抗OX40抗体及使用其的方法

摘要

公开了与人OX40特异结合的人抗体，优选地重组的人抗体，人源化的和嵌合的两种。优选的抗体具有对OX40受体的高亲和性并且体外和体内活化所述受体。所述抗体可以是全长抗体或其抗原结合部分。所述抗体或抗体部分被用于调节受体活性，例如在患有其中OX40活性是有害的病症的人类受试者中。提供了用于表达所述重组人抗体的核酸、载体和宿主细胞，以及还提供了合成重组人抗体的方法。

权利要求

1.一种与人OX40结合的分离的抗体或其抗原结合部分，其包含：(a)由SEQ ID NO:25的氨基酸序列构成的重链可变区CDR1；(b)由SEQ ID NO:26的氨基酸序列构成的重链可变区CDR2；(c)由SEQ ID NO:27的氨基酸序列构成的重链可变区CDR3；(d)由SEQ ID NO.32的氨基酸序列构成的轻链可变区CDR1；(e)由SEQ ID NO.33的氨基酸序列构成的轻链可变区CDR2；(f)由SEQ ID NO.34的氨基酸序列构成的轻链可变区CDR3。

2.根据权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体包含由SEQ ID NO:

29的氨基酸序列构成的重链可变区和由SEQ ID NO:36的氨基酸序列构成的轻链可变区。

3.根据权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体包含由SEQ ID NO:

45的氨基酸序列构成的重链和由SEQ ID NO:47的氨基酸序列构成的轻链。

4.权利要求1至3任一项所述的抗体，其中，所述抗体为单克隆抗体。

5.权利要求4所述的抗体，其中，所述单克隆抗体为人源化的。

6.根据权利要求1至3任一项所述的抗体的抗原结合部分，其中，所述抗原结合部分保留特异地结合和激动人OX40的能力。

7.编码权利要求1至6任一项所述的抗体或其抗原结合部分的分离的核酸。

8.一种包含编码权利要求1至6任一项所述的抗体或其抗原结合部分的核酸的宿主细胞。

9.一种生产抗体或其抗原结合部分的方法，其包含培养权利要求8所述的宿主细胞的步骤。

10.如权利要求9所述的方法，其进一步包含从所述宿主细胞回收所述抗体或其抗原结合部分。

11.如权利要求1至6任一项所述的抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

12.一种药物组合物，其包含在药学上可接受的载体中的如权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合部分。

说明书

抗OX40抗体及使用其的方法

技术领域

[0001] 本发明通常涉及OX40受体活化的调节，以及更具体地，涉及调节所述OX40受体以抑制产生白介素10(IL-10)的CD4+1型调节性T细胞(“Tr1细胞”)和表达Foxp3+的调节性T细胞(本文中有时也称为“Foxp3+T-reg”细胞)的免疫抑制功能，以及Tr1细胞由CD4+细胞或幼稚细胞的生成和IL-10的产生。

[0002] 相关申请的交叉引用

[0003] 这是2011年8月23日提交的在先PCT申请第PCT/US11/48752号的部分继续申请，其要求2010年8月23日提交的美国临时申请第61/375,999号和2010年9月8日提交的美国临时申请第61/380,827号的权益。这些申请通过引用并入本文。

[0004] 关于联邦资助研究或开发的声明

[0005] 本发明是在由国立卫生研究院授予的R01AI061645-01、R01AI062888-01和U19AI071130-01下由政府支持做出的。所述政府享有本发明的某些权利。

[0006] 联合研究协议参与方的名称

[0007] 无

[0008] 对序列表的引用

[0009] 本公开包括作为2012年2月1日创建的，名称为序列表.txt的，依照37C.F.R.§1.52(e)(v)的文本文件递交的序列表，具有32,796字节大小，其通过引用并入本文。所附序列描述和序列表遵守如37C.F.R.§§1.821-1.825中所阐述的适用于专利申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开的规则。所述序列表包含如符合Nucleic Acids Res.13:3021-3030(1985)and in the Biochemical J.219(No.2):345-373(1984)中描述的IUPAC-IUBMB标准所定义的用于核苷酸序列特性的单字母代码和用于氨基酸的三字母代码。用于核苷酸和氨基酸序列的符号和格式遵守37C.F.R.§1.822中阐述的规则。

背景技术

[0010] Tr1细胞在外周耐受中具有关键作用。Tr1细胞在限制炎症性免疫响应期间对宿主的组织损伤中特别重要。Tr1细胞的生成伴随着体内和体外的TH1和TH2免疫响应。

[0011] Tr1细胞在抗原驱动的T细胞免疫响应期间由幼稚CD4+T细胞生成。Tr1细胞在对通过TCR、CD28和IL-2受体的信号传导的响应中是无变应性的并且具有抑制抗原驱动的幼稚CD4+T细胞体内和体外增殖的能力。Tr1细胞具有抑制自身免疫性疾病的发展并限制对微生物病原体的免疫响应的等级的能力。

[0012] 尽管已经研究了导致Tr1细胞的分子信号，但关于负调节这些细胞生成的分子信号所知甚少。尽管免疫抑制药物、细胞因子、共刺激分子和DC已经牵涉于Tr1细胞的诱导中，但负调节Tr1细胞生成的信号仍然是难以捉摸的。

发明内容

[0013] OX40受体的活化阻断Tr1从幼稚或记忆CD4+T细胞的生成以及IL-10从Tr1细胞的产生和所述Tr1细胞的免疫抑制功能。OX40受体的活化还阻断IL-10经由Foxp3+T-reg细胞的产生和免疫抑制功能。同样地，本文给出的是与OX40受体结合的激动剂抗体，由此所述激动剂调节OX40受体的活化以阻断IL-10细胞因子分泌和/或Tr1和Foxp3+T-reg细胞全部免疫抑制功能。基本上，抗体可模拟OX40配体并触发Tr1和/或天然调节性T细胞(“nTregs”)，也称为“Foxp3+T-regs.”上的OX40受体。

[0014] 如我们在共同未决的专利申请美国序列号11/659,266和12/861,135中所示，OX40L抑制由免疫抑制药物地塞米松和维生素D3诱导的产生IL-10的Tr1细胞从幼稚和记忆+CD4 T细胞的生成和功能。我们发现OX40L抑制产生IL-10的调节性T细胞的生成和功能。这些发现证实经由OX40L的信号传导OX40抑制培养中产生人类IL-10的免疫抑制T细胞的生成。OX40L的这一独有的功能未被两个另外的共刺激TNF家族成员，GITR-配体和4-1BB-配体，所共有。OX40L还强烈抑制由可诱导的共刺激配体和不成熟DC提供的两种生理刺激诱导的产生IL-10的Trl细胞的生成和功能。经由单克隆抗体、小分子或者经由OX40L或与其具有至少90百分比同源性的蛋白的信号传导人类T细胞上的OX40受体调节和控制产生IL-10的免疫抑制T细胞的生成和功能。

[0015] 所述发现带来多个治疗应用。例如，激动型抗体、小分子或OX40L可被用于抑制产生IL-10的免疫抑制T细胞的生成和功能并因此可被用于增强免疫响应以治疗癌症和传染性疾病，或者作为癌症疫苗的佐剂。OX40或OX40L的拮抗型抗体或拮抗型小分子可被用于增强产生IL-10的免疫抑制T细胞的生成和功能并因此可被用于自身免疫性疾病和移植物抗宿主疾病的疗法的开发。我们的发现还为癌症或作为选择地自身免疫性疾病和移植物抗宿主疾病的治疗上的开发提供筛选活化T细胞上OX40受体(或反向阻断OX40信号传导)的抗体或小分子的高通量方法。

[0016] 本文提供结合人OX40受体的单克隆抗体和人抗体(本文有时称为“抗OX40抗体”和/或其另外的变化形式)。这些抗体被用于治疗或预防其病理涉及OX40的急性或慢性疾病或病况。在一个方面，描述了与人OX40结合并作为癌症治疗或抗自身免疫性疾病治疗有效的分离的人抗体或其抗原结合部分。本文公开的抗OX40抗体中的任一个可被用作药剂。抗OX40抗体中的任一个或多个可被用于治疗本文描述的多种癌症或自身免疫性疾病中的一种或多种。

