撑条23架空。

[0066] 当然叶片离体培养装置的条状体也可用胶水相互平行粘在距皿底0.8～1cm处的侧壁上的方式架空。

[0067] b、取样后叶片的离体培养：将取完样的叶片放置与竹签方向垂直位置上，叶梗部用一块脱脂棉包裹，上下各用3～5层条形滤纸24覆盖，中间夹入“「”形滤纸24的上端，下端与皿底接触。然后向皿底加无菌水至快要接近竹签为止，向滤纸24滴加用无菌水配置的浓度为80～100ppm 的苯骈咪唑溶液，至有水滴出现为止。用喷壶向叶面均匀喷洒无菌水2～3次，最后盖上皿盖置于培养箱中培养，设置温度为20～23℃，光暗交替12h，光照强度8000～12000LUX。

[0068] 取样装置和离体培养装置的盒体也可采用圆形或方形的塑料、玻璃或其它类似材料制作。

[0069] 致病力测算

[0070] a、统计致病孢子数：培养8～10天后统计夏孢子堆数，使用方格纸或扫描仪计算叶面积。

[0071] b、致病力计算：

[0072] 总孢子量：S1（个/升）=（S1 *A1/a1）/V

[0073] 致病孢子量：S2（个/升）=（S2*A1/a2）/V

[0074] 致病力指数：S2/S1=(a1*S2)/(a2*S1)

[0075] p 、参数定义：

[0076] A1取样装置底面积；a1载玻片涂抹凡士林区域面积；a2叶片面积；s1载玻片捕捉到的夏孢子数；s2叶片夏孢子堆数；S1每日单位体积空气中夏孢子数；S2每日单位体积空气中具致病力的夏孢子数；V空气取样体积。

[0077] 根据上述致病力指数即可较为准确地预测预报出大田种植罗布麻的栅锈病发生情况，进而有效地制订出防治预案。

[0078] 需要声明的是，本发明的具体实施方式是对本发明的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。