用于检测传染性胰脏坏死病毒的LAMP引物组合物及其应用

摘要

本发明公开了一种用于检测传染性胰脏坏死病毒的LAMP引物组合物及其应用，该LAMP引物组合物由序列为SEQ ID No.1所示的正向内引物FIP、序列为SEQ ID No.2所示的反向内引物BIP、序列为SEQ ID No.3所示的正向外引物F3、序列为SEQ ID No.4所示的反向外引物B3组成。本发明的LAMP引物组合物用于快速检测样品中的传染性胰脏坏死病毒，对于传染性胰脏坏死病毒具有良好的特异性和灵敏度，所需检测仪器简单，能够快速、高效、准确检测传染性胰脏坏死病毒，适合口岸检验检疫机构和基层实验室推广。

权利要求

1.一种非疾病的诊断和治疗目的的传染性胰脏坏死病毒的检测方法，包括以下步骤：(1)待测样品中提取得到样品RNA；

(2)以步骤(1)得到的样品RNA为模板，用LAMP引物组合物进行RT-LAMP的扩增反应，扩增反应条件为在62℃恒温反应60min；

(3)扩增反应结束后，扩增产物用下述①、②或③的方法确定待测样品中是否含有传染性胰脏坏死病毒；

①扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察，如果在远离点样孔出现梯状条带，则证明待测样品中含有传染性胰脏坏死病毒；

②扩增产物中加入双链DNA染料PicoGreen显色剂后观察荧光颜色变化，如果反应后的反应液显示绿色荧光，则证明待测样品中含有传染性胰脏坏死病毒；

③从LAMP扩增反应开始时刻通过Loopamp浊度仪检测反应液，至扩增反应结束，观察LAMP浊度仪检测图，如果浊度逐渐增加，模块的颜色由绿色逐渐转变为红色，则证明待测样品中含有传染性胰脏坏死病毒，所述LAMP引物组合物由序列为SEQ ID No.1所示的正向内引物FIP、序列为SEQ ID No.2所示的反向内引物BIP、序列为SEQ ID No.3所示的正向外引物F3、序列为SEQ ID No.4所示的反向外引物B3组成。

说明书

用于检测传染性胰脏坏死病毒的LAMP引物组合物及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及用于检测传染性胰脏坏死病毒的LAMP引物组合物及其应用。

背景技术

[0002] 传染性胰脏坏死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus，IPNV)是一种经济上非常重要的鱼病病原体，在鲑科鱼类中能够引起及其严重的感染，导致高的死亡率。最初只在北美及欧洲的一些国家流行，近年来随着水生动物进口贸易的增加，传染性胰脏坏死病已传入我国并在一些地区流行，造成了严重的经济损失。目前，我国对该病病原IPNV的检测方法主要有病毒分离与鉴定方法、反转录-聚合酶链式反应方法、酶联免疫吸附试验方法等，这些检测方法虽已达到准确的诊断，但是耗时长、成本高、仪器设备要求高，检测步骤复杂，不能满足快速、准确检测该病毒的需求。因此，需要建立一种针对IPNV的快速、有效、准确且适合野外现场操作的方法，为我国的鲑鳟鱼类养殖提供科学有效的疫病疫情预防思路。

[0003] LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)法是2000年由Notomi等发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法。该方法采用特异地识别靶序列上六个区域的四条引物(两条外引物，两条内引物)及具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在65℃左右进行核酸的指数级扩增，其扩增效率可达到109-1010个拷贝数量级。整个反应仅需1小时，在扩增反应中副产物焦磷酸镁沉淀与钙黄绿素结合，产生黄绿色荧光，不需要借助其他仪器便可辨别实验结果。但目前该方法还没有应用于IPNV的检测。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种用于快速、准确检测传染性胰脏坏死病毒(IPNV)的LAMP引物组合物。

[0005] 本发明的另一目的在于该LAMP引物组合物的应用。

[0006] 本发明的目的可通过如下技术方案来实现：

[0007] 一种用于检测传染性胰脏坏死病毒的LAMP引物组合物，该引物组合物由序列为SEQ ID No.1所示的正向内引物FIP、序列为SEQ ID No.2所示的反向内引物BIP、序列为SEQ ID No.3所示的正向外引物F3、序列为SEQ ID No.4所示的反向外引物B3组成。

[0008] 本发明还提供上述LAMP引物组合物在检测传染性胰脏坏死病毒中的应用，包括以下步骤：

[0009] (1)提取样品中的RNA；

[0010] (2)以步骤(1)中提取的RNA为模板，进行RT-LAMP扩增反应；

[0011] (3)对步骤(3)得到的RT-LAMP扩增产物进行检测。

[0012] 在上述步骤(2)中，RT-LAMP扩增反应条件为：60-65℃下反应30-90分钟，停止反应；最为优选的反应条件为：62℃下反应60分钟，停止反应。