[0017] 本文提供结合OX40的分离的人源化抗体。本文描述的分离的抗体与OX40结合，并且可与来自下列基因编码的OX40结合：NCBI登录号NP_003317、Genpept登录号P23510或与其具有90百分比同源性的基因。本文提供的分离的抗体还与具有下列GenBank登录号中的一个的OX40受体结合：AAB39944、CAE11757或AAI05071。

[0018] 如本文教导的，示例性的是与OX40结合的分离的抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO.3的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO.7的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO.8的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO.9的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。

[0019] 此外，另一个实例是与OX40结合的分离的抗体，其包含：(a)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO.15的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO.19的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO.20的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO.21的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。

[0020] 此外，另一个实例是与OX40结合的分离的抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO.27的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO.32的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO.33的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO.34的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。

[0021] 作为选择，分离的抗体可具有包含SEQ ID NO:1或13的氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:2或14的氨基酸序列的重链可变区CDR2；和/或包含SEQ ID NO:3或15的氨基酸序列的重链可变区CDR3，或者与其具有90百分比同源性的重链可变区CDR。

[0022] 而且，分离的抗体可具有包含SEQ ID NO:7或19的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:8或20的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和/或包含SEQ ID NO:9或21的氨基酸序列的轻链可变区CDR3，或者与其具有90百分比同源性的重链可变区CDR。

[0023] 所述分离的抗体可具有包含SEQ ID NO:10、11、22或23的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10、11、22或23的氨基酸序列具有至少90百分比同一性的氨基酸序列的轻链可变区(“VL”)。所述分离的抗体可具有包含SEQ ID NO:4、5、16或17的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4、5、16或17的氨基酸序列具有至少90百分比同一性的氨基酸序列的重链可变区(“VH”)。同样地，作为实例，所述分离的抗体可包含SEQ ID NO：5的可变重链序列和SEQ ID NO:11的可变轻链序列，或与其具有90百分比同源性的序列。类似地，所述分离的抗体可具有SEQ ID NO：17的可变重链序列和SEQ ID NO:23的可变轻链序列，或与其具有90百分比同源性的序列。

[0024] 所述分离的抗体可具有由SEQ ID NO:12或24的核酸序列或与SEQ ID NO:12或24的核酸序列具有至少90百分比同一性的核酸序列编码的可变轻链。所述分离的抗体可具有由SEQ ID NO:6或18的核酸序列或与SEQ ID NO:6或18的核酸序列具有至少90百分比同一性的核酸序列编码的可变重链。

[0025] 本文还提供单克隆抗体。所述单克隆抗体可具有包含SEQ ID NO:10或22的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10或22的氨基酸序列具有至少90百分比同一性的氨基酸序列的可变轻链。还提供具有包含SEQ ID NO:4或16的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4或16的氨基酸序列具有至少90百分比同一性的氨基酸序列的可变重链的单克隆抗体。

[0026] 本文还提供编码本文教导的抗OX40抗体中的任一种的分离的核酸。本文还提供的是宿主细胞，其每个包含编码本文描述的抗OX40抗体中的任一种的核酸。进一步提供产生抗体(比如包含编码本文描述的抗OX40抗体中的任一种的核酸的宿主细胞)的方法，其包含培养所述宿主细胞以便抗体产生和/或从所述宿主细胞回收所述抗体。

附图说明

[0027] 上文简要概括的本发明的更具体的描述可通过参照在形成本说明书一部分的附图中说明的其实施方案来完成，因此上文列举的本发明的特征、方面和优点以及其他将以变得清楚的方式获得并被详细地理解。然而，应注意的是，附图说明本发明的某些实施方案但并不因此被认为限制本发明的范围，因为本发明可允许其他等同有效的实施方案。

[0028] 图1显示浸润人类滤泡性淋巴瘤(FL)组织并与肿瘤B细胞和单核细胞共定位的FOXP3+Treg。左边：FOXP3+Treg(红色)和CD20+B淋巴瘤细胞(绿色)的双重免疫染色；右边：FOXP3+Treg(红色)和CD11c+单核细胞/巨噬细胞/DC(绿色)。

[0029] 图2A和2B显示患有FL的患者中增加数目的CD4+FOXP3+Treg。从处于治疗前的初次诊断的患有FL的六个患者获得肿瘤细胞和PBMC。还从六个正常供体获得PBMC用于比较。调节性T细胞占全部CD4+T细胞的百分比通过CD4+CD25+CD127低FOXP3+Treg的流式细胞计数分析来确定。图2A显示Treg的代表性FACS分析。FL PBMC和FL肿瘤细胞来源于相同的患者。图2B显示所有供体的Treg百分比。单划线表示平均值。

[0030] 图3显示从FL分离ICOS+FOXP3+或ICOS–FOXP3+Treg。从未进行任何治疗的脾脏样本获得单细胞悬浮液。在测定当天将细胞解冻。将富集的CD4+CD8–CD14–CD16–CD56–CD11c–TCRγδ–T细胞分为CD25低和CD25高亚类。将CD4+CD25高FOXP3+Treg根据ICOS的表面表达进一步分高 低选为ICOS 和ICOS 亚类。在所有亚类中确定FOXP3的细胞内表达。

[0031] 图4显示瘤内Treg抑制FL中浸润性CD4+CD25–T细胞的增殖，并且所述抑制可被抗IL-10中和抗体部分阻断。用通过重组CD40L预活化的自体肿瘤细胞在自体ICOS+FOXP3+Treg或ICOS-FOXP3+Treg或抗IL-10(10μg/ml)存在或不存在的情况下培养CFSE标记的CD4+CD25–+ –肿瘤浸润T细胞。培养72小时后，通过CFSE稀释法的流式细胞分析确定CD4CD25 细胞的增殖。

[0032] 图5A显示根据本发明的方法的实施方案的如流式细胞术所确定的幼稚CD4+T细胞的细胞因子产生的细胞内分析。

[0033] 图5B显示根据本发明的方法的实施方案的如ELISA所确定的幼稚CD4+T细胞的细胞因子产生。

[0034] 图5C显示通过根据本发明的方法的实施方案的如[3H]胸腺嘧啶核苷掺入所确定的生产IL-10的Tr1细胞的抑制功能。

[0035] 图6A显示根据本发明的方法的实施方案的如流式细胞术所确定的记忆CD4+T细胞的细胞因子产生的细胞内分析。

[0036] 图6B显示根据本发明的方法的实施方案的如ELISA所确定的记忆CD4+T细胞的IL-10产生。

[0037] 图7A显示根据本发明的方法的实施方案的如流式细胞术所确定的幼稚CD4+T细胞的细胞因子产生的细胞内分析。

[0038] 图7B显示根据本发明的方法的实施方案的如ELISA所确定的幼稚CD4+T细胞的IL-10产生。

[0039] 图7C显示根据本发明的方法的实施方案计数的存活的T细胞的数目。

[0040] 图8A显示根据本发明的方法的实施方案的如流式细胞术所确定的幼稚CD4+T细胞的细胞因子产生的细胞内分析。

[0041] 图8B显示根据本发明的方法的实施方案的如ELISA所确定的幼稚CD4+T细胞的IL-10产生。

[0042] 图8C显示根据本发明的方法的实施方案的如流式细胞术所确定的记忆CD4+T细胞的细胞因子产生的细胞内分析。

[0043] 图8D显示根据本发明的方法的实施方案的如ELISA所确定的记忆CD4+T细胞的IL-10产生。

[0044] 图8E显示根据本发明的方法的实施方案的如流式细胞术所确定的幼稚CD4+T细胞的细胞因子产生的细胞内分析。

[0045] 图8F显示根据本发明的方法的实施方案的如ELISA所确定的幼稚CD4+T细胞的IL-10产生。

[0046] 图9显示根据本发明的方法的实施方案的如ELISA所确定的调节性T细胞的IL-10产生。

[0047] 图10显示如ELISA所确定的抗L-OX40的抗人类OX40杂交瘤上清液对比L亲本细胞的筛选结果。

[0048] 图11显示根据本发明的方法的实施方案的如流式细胞术所确定的人OX40特异性单克隆抗体的筛选。

[0049] 图12显示使用根据本发明的方法的实施方案的使用表达OX40的SUPM2细胞(SUPM2-OX40)确认抗hOX40单克隆抗体特异性。

[0050] 图13显示根据本发明的方法的实施方案的可抑制产生IL-10的细胞(Tr1)从vit D3(0.1μM)/Dex(50nm)、CD32L/ICOSL和抗CD3/CD28(0.2μg/ml)刺激的CD4+T细胞生成的OX40特异性单克隆抗体。代表性的荧光活化细胞分选(FACS)数据示于A并且所有OX40单克隆抗体处理的产生IL-10的细胞的百分比示于B中。

