茶叶中儿茶素类含量的检测方法转让专利
申请号 : CN201310485392.0
文献号 : CN103940920B
文献日 : 2016-04-13
发明人 : 周顺珍 , 龚雪 , 周国兰 , 郭灿 , 郑文莉
申请人 : 贵州省茶叶研究所
摘要 :
本发明公开了一种茶叶中儿茶素类含量的检测方法，采用水来代替稳定溶液来配置测试液及标样工作液，提高了测试液及标样工作液分离效果，使基本上可以回到基线，且可以保存的时间较长，保存在-4℃条件下，至少半年以上。而且无论是标样工作液还是测试液，七种化合物都能完全分离，且分离效果良好。色谱峰的保留时间重现性也相对较好。并且，有效避免了现有采用稳定液存在的容易污染排气阀滤心、造成堵塞的问题。还通过改进色谱条件，提高了液相色谱柱的选择范围。
权利要求 :
1.一种茶叶中儿茶素类含量的检测方法，其特征在于：包括如下步骤:
1）将待测茶叶磨碎，将磨碎的茶叶加入70℃的质量百分比为70%的甲醇溶液中，将溶液搅拌均匀后，在70℃的水浴中进行浸提，使浸提溶液自然冷却至室温；将冷却后的浸提溶液进行离心提取，取上清液；再将离心提取的残渣重复上述步骤进行提取，将提取液合并摇匀，进行过滤后，获得母液备用；
2）将母液加水定容后，进行过滤，获得测试液；然后将测试液按照色谱条件为：90～
80%A相、10～20% B相-->10～15min内由90～80%A相→80%～75%A相、20～25%B相-->20～25min内由80%～75%A相→70%～60%A相、30～40%B相-->25～30min内由
70%～60%A相→90～80%A相、10～20% B相-->90～80%A相、10～20% B相保持5min，进行色谱分析，待压力和柱温稳定后，进行空白运行；准确吸取混合用水配制的标准工作液注射入HPLC，在相同的色谱条件下注射与标准工作液相同体积的测试液；测试液以峰面积定量；流动相A为水，流动相B为N，N二甲基甲酰胺、甲醇及乙酸的组合，N，N二甲基甲酰胺、甲醇及乙酸之间的体积比为35～45：1.5～2.5：1.5～2；所采用的液相色谱柱的型号为 C18，粒径为5μm，250mm×4.6mm或粒径为5μm，150mm×4.6mm；
3）将测试的结果带入公式（1）计算获得儿茶素含量；
式中：A表示样品峰面积、V表示样品提取液体积ml；fstd表示所测成分的校正因子；d表示稀释因子；m1表示取样量g；m表示样品的干物质含量%。
2.根据权利要求1所述的茶叶中儿茶素类含量的检测方法，其特征在于：步骤1）中所述的浸提的时间为10分钟，每隔5分钟进行一次搅拌。
3.根据权利要求1所述的茶叶中儿茶素类含量的检测方法，其特征在于：步骤1）中所述的离心提取的转速为3500r/min ，提取时间为10分钟。
4.根据权利要求1所述的茶叶中儿茶素类含量的检测方法，其特征在于：步骤1）及步骤2）中所述的过滤采用0.45μm膜进行过滤。
说明书 :
茶叶中儿茶素类含量的检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种茶叶科学领域，特别是一种茶叶中儿茶素类含量的检测方法。
背景技术
[0002] 现在，普遍厂家的C18(粒径5um ，250mm×4.6mm )色谱柱不能分离EGCG和EC，这也是多家实验室反映的问题。经咨询标准起草人，也说是柱子的问题，推荐买大连依利特Hyspersil ODS2 C18(粒径5um ，250mm×4.6mm )色谱柱后，标样基本上可以分开，但也不是很理想，而样品的分离效果就更差一些。且在EGC和+C色谱峰的右侧或者左侧出现一干扰峰，致使其分离度降低，峰形不对称，拖尾严重，给积分造成较大误差。
[0003] 现有的方法中，用稳定液配制的标样工作液分离效果不如用水的好，且不能保存较长时间。而且用稳定液配制测试液容易污染排气阀滤心，造成堵塞。
发明内容
[0004] 本发明所要解决的技术问题是：提供一种茶叶中儿茶素类含量的检测方法，它能将标样工作液或样品测试液中的多种化合物完全分离，且分离效果良好，色谱峰的保留时间重现性也相对较好，以克服现有技术的不足。