[0013] 在上述步骤(3)中LAMP扩增产物可以采用如下方法判定样品中是否含有传染性胰脏坏死病毒：①扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察，如果在远离点样孔出现梯状条带，则证明所检测的病毒为传染性胰脏坏死病毒，样品中含有该病毒；②扩增产物中加入双链DNA(dsDNA)染料PicoGreen显色剂后观察荧光颜色变化，如果反应后的反应液显示绿色荧光，则证明所检测的病毒为传染性胰脏坏死病毒，样品中含有该病毒；③从LAMP扩增反应开始时刻即通过Loopamp浊度仪检测反应液，至扩增反应结束，观察LAMP浊度仪检测图，如果浊度逐渐增加，模块的颜色由绿色逐渐转变为红色，则证明所检测的病毒为传染性胰脏坏死病毒，样品中含有该病毒。

[0014] 相对于现有技术本发明的有益效果在于：本发明的LAMP引物组合物，可以快速检测样品中的传染性胰脏坏死病毒(IPNV)，该LAMP引物组合物只对IPNV进行特异性的扩增，与其他病毒并无交叉反应，对IPNV的特异性和灵敏度较常规PCR方法高。利用本发明的LAMP引物组合物检测IPNV，检测时间短，对IPNV的特异性和灵敏度高，所需检测仪器简单，能够快速、高效、准确检测传染性胰脏坏死病毒，适合口岸检验检疫机构和基层实验室推广。本发明的方法，为我国鱼类能够顺利出口欧盟、美国等国家及地区奠定基础，也为及时发现鱼病疫情隐患，提高疫情预警和防控能力提供理论依据。

附图说明

[0015] 图1为利用本发明LAMP组合物在不同温度下进行的LAMP扩增反应结果的琼脂糖电泳图，其中泳道M为DL2000Marker，泳道1-6依次为反应温度60℃、61℃、62℃、63℃、64℃和65℃时的LAMP扩增结果。

[0016] 图2为利用本发明LAMP引物组合物在不同反应时间下进行的LAMP扩增反应结果的琼脂糖电泳图，其中泳道M为DL2000Marker，泳道1-5依次分别为恒温反应30min、45min、60min、75min和90min时的LAMP扩增结果。

[0017] 图3为利用本发明LAMP引物组合物进行的LAMP扩增反应结果的检测结果，其中图3A是通过琼脂糖凝胶电泳判读的结果：在电泳图中泳道M为DL2000Marker，泳道1和2分别为IPNV样品和阴性对照；图3B是通过检测浊度变化判读的结果：从LAMP扩增反应开始时刻即通过Loopamp浊度仪检测反应液，至扩增反应结束，图3B中横坐标1和2分别为IPNV样品和阴性对照。

[0018] 图4为利用本发明LAMP引物组合物检测IPNV的特异性分析的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道M为DL2000Marker，泳道1-5依次分别为IPNV、IHNV、SVCV、IPNV和ISA的RT-LAMP的扩增产物，泳道6为阴性对照。

[0019] 图5为利用本发明LAMP引物组合物检测IPNV的灵敏度分析的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道M为DL2000Marker，泳道1-8依次分别为反应体系中IPNV RNA含量1.0μg、0.1μg、0.01μg、1.0ng、0.1ng、0.01ng、0.01pg、0.001pg时的扩增产物。

具体实施方式

[0020] 下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。

[0021] 实施例1本发明LAMP引物组合物的设计和合成

[0022] 根据Genbank IPNV基因组中编码A片段多聚蛋白的核苷酸序列(Genbank NO：AF342728.1)，使用Primer Explore V3和Primer Premier5.0软件针对其中的6个区域(3’端的F3c、F2c、F1c以及5’端的B1、B2、B3)设计LAMP引物，对不同引物组进行LAMP扩增实验和检测分析，最终筛选出扩增速率高、特异性好的一组LAMP引物，分别为正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3，其序列如表1。引物由大连宝生物工程有限公司合成。

[0023] 表1.IPNV RT-LAMP检测引物组

[0024]

[0025] 实施例2RT-LAMP反应条件的优化

[0026] 1.样品RNA模板的准备

[0027] 本发明中使用的传染性胰脏坏死病病毒(IPNV)分离株，由文献(胡晓利，李伟，肇慧君，吴斌.虹鳟鱼传染性胰脏坏死病病毒的分离与鉴定，中国动物检疫，2012，29(3)：27-30)所述的方法分离得到，并保存于辽宁出入境检验检疫局技术中心动检实验室。采用Takara MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒，从该病毒细胞培养物中提取得到样品RNA，具体操作步骤参照试剂盒说明书。