[0051] 图14显示根据本发明的方法的实施方案的抑制Tr1细胞生成同时刺激CD4+T细胞增殖的hOX40特异性单克隆抗体的结果。

[0052] 图15A、15B和15C详述根据本发明的方法的实施方案的为了其抑制Tr1细胞从CD4+T细胞生成的能力的OX40单克隆抗体的滴定。代表性的FACS数据示于图15A并且用九种OX40单克隆抗体处理后Tr1细胞的百分比示于图15B。

[0053] 图16A、16B和16C显示抑制产生IL-10的Tr1细胞从CD4+T细胞的生成还抑制ICOS+CD4+CD25highCD127-Treg IL-10产生和免疫抑制功能的OX40特异性单克隆抗体。将新鲜分选的ICOS+CD4+CD25highCD127-Tregs(ICOS+Tregs)在CD32L/ICOSL细胞和CD32L/OX40L细胞(图16A)或OX40单克隆抗体或对照抗体(图16B)的存在下用抗CD3(0.2μg/ml)刺激5天。然后将细胞用抗CD3/CD28再刺激24小时并且通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定上清液的IL-10。
图16C是基于单核细胞的增殖测定，显示抗体中的两种阻断ICOS+Treg功能。

[0054] 图17A和17B显示根据本发明的方法的实施方案的抑制Tr1细胞生成并且阻断FOXP3+CD4+CD25高Treg功能的抗hOX40单克隆抗体的鉴定。代表性的流式细胞术分析示于图17A。六种单克隆抗体的数据示于图17B。

[0055] 图18显示根据本发明的方法的实施方案的不抑制Tr1细胞生成但阻断FOXP3+CD4+高CD25 Treg功能的抗hOX40单克隆抗体的鉴定。

[0056] 图19A和19B显示根据本发明的方法的实施方案的阻断淋巴瘤来源的CD4+CD25高Treg功能的抗hOX40激动型抗体。代表性的FACS分析示于图19A中并且所有实验的数据示于图19B中。

[0057] 图20显示抗hOX40单克隆抗体可结合猕猴CD4+T细胞。如所示的，抗hOX40单克隆抗体中的六种可结合猕猴活化的CD4+T细胞并将与猕猴OX40结合并活化OX40信号传导。

[0058] 图21显示实施例I中的HU106-222批次I和II抗体中的每一种由具有约50kD分子量的重链和约25kD分子量的轻链组成。HU106-222批次I和II抗体的纯度显示高于95％。

[0059] 图22显示小鼠106-122、Ch106和Hu106-222(批次II)抗体结合L/OX40细胞的分析(实施例I)。

[0060] 图23描绘Hu106IgG1/κ抗体的表达载体(Expression Vector)的图示结构。从顶部的SalI位点顺时针前进，质粒含有从人巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子和增强子(CMV启动子)开始的重链转录单元以起始抗体重链基因的转录。CMV启动子之后是VH外显子，含有包括CH1、铰链区、CH2和CH3外显子以及其间的内含子的人γ-1重链恒定区的基因组序列，以及CH3外显子之后的多腺苷酸化位点。重链基因序列之后，轻链转录单元从CMV启动子开始，之后是VL外显子和含有人κ链恒定区外显子(CL)以及在其前面的内含子的部分的基因组序列，以及CL外显子之后的多腺苷酸化位点。轻链基因之后是SV40早期启动子(SV40启动子)，大肠杆菌(E.coli)黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)，以及含有SV40多腺苷酸化位点(SV40poly(A)位点)的片段。最后，质粒含有质粒pUC19的一部分，包含细菌的复制起点(pUC ori)和β-内酰胺酶基因(β内酰胺酶)。相关限制性内切酶位点示于图中。

[0061] 图24显示Hu106-222批次I和II抗体之间结合L/OX40细胞的对比(下文实施例I)。

[0062] 图25显示Hu119-122由具有约50kD分子量的重链和具有约25kD分子量的轻链组成。Hu119的纯度显示高于95％(下文实施例II)。

[0063] 图26显示本文描述的Ch119-122和Hu119-122抗体的FACS分析的结果(下文实施例II)。

[0064] 图27显示人源化抗人OX40mAb克隆119-122(Hu119)及其结合FcR的突变抗体(Hu119-AA)增强幼稚CD4+T细胞增殖。与亲本小鼠抗人OX40mAb(小鼠119-122)相比，Hu119-122产生更好的T细胞刺激活性。然而，嵌合的抗人OX40mAb(Ch119，小鼠VH和VL但是人γ-1和κ恒定区)未能增强T细胞增殖。

[0065] 图28显示结合FcR的突变人源化抗人OX40mAb克隆106-222(Hu222AA)和嵌合的抗人OX40mAb克隆106-222(Ch222)增强抗CD3刺激的幼稚CD4+T细胞增殖。这些抗体与亲本小鼠抗人OX40mAb(小鼠222)相比具有相似的刺激活性。然而，完全人源化的抗人OX40Ab，Hu222，与人IgG1相比未增强T细胞增殖。

[0066] 图29A和B显示人源化的和小鼠抗人OX40mAb克隆119-122阻断CD4+Treg抑制性功能。

[0067] 图30提供数据显示使用板结合抗体，抗人OX40抗体增强CD4+和CD8+T细胞增殖。

[0068] 图31显示人源化和小鼠抗人OX40抗体需要交联以便增强T细胞增殖。

[0069] 图32显示使用板结合抗体，抗人OX40抗体阻断CD4+FOXP3+nTreg的活性。

[0070] 图33显示高浓度的小鼠抗人OX40抗体优先杀死FOXP3+Treg。

[0071] 图34显示小鼠抗人OX40mAb直接作用于效应子T细胞或nTreg以阻断Treg的抑制性功能。

[0072] 图35A、35B和35C显示抗hOX40mAb在适应性地用hOX40+CD8+T细胞转移的小鼠中的肿瘤处理结果。抗人OX40mAb在体内促进T细胞扩增和存活。治疗性疫苗接种时间表示于图35A。代表性的体内生物发光图片示于图35B。抗体肿瘤处理的结果示于图35C。

[0073] 图36显示106-222、人源化106-222(Hu106)的氨基酸序列比对，并且人类受体X61012(GenBank登录号)VH序列被显示。氨基酸残基以单字母代码显示。序列上的数字表示根据Kabat et al.(Sequences of Proteins of Immunological Interests,Fifth edition，NIH Publication N0.91-3242,U.S.Department of Health and HumanServices,1991)的定位。本文要求保护的相同序列还提供于序列表中并且位点编号可能不同。在图36中，由Kabat et al.(1991)定义的CDR序列在106-222VH中是下划线的。
X61012VH中CDR残基在图中被省略。在GenBank数据库中搜索与106-222VH框架同源的人VH序列，并将由人X61012cDNA(X61012VH)编码的VH序列选作人源化的接受者。106-222VH的CDR序列首先被转移至X61012VH的相应位点。接下来，在106-222可变区的三维模型显示与CDR明显接触的框架位点上，将小鼠106-222VH的氨基酸残基取代为相应的人残基。这些取代在位点46和94进行(Hu106VH中下划线的)。此外，发现在相应的V区亚组中为非典型的人框架残基被最典型的残基取代以减少潜在的免疫原性。这一取代在位点105进行(Hu106VH中双下划线的)。

[0074] 图37显示106-222、人源化106-222(Hu106)的氨基酸序列比对，并且人接受体AJ388641(GenBank登录号)VL序列被显示。氨基酸残基以单字母代码显示。序列上的数字表示根据Kabat et al.(1991)的定位。本文要求保护的相同序列还提供于序列表中尽管位点编号可能不同。由Kabat et al.(I)定义的CDR序列在106-222VH中是下划线的。AJ388641VL中的CDR残基在图中被省略。在GenBank数据库中搜索与106-222VL框架同源的人VL序列，并将由人AJ388641cDNA(AJ388641VL)编码的VL序列选作人源化的接受体。106-222VL的CDR序列被转移至AJ388641VL的相应位点。在人源化形式中不进行框架取代。