[0005] 本发明的是这样实现的：茶叶中儿茶素类含量的检测方法，包括如下步骤:
[0006] 1）将待测茶叶磨碎，将磨碎的茶叶加入70℃的质量百分比为70%的甲醇溶液中，将溶液搅拌均匀后，在70℃的水浴中进行浸提，使浸提溶液自然冷却至室温；将冷却后的浸提溶液进行离心提取，取上清液；再将离心提取的残渣重复上述步骤进行提取，将提取液合并摇匀，进行过滤后，获得母液备用；
[0007] 2）将母液加水定容后，进行过滤，获得测试液；然后将测试液按照色谱条件为90～80%A相、10～20% B相-->10～15min内由90～80%A相→80%～75%A相、20～
25%B相-->20～25min内由80%～75%A相A相→70%～60A相、30～40%B相-->25～
30min内由70%～60A相→90～80%A相、10～20% B相-->90～80%A相、10～20% B相保持5min，进行色谱分析，待压力和柱温稳定后，进行空白运行；准确吸取混合标准系列工作液注射入HPLC，在相同的色谱条件下注射与标准系列工作液相同体积的测试液；测试液以峰面积定量；流动相A为水，流动相B为N，N二甲基甲酰胺、甲醇及乙酸的组合为，N，N二甲基甲酰胺、甲醇及乙酸之间的体积比为35～45：1.5～2.5：1.5～2。
25%B相-->20～25min内由80%～75%A相A相→70%～60A相、30～40%B相-->25～
30min内由70%～60A相→90～80%A相、10～20% B相-->90～80%A相、10～20% B相保持5min，进行色谱分析，待压力和柱温稳定后，进行空白运行；准确吸取混合标准系列工作液注射入HPLC，在相同的色谱条件下注射与标准系列工作液相同体积的测试液；测试液以峰面积定量；流动相A为水，流动相B为N，N二甲基甲酰胺、甲醇及乙酸的组合为，N，N二甲基甲酰胺、甲醇及乙酸之间的体积比为35～45：1.5～2.5：1.5～2。
[0008] 3）将测试的结果带入公式（1）计算获得儿茶素含量。
[0009]
[0010] 式中：C1表示标样浓度%；A表示标样峰面积、V表示样品提取液体积ml；fstd表示所测成分的校正因子（浓度/峰面积，浓度单位为μg/ml）、d表示稀释因子（通常为2ml稀释成10ml，则稀释因子为5）；m1表示取样量g；m表示样品的干物质含量%。
[0011] 步骤1）中所述的浸提的时间为10分钟，每隔5分钟进行一次搅拌。
[0012] 步骤1）中所述的离心提取的转速为3500r/min ，提取时间为10分钟。
[0013] 步骤1）及步骤2）中所述的过滤采用0.45μm膜进行过滤。
[0014] 所采用的液相色谱柱的型号为 C18，粒径为5μm，250mm×4.6mm或粒径为5μm，150mm×4.6mm。
[0015] 本发明采用水来代替稳定溶液来配置测试液及标样工作液，提高了测试液及标样工作液分离效果，使基本上可以回到基线，且可以保存的时间较长，保存在-4℃条件下，至少半年以上。而且无论是标样工作液还是测试液，都能将其中八种化合物（这八种化合物包括国标要求的七种）完全分离，且分离效果良好。色谱峰的保留时间重现性也相对较好。并且，有效避免了现有采用稳定液存在的容易污染排气阀滤心、造成堵塞的问题。还通过改进色谱条件，提高了液相色谱柱的选择范围。
[0016] 附图说明：
[0017] 附图1为本发明的色谱条件。
[0018] 具体实施方式：
[0019] 本发明的实施例：茶叶中儿茶素类含量的检测方法，
[0020] 1 原理：
[0021] 茶叶磨碎试样中的儿茶素类用质量百分比为70%的甲醇溶液在70℃水浴上提取，儿茶素类的测定用C18柱、检测波长278nm、梯度洗脱、HPLC分析，用儿茶素类标准物质外标法直接定量。
[0022] 2仪器：
[0023] 2.1分析天平：感量0.0001g。
[0024] 2.2水浴；70℃±1℃。