[0028] 2.RT-LAMP反应体系

[0029] RT-LAMP扩增反应采用核糖核酸扩增试剂盒(RT-LAMP)，深圳博睿祥生物技术有限公司，具体操作步骤参照试剂盒说明书。

[0030] RT-LAMP采用25μL反应体系，加入的组分剂量如下：

[0031]

[0032]

[0033] 配制反应体系时，以同体积的无核酸酶H2O替代RNA模板作为阴性对照。

[0034] 3.RT-LAMP的扩增反应及结果判定

[0035] 按照上述步骤2准备反应体系进行RT-LAMP扩增反应后，扩增产物用下述3种方法判定。

[0036] 方法1：通过琼脂糖凝胶电泳判读结果：取扩增产物8μL进行凝胶电泳，紫外投影下观察，靠近点样孔出现拖尾，远离点样孔出现梯状条带的样品判为阳性，未出现梯度条带的样品判为阴性。

[0037] 方法2：通过观察荧光颜色变化判读结果(荧光显色法)：在反应管中加入双链DNA(dsDNA)染料PicoGreen，反应后的反应液显示绿色荧光的判为阳性，而反应后的反应液显示浅橙色荧光的判为阴性。

[0038] 方法3：通过检测浊度变化判读结果：从LAMP扩增反应开始时刻即通过Loopamp浊度仪(日本荣研化学株式会，LA-320C；参数：光源为ED(波长650mm)，检出器为光电二极管，温度调节范围为区域(55-70℃)、光罩(65-90℃)，测定间隔为6秒，检测反应液至扩增反应结束。在LAMP浊度仪检测图中，随着反应产物浊度的增加，模块颜色转变为红色，表明IPNV基因被扩增，判定为阳性；而反应液未发生扩增时浊度无变化(近于0)，模块的颜色仍旧为绿色，表明不存在IPNV基因的扩增，判定为阴性。

[0039] 上述方法中，所述“阳性”表示，样品中含有传染性胰脏坏死病毒；所述“阳性”表示样品中不含有传染性胰脏坏死病毒。

[0040] 4.RT-LAMP扩增反应最佳反应温度的优化

[0041] 按照步骤2准备6个相同的反应体系(相同模板、相同的组份配置)，反应体系分别在60℃、61℃、62℃、63℃、64℃和65℃的温度下，恒温反应60min，以确定最佳反应温度；

[0042] 从反应完成的反应管中取8μL扩增产物进行凝胶电泳，电泳结果如图1，其中泳道1-6依次为反应温度60℃、61℃、62℃、63℃、64℃和65℃时的反应管扩增产物。泳道M为DL2000Marker。在紫外投影下观察，反应管1-6的扩增产物在远离点样孔均出现梯状条带，呈阳性，其中反应温度为62℃时梯状特征条带最亮，说明反应温度为62℃时扩增效果最好。

[0043] 另外，向含有扩增产物6μL的反应管中加入1μL双链DNA(dsDNA)染料PicoGreen显色剂，观察反应液的颜色，可以观察到6个反应管的反应液均显示不同强度的绿色荧光，其中反应温度为62℃的反应管中产生的绿色荧光最深。

[0044] 综合对于上述对不同反应温度下的扩增产物的判定结果，可以确定反应温度62℃是利用本发明LAMP引物组合物扩增IPNV基因的最适RT-LAMP反应温度。

[0045] 5.RT-LAMP扩增反应最佳反应时间的优化

[0046] 按照步骤2准备5个相同的反应体系(相同模板、相同的组份配置)，反应体系在62℃的温度下，分别恒温反应30min、45min、60min、75min和90min，以确定最佳反应时间。

[0047] 从反应完成的反应管中，取8μL扩增产物进行凝胶电泳，电泳结果如图2所示，其中泳道M为DL2000Marker，泳道1-5依次分别为恒温反应30min、45min、60min、75min和90min后的LAMP反应扩增产物。图2中可见，在45min-90min反应时间范围内，均能看见梯状特征条带，但最亮的为反应时间60min时所产生的条带，可以确定最佳反应时间为60min。

[0048] 因此在本发明中，采用所选的LAMP引物组合物检测传染性胰脏坏死病毒的RT-LAMP扩增反应的最佳反应条件为：在62℃恒温反应60min。

[0049] 实施例3不同方法判定利用LAMP引物组合物进行的RT-LAMP扩增产物

[0050] 按照实施例2中步骤2的方法准备加入传染性胰脏坏死病毒分离株RNA模板的样品反应体系(简称：IPNV样品)和阴性对照反应体系，在62℃恒温反应60min后，停止反应，采用实施例2中步骤3所述的LAMP反应结果判定方法判定样品中是否含有IPNV。