[0075] 图38显示两侧为SpeI和HindIII位点(下划线的)的Hu106VH基因的核苷酸序列与推导出的氨基酸序列一起被显示。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列为斜体。成熟VH的N端氨基酸残基(Q)是双下划线的。根据Kabat etal.(1991)定义的CDR序列是下划线的。本文要求保护的相同序列还提供于序列表中并且位点编号在序列表中可能不同。内含子序列为斜体。用SpeI和HindIII消化的Hu106VH基因片段被克隆至图23所示的表达载体中的相应位点之间。

[0076] 图39显示两侧为NheI和EcoRI位点(下划线的)的Hu106-222VL基因的核苷酸序列与推导出的氨基酸序列一起被显示。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列为斜体。成熟VL的N端氨基酸残基(D)是双下划线的。根据Kabat etal.(1991)定义的CDR序列是下划线的。内含子序列为斜体。用NheI和EcoRI消化的Hu106VL基因片段被克隆至图23所示的表达载体中的相应位点之间。本文要求保护的相同序列还提供于序列表中尽管位点编号在序列表中可能不同。

[0077] 图40显示119-122、人源化119-122(Hu119)的氨基酸序列比对，并且人接受体Z14189(GenBank登录号)VH序列被显示。氨基酸残基以单字母代码显示。序列上的数字表示根据Kabat et al.(Sequences of Proteins of Immunological Interests,Fifth edition,NIH Publication N0.91-3242,U.S.Department of Health and Human Services,1991)的定位。由Kabat et al.(1991)定义的CDR序列在119-122VH中是下划线的。Z14189VH中的CDR残基在图中被省略。在GenBank数据库中搜索与119-122VH框架同源的人VH序列，并将由人Z14189cDNA(Z14189VH)编码的VH序列选作人源化的接受体。119-122VH的CDR序列首先被转移至Z14189VH的相应位点。接下来，在119-122可变区的三维模型显示与CDR明显接触的框架位点上，将小鼠119-122VH的氨基酸残基取代为相应的人残基。这些取代在如图上所示的位点26、27、28、30和47进行(Hu119VH序列中下划线的)。本文要求保护的相同序列还提供于序列表中尽管位点编号在序列表中可能不同。

[0078] 图41显示119-122、人源化119-122(Hu119)的氨基酸序列的比对，并且人接受体M29469(GenBank登录号)VL序列被显示。氨基酸残基以单字母代码显示。序列上的数字表示根据Kabat et al.(1991)的定位。由Kabat et al.(I)定义的CDR序列在119-122VL中是下划线的。M29469VL中的CDR残基在序列中被省略。在GenBank数据库中搜索与119-122VL框架同源的人VL序列，并将由人M29469cDNA(M29469VL)编码的VL序列选作人源化接受体。119-122VL的CDR序列被转移至M29469VL的相应位点。在人源化形式中不需要框架取代。本文要求保护的相同序列还提供于序列表中尽管位点编号在序列表中可能不同。

[0079] 图42显示两侧为SpeI和HindIII位点(下划线的)的Hu119VH基因的核苷酸序列与推导出的氨基酸序列一起被显示。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列为斜体。成熟VH的N端氨基酸残基(E)是双下划线的。根据Kabat etal.(1991)定义的CDR序列是下划线的。内含子序列为斜体。用SpeI和HindIII消化的Hu119VH基因片段被克隆至图23所示的表达载体中的相应位点之间。本文要求保护的相同序列还提供于序列表中尽管位点编号在序列表中可能不同。

[0080] 图43显示两侧为NheI和EcoRI位点(下划线的)的Hu119VL基因的核苷酸序列与推导出的氨基酸序列一起被显示。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列为斜体。成熟VL的N端氨基酸残基(E)是双下划线的。根据Kabat etal.(1991)定义的CDR序列是下划线的。内含子序列为斜体。用NheI和EcoRI消化的Hu119VL基因片段被克隆至图23所示的表达载体中的相应位点之间。本文要求保护的相同序列还提供于序列表中尽管位点编号在序列表中可能不同。

[0081] 图44显示小鼠119-43-1VH cDNA的核苷酸序列连同推导出的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列为斜体。成熟VH的N端氨基酸残基(E)是双下划线的。根据Kabat et al.(Sequences of Proteins of Immunological Interests,Fifth edition,NIH Publication No.91-3242,U.S.Department of Health and Human 
Services,1991)定义的CDR序列是下划线的。

[0082] 图45显示小鼠119-43-1VL cDNA的核苷酸序列连同推导出的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列为斜体。成熟VL的N端氨基酸残基(D)是双下划线的。根据Kabat et al.(1991)定义的CDR序列是下划线的。

[0083] 图46显示两侧为SpeI和HindIII位点(下划线的)的设计的119-43-1VH基因的核苷酸序列连同推导出的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列为斜体。成熟VH的N端氨基酸残基(E)是双下划线的。根据Kabat et al.(1991)定义的CDR序列是下划线的。内含子序列为斜体。

[0084] 图47显示两侧为NheI和EcoRI位点(下划线的)的设计的119-43-1VL基因的核苷酸序列连同推导出的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列为斜体。成熟VL的N端氨基酸残基(D)是双下划线的。根据Kabat et al.(1991)定义的CDR序列是下划线的。内含子序列为斜体。

[0085] 图48显示pCh119-43-1(在图中称为表达载体)的图示结构。从顶部的SalI位点顺时针前进，质粒含有从人巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子和增强子(CMV启动子)开始的重链转录单元以起始抗体重链基因的转录。CMV启动子之后是VH外显子，含有包括CH1、铰链区、CH2和CH3外显子以及其间的内含子的人γ-1重链恒定区的基因组序列，以及CH3外显子之后的多腺苷酸化位点。重链基因序列之后，轻链转录单元从CMV启动子开始，之后是VL外显子和含有人κ链恒定区外显子(CL)以及在其前面的内含子的部分的基因组序列，以及CL外显子之后的多腺苷酸化位点。轻链基因之后是SV40早期启动子(SV40启动子)，大肠杆菌(E.coli)黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)，以及含有SV40多腺苷酸化位点(SV40poly(A)位点)的片段。最后，质粒含有质粒pUC19的一部分，包含细菌的复制起点(pUC ori)和β-内酰胺酶基因(β内酰胺酶)。

[0086] 图49显示用于Ch119-43-1重链和轻链cDNA的PCR扩增和测序的寡核苷酸序列。

[0087] 图50显示pCh119-43-1中的γ-1重链的编码区的核苷酸序列，以单字母代码显示。终止密码子用“.”表示。

[0088] 图51显示pCh119-43-1中的κ轻链的编码区的核苷酸序列连同推导出的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母代码显示。终止密码子用“.”表示。

[0089] 图52显示Ch119-43-1的SDS-PAGE分析。在还原条件下将5μg的Ch119-43-1在4-20％SDS-PAGE凝胶上电泳(泳道1)。Invitrogen的SeeBluePlus2Prestained Standard(Cat#LC5925)被用作分子量标准(泳道2)。

[0090] 图53显示Ch119-43-1与L/OX40细胞结合的FACS分析。在以16μg/ml起始并4倍系列稀释的多个浓度测试Ch119-43-1与L/OX40细胞的结合。EC50值使用GraphPad Prism(GraphPad Software,San Diego,CA)计算。

具体实施方式

[0091] 术语“抗体”由四个多肽链，通过二硫键内部连接的两个重链(H)和两个轻链(L)，组成的免疫球蛋白分子。每个重链由重链可变区(本文简称为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每个轻链由轻链可变区(本文简称为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可进一步细分为超变区(称为互补决定区(CDR))，其间散布更保守的区(称为构架区(FR))。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端至羧基末端按如下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