[0025] 2.3离心机：转速3500r/min。
[0026] 2.4混匀器。
[0027] 2.5高效液相色谱仪（HPLC）：包含梯度洗脱及检测器（检测波长278nm）。
[0028] 2.6数据处理系统。Agilent1化学工作站。
[0029] 2.7液相色谱柱：只要是 C18（粒径5μm，250mm×4.6mm）或C18（粒径5μm，150mm×4.6mm）都可以。
[0030] 3试剂：
[0031] 3.1水：纯水。
[0032] 3.2乙腈：色谱纯。
[0033] 3.3甲醇：分析纯。
[0034] 3.4乙酸：分析纯。
[0035] 3.5甲醇水溶液（体积比）：7+3。
[0036] 3.6乙二胺四乙酸（EDTA）溶液 ：10mg/ml（现配）。
[0037] 3.7抗坏血酸溶液：10 mg/ml（现配）。
[0038] 3.8稳定溶液：分别将25mlEDTA溶液（3.6）、25ml抗杯血酸溶液（3.7）、50 ml乙腈（3.2）加入500ml容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。
[0039] 3.9液相色谱流动相
[0040] 3.9.1流动相A：水。
[0041] 3.9.2流动相B：N，N二甲基甲酰胺+甲醇+乙酸=（35～45）+（1.5～2.5）+（1.5～2）（体积比）。
[0042] 3.10标准储备溶液
[0043] 3.10.1咖啡碱储备溶液：2.00mg/ml。
[0044] 3.10.2没食子酸（GA）储备溶液：0.100mg/ml。
[0045] 3.10.3儿茶素类储备溶液：+C1.00 mg/ml +EC1.00 mg/ml +EGC2.00 mg/ml +EGCG2.00 mg/ml +ECG2.00 mg/ml。
[0046] 3.11标准工作溶液：用水配制的标样工作液，可以保存的时间较长，至少半年以上。（保存在-4℃条件下）。
[0047] 标准工作溶液的浓度：没食子酸5μg/ml～25μg/ml、咖啡碱50μg/ml～150μg/ml、+C50μg/ml ～ 150μg/ml、+EC50μg/ml ～ 150μg/ml、+EGC100μg/ml ～
300μg/ml、+EGCG100μg/ml～400μg/ml、ECG50μg/ml～200μg/ml。
300μg/ml、+EGCG100μg/ml～400μg/ml、ECG50μg/ml～200μg/ml。
[0048] 4测定步骤
[0049] 4.1试液制备：
[0050] 按GB/T8303的规定。
[0051] 4.2供试液的制备：
[0052] 4.2.1母液：称取0.2000g均匀磨碎的试样于10ml离心管中，加入在70℃中预热过的70%甲醇溶液（3.5）5ml，用玻璃棒充分搅拌均匀湿润，立即移入70℃水溶中，浸提10min（隔5min搅拌一次），浸提后冷至室温，转入离心机在3500r/min转速下离心10min，将上清液转移至10ml容量瓶。残渣再用5ml的70%甲醇溶液提取一次，重复以上操作。合并提取液定容至10ml摇匀，过0.45μm膜，待用（该提取液在4℃下可至多保存24h。
[0053] 4.2.2测试液：用移液管移取母液（4.2.1）2ml至10ml容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，过0.45μm膜，待测。
[0054] 色谱条件：
[0055] 修改后的色谱条件如图1所示。
[0056] 4.2.3测定：
[0057] 待压力和柱温稳定后，进行空白运行。准确吸取10μl混合标准系列工作液注射入HPLC。在相同的色谱条件下注射10μl测试液。测试液以峰面积定量。
[0058] 5结果计算：
[0059]
[0060] 6重复性：
[0061] 同一样品儿茶素类总量的两次测定值相对误差应≦10%，若测定值在此范围，则取两次测得的算术平均值为结果，保留小数点后两位。