[0051] 方法1：从反应完成的反应管中，取8μL扩增产物进行凝胶电泳，电泳结果如图3A，其中泳道M为DL2000Marker，泳道1和2分别为IPNV样品和阴性对照。图3结果显示，IPNV样品的泳道出现梯状特异性条带，而阴性对照没有出现梯状特异性条带，可知IPNV样品中IPNV基因被扩增，样品中含有IPNV。

[0052] 方法2：向含有扩增产物6μL的反应管中加入1μL双链DNA(dsDNA)染料PicoGreen显色剂，观察反应管反应液的颜色，可以观察到IPNV样品的反应液显示很强的绿色荧光，IPNV被扩增，样品中含有IPNV，而阴性对照的反应液显示浅橙色荧光，无IPNV扩增，样品中没有IPNV。

[0053] 方法3：从LAMP扩增反应开始时刻即通过Loopamp浊度仪(日本荣研化学株式会，LA-320C；参数：光源为ED(波长650mm)，检出器为光电二极管，温度调节范围为区域(55-70℃)、光罩(65-90℃)，测定间隔为6秒)检测反应液，至扩增反应结束。LAMP浊度仪检测图如图3B所示。图3B的横坐标1和2分别为IPNV样品和阴性对照，可以看出IPNV样品浊度达到0.5，模块的颜色为红色，说明IPNV被扩增；而阴性对照的浊度为0，模块的颜色仍旧为绿色，说明反应液未发生扩增。

[0054] 从方法1-3的结果来看，这3种方法均可以用于利用本发明LAMP引物组合物的IPNV基因扩增结果的判定，含有IPNV的阳性样品和阴性对照(无IPNV)的扩增结果之间的区别十分明显。可以采用上述3种方法中的一种或两种以上的方法的组合用于利用本发明LAMP引物组合物扩增的IPNV基因LAMP扩增结果的判定。

[0055] 实施例4利用本发明LAMP引物组合物检测IPNV的特异性分析

[0056] 按照实施例2步骤1-2所述的方法准备IPNV(传染性胰脏坏死病毒)、IHNV(传染性造血器官坏死病毒)、SVCV(鲤春病毒)、VHSV(病毒性出血性败血症病毒)和ISA(传染性鲑鱼贫血症病毒)的RNA作为模板，分别进行RT-LAMP扩增反应，扩增反应温度为62℃，扩增反应时间为60min。

[0057] 从反应完成的反应管中，分别取8μL扩增产物进行凝胶电泳，电泳结果如图4，其中泳道M为DL2000Marker，泳道1-5依次分别为IPNV、IHNV、SVCV、IPNV和ISA的RT-LAMP的扩增产物，泳道6为阴性对照。图4的结果可见，只有扩增IPNV的泳道1出现梯状特异性条带，基因被扩增，而其余泳道均没有出现梯形条带，基因没有被扩增，表明本发明的LAMP引物组合物只对IPNV进行了特异性的扩增，与其他病毒并无交叉反应。

[0058] 实施例5利用本发明LAMP引物组合物检测IPNV的灵敏度分析

[0059] 按照实施例2步骤1所述的方法准备IPNV RNA，并用无核酸酶H2O进行稀释，得到不同浓度的IPNV RNA，分别配制含有不同浓度IPNV RNA的25μl LAMP反应体系。反应体系中IPNV RNA总含量分别为1.0μg(100倍稀释)、0.1μg(10-1倍稀释)、0.01μg(10-2倍稀释)、1.0ng(10-3倍稀释)、0.1ng(10-4倍稀释)、0.01ng(10-5倍稀释)、0.01pg(10-8倍稀释)、0.001pg(10-9倍稀释)。所述反应体系，分别进行RT-LAMP扩增反应，扩增反应温度为62℃，扩增反应时间为60min。

[0060] 从反应完成的反应管中，分别取8μL扩增产物进行凝胶电泳，电泳结果如图5，其中0
泳道M为DL2000Marker，泳道1-8依次分别为IPNV RNA总含量分别为1.0μg(10倍稀释)、0.1μg(10-1倍稀释)、0.01μg(10-2倍稀释)、1.0ng(10-3倍稀释)、0.1ng(10-4倍稀释)、0.01ng(10-5倍稀释)、0.01pg(10-8倍稀释)、0.001pg(10-9倍稀释)时的扩增产物。图5的结果可见，泳道
1-7均出现梯状特异性条带，但随着模板RNA含量的降低，特征性条带的亮度也减弱，而泳道
8没有出现梯形条带。出现IPNV基因阳性结果(出现梯状特异性条带)的最小RNA量为0.01pg RNA。