[0092] 术语抗体的“抗原结合部分”(或“抗体部分”)包括保持特异性结合抗原(例如，hOX40)能力的抗体片段。已显示，抗体的抗原结合功能可由全长抗体片段完成。包含在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的一价片段；(ii)F(ab’)2片段，包括通过铰链区的二硫键连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂VL和VH结构城组成的Fv片段；(V)dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature341:544-546)，其由VH结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域，VL和VH，由独立的基因编码，但是它们可使用重组方法通过使它们能够被制成其中VL和VH区配对形成一价分子的单一蛋白链(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird etal.(1988)Science242:423-426；和Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879-5883)的合成连接子连接在一起。这种单链抗体也意图包括在术语抗体的“抗原结合部分”之内。还包括其他形式的单链抗体例如双体。双体是二价的、双特异性抗体，其中VH和VL结构域表达在单一多肽链上，但是使用太短以至于不允许同一链上的所述两个结构域之间配对的连接子，从而迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对，而产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger,P.，et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448；Poljak,R.J.，et al.(1994)Structure2:1121-
1123)。进而，抗体或其抗原结合部分可以成为通过所述抗体或抗体部分与一个或多个其他蛋白或肽的共价或非共价结合形成的更大免疫粘附分子的一部分。这样的免疫粘附分子的实例包括使用链霉亲和素核心区制成四聚scFv分子(Kipriyanov,S.M.,et al.(1995)Human Antibodies and Hybridomas6:93-101)以及使用半胱氨酸残基、标记肽和C端多组氨酸标签制成二价且生物素化的scFv分子(Kipriyanov，S.M.,et al.(1994)
Mol.1mmunol.31:1047-1058)。抗体部分，比如Fab和F(ab’)2片段，可使用常规技术例如分别用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整抗体而由完整抗体制备。而且如本文所述，可使用标准重组DNA技术获得抗体、抗体部分和免疫粘附分子。优选的抗原结合部分是完整结构域或成对的完整结构域。

[0093] OX40/OX40-配体(OX40受体)/(OX40L)是对于T细胞增殖、存活、细胞因子产生和记+忆细胞生成来说很关键的共刺激分子对。在体外实验中早就证实，经由CD4 T细胞上的OX40的信号传导导致TH2发育但不导致TH1发育。这些结果得到体内研究的支持，其显示阻断OX40/OX40L相互作用防止TH2介导的变态免疫响应的诱导和维持。然而，阻断OX40/OX40L相互作用改善或防止TH1介导的疾病。而且，施用溶解的OX40L或将OX40L转基因至肿瘤中显示显著增强小鼠中的抗肿瘤免疫力。最近的研究也表明，OX40/OX40L可在促进CD8T细胞介导的免疫响应中起作用。如本文所讨论的，OX40信号传导阻断CD4+CD25+天然存在的调节性T细胞的抑制性功能并且OX40/OX40L在外周免疫性对比耐受性的整体调控中起关键作用。

[0094] 术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”在本文中可互换使用。本领域公认的这些术语是指将比抗体或其抗原结合部分的重链可变区和轻链可变区的其他氨基酸残基更可变(即超变)的氨基酸残基编号的系统(Kabat et al.(1971)Ann.NY Acad,Sci.190:382-391和Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。

[0095] 术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、创建或分离的人抗体,比如使用转染入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体、从重组的组合的人抗体库分离的抗体、从人免疫球蛋白基因转基因动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如Taylor,L.D.等(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)或者通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接为其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、创建或分离的抗体。这样的重组人抗体具有人种系免疫球蛋白序列来源的可变区和恒定区(参见Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublicationN0.91-3242)。

[0096] “分离的抗体”包括基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合hOX40的分离抗体基本不含特异性结合非hOX40抗原的抗体)。特异性结合hOX40的分离抗体可结合其他物种的OX40分子。此外，分离抗体可基本不含其他细胞材料和/或化学物质。

[0097] 术语“活性”包括各种活性，比如抗体对抗原的结合特异性/亲和性，例如结合OX40抗原的抗人OX40抗体和/或抗体的活化效价，例如其与hOX40受体的结合活化hOX40的生物活性的抗OX40抗体或人L/OX40细胞测定中结合的受体的活化。

[0098] 本文使用的术语“Koff”意图指抗体从抗体/抗原复合物解离的解离速率常数。本文使用的术语“Kd”意图指特定抗体抗原相互作用的解离常数。

[0099] 术语“表面等离子体共振”包括允许例如使用BIAcore系统(Pharmacia BiosensorAB,Uppsala,Sweden and Piscataway,NJ)通过检测生物传感器基质中的蛋白浓度改变而分析实时生物特异性相互作用的光学现象。关于其进一步的描述，参见实施例5和Jonsson,U.,et al.(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26；Jonsson,U.,et al.(1991)
Biotechniques11:620-627；Johnsson,B.,et al.(1995)J.Mol.Recognit.8:125-131；和Johnnson,B.,et al.(1991)Anal.Biochem.198:268-277。

[0100] 术语“载体”包括能够转运与其连接的另一个核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指的是另外的DNA片段可连接入其中的环形双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA节段可连接入病毒基因组中。某些载体能够在其被引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞时整合入宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。这样的载体在本文中称为“重组表达载体”(或者简称为“表达载体”)。一般来说，重组DNA技术中表达载体的利用通常为质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可交互使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明意图包括这些其他形式的表达载体，比如具有同等功能的病毒载体(例如复制缺陷型反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。

[0101] 术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)包括重组表达载体已经引入其中的细胞。应当理解的是，这些术语意图不仅指特定对象的细胞，而且也指这种细胞的子代细胞。因为突变或环境的影响而在随后的传代中可能发生某些变动，所以这样的子代细胞可能事实上与亲代细胞不完全相同，但是仍然包括在本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。

[0102] 术语“单克隆抗体”(单克隆抗体)是指从基本上同源的抗体的群获得的抗体或类似抗体的群并且不被解释为需要通过任何特殊的方法产生抗体，包括但不限于，单克隆抗体可通过由Kohler和Milstein(Nature,256:495-497,1975)最初描述的杂交瘤方法或通过重组DNA方法制得。

[0103] 术语“嵌合抗体”(或“嵌合的免疫球蛋白”)是指包含与来源于特定物种或属于特定抗体类别或子类别的抗体中的相应序列相同或同源的重链和/或轻链而所述链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或子类别的抗体中的相应片段相同或同源的分子以及这些抗体的片段，条件是它们表现出所期望的生物学活性(Cabilly et al.(1984),infra；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851)。

[0104] 术语“人源化抗体”是指包含来自非人(例如，小鼠)抗体以及人抗体的序列的抗体形式。人源化抗体可包括不会显著改变其结合和/或生物学活性的保守氨基酸取代或来自相同或不同物种的非天然残基。这些抗体是包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。对于绝大部分来说，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自所述受体的互补决定区(CDR)的残基被来自具有所期望的性质的非人类物种比如小鼠、大鼠、骆驼、牛、山羊或兔的CDR的残基(供体抗体)代替。而且，人源化抗体可包含在受体抗体或引进的CDR中都不存在的残基或框架序列。可进行这些修饰以进一步将抗体性能精细化和最大化。因此，通常人源化抗体将包含至少一个以及在一个方面为两个的可变结构域的全部或基本上全部，其中超变环的全部或基本上全部相应于非人免疫球蛋白的那些而FR区的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fe)的至少一部分，或者人免疫球蛋白的一部分(参见，例如，Cabilly et al.,U.S.Pat.No.4,816,567；Cabilly et al.,European Patent No.0,125,023B1；Boss et al.,
U.S.Pat.No.4,816,397；Boss et al.,European Patent No.0,120,694B1；Neuberger,M.S.et al.,WO86/01533；Neuberger,M.S.et al.,European Patent No.0,194,276B1；
Winter,U.S.Pat.No.5,225,539；Winter,European Patent No.0,239,400B1；Padlan,E.A.et al.,European Patent Application No.0,519,596A1；Queen et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol86:10029-10033)。

[0105] 本文所描述和要求保护的抗体中的每一个可以是指，单数或复数形式，如:“抗OX40抗体；”“抗hOX40抗体；”“抗hOX40单克隆抗体；”“抗人OX40抗体；”“抗人OX40mAb；”“抗hOX40mAb”“hOX40特异性单克隆抗体；”“抗OX40L抗体；”“抗hOX40L抗体；”“抗人OX40L抗体；”“人OX40特异性抗体；”“人OX40特异性单克隆抗体；”“人OX40特异性抗体；”“抗人OX40特异性抗体；”“抗人OX40特异性单克隆抗体；”“h-OX40特异性抗体；”“h-OX40特异性单克隆抗体；”“hOX40激动型抗体；”“hOX40拮抗剂“和/或其其他相似变体。

[0106] 如通过引用并入本文的、题目为“Methods toTreat Disease States by Influencing the singalling of OX—40-Receptors and HighThroughput Screening Methods and Identifying Substrates Thereof”的美国专利申请第11/659,266号中所公开的，其发现OX40L的功能是负调节由免疫抑制剂Dex和vit D3、IC0SL或不成熟的DC所诱导的Tr1细胞的生成。这一发现证明OX40L增强免疫力并且打破免疫耐受性的一般机制。

[0107] 使用免疫组织学分析(图1)、细胞内染色(图2)和细胞分选(图3)，我们已经显示产生ICOS+IL-10和产生ICOS-TGF-β的Treg浸润人FL组织。这些FL来源的FOXP3+Treg可强烈抑制响应于CD40-配体预活化的自体淋巴瘤细胞的FOXP3–CD4+CD25–肿瘤浸润T细胞的增殖(图4)。ICOS+Treg的抑制活性可被中和抗IL-10抗体部分阻断，证实FL中产生ICOS+IL-10的Treg的作用(图4)。在图2的实验中，肿瘤细胞和PBMC从治疗前初次诊断的7个患者获得。PBMC也从7个健康供体获得用于比较。调节性T细胞占全部CD4+T细胞的百分比通过CD4+CD25+CD127lowFOXP3+Treg的流式细胞术分析来确定。图2A提供Treg的代表性FACS分析，而图2B显示所有供体的Treg的百分比。

[0108] 还发现OX40L抑制Dex和vit D3诱导的Tr1细胞从CD4+T细胞的生成。已知免疫抑制性药物Dex和vit D3的组合一致地诱导幼稚CD4+T细胞分化为Tr1细胞。为了调查OX40L是否可抑制Tr1细胞的生成和功能，将幼稚CD4+T细胞与抗CD3以及抗CD28单克隆抗体在OX40L转染的L细胞的存在或不存在下在四种不同培养条件下培养7天，所述培养条件包括：(1)Tr1(Dex和vit D3)；(2)TH1(IL-12)；(3)TH2(IL-4)；或(4)中性的(仅培养基)(图5A)。通过细胞内细胞因子染色和ELISA分析经由已预处理的T细胞的IL-10产生。

[0109] 在图5A的实验中，通过流式细胞术进行幼稚CD4+T细胞的细胞因子产生的细胞内分析。将幼稚CD4+T细胞与抗CD3和抗CD28单克隆抗体在IL-2的存在下在亲本L细胞或OX40L-L细胞上与所指示的重组细胞因子或试剂一起培养7天。在每个点印迹概况中指示各个产生细胞因子的T细胞的百分比。所述结果显示OX40L抑制不同极化信号诱导的Tr1细胞从幼稚CD4+T细胞的生成。如图5A中所示，在中性或TH1或TH2条件下培养的幼稚CD4+T细胞生成2％至4％的Tr1细胞。在使用Dex加上vit D3的培养中生成超过15％的Tr1细胞。在所有培养条件下，加入OX40L完全阻断Tr1细胞的生成，而促进产生TNF-α的T细胞的生成。

[0110] 这些数据通过ELISA数据(图5B)证实。在图5B的实验中，通过ELISA测量用抗CD3和+ +抗CD28单克隆抗体再刺激24h之后上清液中经由幼稚CD4细胞的细胞因子生产。将幼稚CD4T细胞与抗CD3和抗CD28单克隆抗体在IL-2的存在下在亲本L细胞或OX40L-L细胞上与所指示的重组细胞因子或试剂一起培养7天。将数据显示为平均值±四个独立实验的平均值的标准误差(SEM)。结果显示OX40L抑制不同极化信号诱导的Tr1细胞从幼稚CD4+T细胞的生成。

[0111] 用Tr1条件(Dex加上vit D3)预处理的幼稚CD4+T细胞是无变应性的并且具有抑制响应于抗CD3和抗CD28单克隆抗体的幼稚CD4+T细胞的增殖的能力(图5C)。在图5C的实验中，通过[3H]胸腺嘧啶核苷掺入测量T细胞中的抑制性功能。所指示的T细胞群的混合物通过抗CD3和抗CD28单克隆抗体再刺激。误差条代表三个孔的SEM。发现，用相同的Tr1条件预处理的幼稚CD4+T细胞在OX40L存在下强烈增殖并且未能抑制响应于抗CD3和抗CD28单克隆抗体的幼稚CD4+T细胞的增殖。数据表明，OX40L阻断功能性Tr1细胞从Dex和vit D3诱导的幼稚CD4+T细胞的生成。

[0112] 发现，Tr1细胞可从记忆CD4+CD45RA-CD45RO+T细胞生成并且OX40L可抑制Tr1细胞从记忆CD4+T细胞的生成。将记忆CD4+CD45RA-CD45RO+T细胞与抗CD3加上抗CD28单克隆抗体在转染OX40L的L细胞Tr1条件(Dex加上vit D3)的存在或不存在下培养7天。在图6A的实验中，通过流式细胞术进行经由CD4+记忆T细胞的细胞因子产生的细胞内分析。将记忆CD4+CD45RO+CD25-记忆T细胞与抗CD3、抗CD28单克隆抗体和IL-2一起在亲本L细胞或OX40L-L细胞上在Dex加上vit D3的存在或不存在下培养7天。在每个点印迹概况中指示各个产生细胞因子的T细胞的百分比。所述结果显示OX40L抑制Dex加上vitD3的条件下Tr1细胞从记忆CD4+T细胞的生成。图6A显示大量的Tr1细胞(>20％)在具有Dex加上vit D3的培养中从CD4+记忆T细胞生成。OX40L的加入完全阻断Tr1细胞的生成并且促进产生TNF-α的细胞从记忆CD4+T细胞的生成。

[0113] Dex加上vit D3的促进IL-10从记忆CD4+T细胞产生的能力，以及这一能力可被OX40L抑制通过IL-10ELISA分析证实(图6B)。在图6B的实验中，在用抗CD3和抗CD28单克隆抗体再刺激24h之后通过ELISA测量上清液中经由记忆CD4+T细胞的IL-10产生。将数据显示为平均值±四个独立实验的SEM。结果显示，OX40L在具有Dex加上vit D3的条件下抑制Tr1细胞从记忆CD4+T细胞的生成。

[0114] 还发现，OX40L抑制Tr1细胞的生成而其他的TNF家族成员(GITRL和4-1BBL)并没有。在TNF超家族中，OX40L、糖皮质激素诱导的TNF受体-配体(GITRL)和4-1BB-配体(4-1BBL)具有对T细胞的共刺激功能。为了调查OX40L在Tr1细胞的抑制中是否是唯一的，将幼稚CD4+T细胞用抗CD3加上抗CD28单克隆抗体以及Dex加上vit D3与亲本L细胞或用OX40L、GITRL或4-1BBL转染的L细胞一起培养7天。尽管OX40L、GITRL和4-1BBL都促进产生TNF-α的细胞的生成，但仅OX40L抑制Tr1细胞的生成(图7A和7B)。

[0115] 在图7A的实验中，通过流式细胞术进行了幼稚CD4+T细胞的细胞因子产生的细胞内分析。将幼稚CD4+T细胞与抗CD3、抗CD28单克隆抗体和IL-2一起在亲本L细胞、OX40L-L细胞、GITRL-L细胞或4-1BBL-L细胞上在Dex加上vit D3存在下培养7天。在每个点印迹概况中指示各个产生细胞因子的T细胞的百分比。所述结果显示，OX40L抑制Tr1细胞生成而GITRL和4-1BBL都不抑制。

[0116] 在图7B的实验中，在用抗CD3和抗CD28单克隆抗体再刺激24h之后通过ELISA测量+上清液中幼稚CD4细胞的IL-10。将数据显示为平均值±四个独立实验的SEM。所述结果显示，OX40L抑制Tr1细胞生成而GITRL和4-1BBL都不抑制。

[0117] OX40L、GITRL和4-1BBL都促进整个T细胞数目的扩展(图7C)。在图7C的实验中，计数存活的T细胞的数目。将数据显示为平均值±四个独立实验的SEM。

[0118] 如本领域技术人员所理解的，图7A、7B和7C的结果显示OX40L抑制Tr1细胞生成而GITRL和4-1BBL都不抑制。这些数据表明在已知共刺激T细胞的TNF超家族的三个成员中，OX40L在抑制Tr1细胞生成上具有新的并且独特的功能。

[0119] 还发现，OX40L抑制由ICOSL或不成熟DC诱导的Tr1细胞生成。ICOS和CD28代表T细胞上表达的CD28家族的两个正向共刺激受体。通过激动型抗体或ICOSL的经由ICOS的信号传导已经显示促进CD4+T细胞产生IL-10。为了调查OX40L是否可抑制ICOS诱导经由CD4+T细胞的IL-10生产的能力，将幼稚和记忆CD4+T细胞与抗CD3一起在ICOSL转染的L细胞或ICOSL转染的L细胞的存在下在OX40L的存在下培养7天。

[0120] 在图8A的实验中，通过流式细胞术进行了幼稚CD4+T细胞的细胞因子产生的细胞内分析。将幼稚CD4+T细胞在用抗CD3单克隆抗体预包被的亲本L细胞、ICOSL-L细胞和L细胞的混合物或ICOSL-L细胞和OX40L-L细胞的混合物上培养7天。在每个点印迹概况中指示各个产生细胞因子的T细胞的百分比。所述结果显示OX40L抑制ICOSL诱导的Tr1细胞从幼稚CD4+T细胞的生成。

[0121] 在图8B的实验中，在用抗CD3和抗CD28单克隆抗体再刺激24h之后通过ELISA测量上清液中幼稚CD4+细胞的IL-10产生。将幼稚CD4+T细胞在用抗CD3单克隆抗体预包被的亲本L细胞、ICOSL-L细胞和L细胞的混合物或ICOSL-L细胞和OX40L-L细胞的混合物上培养7天。将数据显示为平均值±三个独立实验的SEM。所述结果显示OX40L抑制ICOSL诱导的Tr1细胞从幼稚CD4+T细胞的生成。

[0122] 在图8C的实验中，通过流式细胞术进行了记忆CD4+T细胞的细胞因子产生的细胞内分析。将记忆CD4+T细胞在用抗CD3单克隆抗体预包被的亲本L细胞、ICOSL-L细胞和L细胞的混合物或ICOSL-L细胞和OX40L-L细胞的混合物上培养7天。在每个点印迹概况中指示各个产生细胞因子的T细胞的百分比。所述结果显示OX40L抑制ICOSL诱导的Tr1细胞从记忆CD4+T细胞的生成。

[0123] 在图8D的实验中，在用抗CD3和抗CD28单克隆抗体再刺激24h之后通过ELISA测量上清液中记忆CD4+T细胞的IL-1O产生。将记忆CD4+T细胞在用抗CD3单克隆抗体预包被的亲本L细胞、ICOSL-L细胞和L细胞的混合物或ICOSL-L细胞和OX40L-L细胞的混合物上培养7天。将数据显示为平均值±三个独立实验的SEM。所述结果显示OX40L抑制ICOSL诱导的Tr1细胞从记忆CD4+T细胞的生成。

[0124] 图8A、8B、8C和8D的实验结果显示ICOSL显著促进Tr1细胞从幼稚和记忆CD4+T细胞的生成。OX40L的加入完全抑制Tr1细胞从幼稚和记忆CD4+T细胞的生成而强烈促进产生TNF-α的细胞的生成。

[0125] 已知，不成熟的DC或用IFN-α或IL-10处理的DC可诱导幼稚CD4+Τ细胞分化为Tr1细胞。已经调查OX40L是否可以抑制DC诱导的Tr1细胞的生成。如图8E中所示，不成熟的DC或用IFN-α或IL-10处理的DC都诱导超过10％的Tr1细胞从幼稚CD4+Τ细胞的的生成。相比之下，由CD40L活化的DC诱导强烈的TH1响应，伴随着约3％Tr1细胞的生成。在DC-T细胞培养物中加入重组的OX40L完全抑制由不成熟的DC或用IFN-α或IL-10处理的DC诱导的Tr1细胞的生成。此外，OX40L还抑制由CD40L活化的成熟DC诱导的剩余数目的Tr1细胞的生成。在图8E的实验中，通过流式细胞术进行了经由CD4+幼稚T细胞的细胞因子产生的细胞内分析。将幼稚CD4+T细胞在溶解重组OX40L的存在或不存在下与不成熟的DC或用IFN-α、IL-10和CD40L培养的DC一起培养7天。在每个点印迹概况中指示各个产生细胞因子的T细胞的百分比。所述结果显示OX40L抑制DC诱导的Tr1细胞从CD4+Τ细胞的生成。

[0126] 通过ELISA数据(图8F)证实OX40L抑制DC诱导的Tr1细胞生成的能力。在图8F的实验中，在用抗CD3和抗CD28单克隆抗体再刺激24h之后通过ELISA测量上清液中经由幼稚CD4+ +细胞的IL-10生产。将幼稚CD4 T细胞在溶解重组OX40L存在或不存在下与不成熟的DC或用IFN-α、IL-10和CD40L培养的DC一起培养7天。将数据显示为平均值±三个独立实验的SEM。
所述结果显示OX40L抑制DC诱导的Tr1细胞从CD4+Τ细胞的生成。因此，这些数据证明OX40L可抑制ICOSL和DC提供的更多生理信号诱导的Tr1细胞的生成。

[0127] 之前已经表明，调节性T细胞在B细胞非霍奇金淋巴瘤的区域内高度表达并且该B细胞参与将调节性T细胞募集至淋巴瘤的区域。调查了影响OX40受体的信号传导(例如通过OX40L)是否能够提供抗B细胞淋巴瘤的治疗。来自B细胞淋巴瘤患者的冷藏保存的样品被用于评估OX40L关闭Tr1细胞的能力。所用的样品是从未受到任何治疗的脾脏样品获得的滤泡性淋巴瘤。将细胞解冻，400×106冷冻细胞产生127×106活细胞和33.9×106死细胞(79％的存活率)。通过FACS染色鉴定足够数目的CD25+细胞。在图9的实验中，通过ELISA确定产生ICOS+IL-10的Treg的IL-10分泌。将Treg细胞在两种不同条件下培养。在条件1中，将CD25+/ICOS+细胞与抗CD3一起在IL-2(900μl/ml)的存在下在亲本L细胞或OX40L-L细胞上与抗ICOS抗体一起培养3-6天。在条件2中，将CD25+/ICOS+细胞与抗CD3在IL-2(900μl/ml)的存在下在ICOS-L-L细胞或OX40L-L和ICOS-L-L细胞的混合物上培养3-6天。通过ELISA测量上清液中的细胞因子产生。所述结果显示OX40L显著抑制Treg细胞的IL-10产生。

[0128] 如本领域技术人员应当理解的，OX40L具有抑制由免疫抑制性药物Dex加上vitD3、ICOSL，或DC诱导的Tr1细胞的生成和功能的能力的发现使得OX40L在不同形式的CD4或CD8介导的免疫响应中促进免疫力并打破耐受性的新机制更受瞩目。OX40L在IL-12诱导的TH1或IL-4诱导的TH2响应期间抑制Tr1细胞生成的能力表明OX40L可控制TH1或TH2介导的免疫响应的等级。而且OX40L抑制Tr1细胞生成的能力似乎是OX40L的独有特性，因为其他两个TNF家族成员GITRL和4-1BBL不具有这一功能特性。而且，OX40L抑制经由Treg细胞的IL-10产生的能力将OX40L鉴定为对B细胞淋巴瘤和其他癌症的有力治疗。

[0129] 已经鉴定促进Tr1细胞生成的许多分子，包括IL-10、IFN-α、ICOSL和免疫抑制化合物比如Dex加上vit D3。OX40L代表不仅从幼稚CD4+Τ细胞还有从记忆CD4+Τ细胞和调节性T细胞生成Tr1细胞的有力抑制剂。OX40/OX40L的这一新特性可解释显示OX40信号传导允许无变应性的自体反应T细胞获得效应子细胞功能的最近的报道。靶向OX40/OX40L因此提供了用于人类变应性和自身免疫性疾病的治疗并且提供了用于人传染性疾病和癌症的治疗的开发，所述癌症包括但不限于黑色素瘤，脑癌，骨癌，白血病，淋巴瘤，上皮细胞来源的瘤样病变(上皮癌)比如基底细胞癌，腺癌，胃肠道癌比如唇癌、口腔癌、食道癌、小肠癌和胃癌，结肠癌，肝癌，膀胱癌，胰腺癌，卵巢癌，子宫颈癌，肺癌，乳腺癌和皮肤癌比如鳞状细胞和基底细胞癌，前列腺癌，肾细胞癌和其它已知的癌症。

[0130] 可通过本文描述的抗体和方法预防或治疗的病症或病况包括癌症的预防或治疗，所述癌症比如皮肤性T-细胞白血病、头部和颈部肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、高级别胶质瘤、脑转移瘤、黑色素瘤、皮肤癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、白血病、骨髓增生异常综合征(前白血病病况)和多发性骨髓瘤。通常，任何癌症的转移都可用本文描述的化合物和方法预防或治疗。抗体也可被用于预防或治疗增生性血管生成病况，包括毛细血管扩张症、静脉血管瘤、成血管细胞瘤。其他病症、疾病或病况包括病毒疾病，其中的一些传统上被认为是“不可治疗的”。抗体例如也可被用于将单个病原体的株分类。研究人员可使用本文描述的抗体鉴定并追踪有机体中特定的细胞或分子。

[0131] 通常，术语“癌症”和“癌的”是指或描述通常由不受调控的细胞生长所表征的哺乳动物中的生理学病况。更具体地，可使用本文描述的抗体中的任一种或多种或其变体治疗或预防的癌症包括但不限于癌(carcinoma)，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤和白血病。这些癌症的更具体的实例包括但不限于鳞状细胞癌，肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)，腹膜的癌，肝细胞癌，胃(gastric)癌或胃(stomach)癌(包括胃肠道癌和胃肠道间质癌)，胰腺癌，胶质母细胞瘤，子宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝瘤，乳腺癌，结肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾癌或肾脏癌，肝癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌(hepatic carcinoma)和各种类型的头部和颈部癌，黑色素瘤，浅表扩散性黑色素瘤，恶性雀斑样痣黑色素瘤，肢端雀斑样痣黑色素瘤，结节性黑色素瘤以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中等级/滤泡性NHL；中等级弥漫性NHL；高等级免疫母细胞性NHL；高等级淋巴母细胞性NHL；高等级小无裂细胞NHL；大肿块NHL(bulky disease NHL)；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和Waldenstrom巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性成淋巴细胞白血病(ALL)；多毛细胞白血病；慢性粒细胞白血病；和移植后淋巴组织增生症(PTLD)以及与瘢痣病相关的异常血管增生，水肿(例如与脑肿瘤相关的)和梅格斯综合征。

[0132] 本文还提供治疗或预防免疫病症的方法。这些方法包括向需要这种治疗的受试者施用有效量的所述抗体。在一些实施方案中，所述免疫病症是免疫病症或自身免疫病症。所述病症是哮喘，特应性皮炎，过敏性鼻炎，炎性肠病，多发性硬化症，GVHD和/或系统性红斑狼疮。在一些实施方案中，所述病症是与病毒、细菌或其他传染源有关的疾病。

[0133] 而且，本文描述的抗体和方法可被用于预防或治疗炎性疾病和病况比如骨关节炎、类风湿关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎和自身免疫性疾病比如狼疮和混合自身免疫性疾病。例如，本文描述的抗体可被用于治疗各种自身免疫性疾病和炎性疾病，其包括向需要其的受试者施用治疗上有效量的所述抗体的步骤，其中所述自身免疫性疾病和炎性疾病是下列疾病中的任何一种或多种：胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、糖尿病、多发性硬化、实验性自身免疫性脑脊髓炎、急性播散性脑脊髓炎、关节炎、类风湿关节炎、实验性自身免疫性关节炎、重症肌无力症、甲状腺炎、桥本病、原发性粘液水肿、甲状腺功能亢进、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、艾迪生氏病(Addison's disease)、过早绝经、男性不育症、青少年糖尿病、古德帕斯彻综合征(Goodpasture’s syndrome)、寻常天疱疮、类天疱疮、交感性眼炎、晶状体源性葡萄膜炎、自身免疫性溶血性贫血、特发性白细胞减少、原发性胆汁性肝硬化、慢性活动性肝炎Hbs-ve、隐源性肝硬化、溃疡性结肠炎、肖格伦综合征(Sjogren’s syndrome)、硬皮病、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)、多/皮肌炎、盘状LE、系统性红斑狼疮、克隆氏病(Chron’s disease)、牛皮癣、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、自身免疫性肝炎、腹腔疾病、格雷夫斯病、格林-巴利综合征(GBS)、特发性血小板减少性紫癜、眼球阵挛肌阵挛综合征(OMS)、视神经炎、ORd’s甲状腺炎、天疱疮、多关节炎、原发性胆汁性肝硬化、赖特综合征(Reiter'ssyndrome)、高安氏动脉炎(Takayasu’s)、颞动脉炎、温抗体型自身免疫性溶血性贫血、韦格纳肉芽肿病、普秃、白塞病(Behcet’s disease)、查加斯病(Chagas’disease)、慢性疲劳综合征、家族性自主神经机能异常、子宫内膜异位症、化脓性汗腺炎、间质性膀胱炎、神经性肌强直、肉状瘤病、硬皮病、溃疡性结肠炎、白癜风、外阴痛、炎症性皮肤病、过敏性接触性皮炎、幽门螺杆菌(H.pylory)胃炎、慢性鼻腔炎性疾病、动脉粥样硬化和移植物抗宿主疾病。

[0134] 更具体地，如本文所用的“自身免疫性疾病”是起因于并针对个体自身组织或器官的疾病或病症或其共分离或表现或从其产生的病况。自身免疫性疾病可以指由具有对正常身体组织和抗原起反应的抗体的B细胞的产生导致或加重的病况。同样，自身免疫性疾病是可牵涉对来自自身抗原(例如核抗原)的表位特异的自身抗体分泌的疾病。

[0135] 可由本文描述的抗体中的任一种或多种治疗和/或预防的自身免疫性疾病或病症包括但不限于关节炎(类风湿关节炎比如急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风或痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、急性免疫性关节炎、慢性炎性关节炎、退行性关节炎、II型胶原诱导的关节炎、感染性关节炎、莱姆关节炎、增生性关节炎、银屑病性关节炎、斯提耳氏病、椎关节炎和青少年发作类风湿关节炎、骨性关节炎、arthritis chronica progrediente、变形性关节炎、Polyarthritis chronica primaria、反应性关节炎和强直性脊柱炎)，炎性过度增生性皮肤病，银屑病比如斑块状银屑病、滴状银屑病、脓疱型银屑病和指甲银屑病，特应性包括特应性疾病比如花粉热和乔布综合征，皮炎包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、剥脱性皮炎、过敏性皮炎、过敏性接触性皮炎、疱疹样皮炎、钱币状皮炎、脂溢性皮炎、非特异性皮炎、原发刺激性接触性皮炎和特应性皮炎，X连锁高IgM血症，过敏性眼内炎性疾病，荨麻疹比如慢性变应性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹包括慢性自身免疫性荨麻疹，肌炎，多发性肌炎/皮肌炎，青少年型皮肌炎，中毒性表皮坏死松解症，硬皮病(包括系统性硬皮病)，硬化症比如系统性硬化症、多发性硬化症(MS)(诸如脊髓-视觉MS，原发性进行性MS(PPMS)和复发缓解型MS(RRMS))、进行性系统性硬化症、动脉粥样硬化、动脉硬化、播散性硬化症、共济失调硬化症，视神经脊髓炎(NMO)，炎性肠病(IBD)(例如克罗恩病，自身免疫介导的胃肠道疾病，大肠炎诸如溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、溃疡性结肠炎(colitisulcerosa)、微小性结肠炎、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎以及和自身免疫性炎症性肠道疾病)，肠道炎症，坏疽性脓皮病，结节性红斑，原发性硬化性胆管炎，呼吸窘迫综合征包括成人或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，脑膜炎，葡萄膜全部或部分炎症，虹膜炎，脉络膜炎，自身免疫性造血系统病症，类风湿性脊柱炎，类风湿性滑膜炎，遗传性血管性水肿，脑神经损伤例如脑膜炎、妊娠疱疹、妊娠性类天疱疮、阴囊搔痒(pruritis scroti)，自身免疫性卵巢功能早衰，由于自身免疫性病况的突发性听力损失，IgE介导的疾病比如过敏反应以及过敏性和特发性鼻炎，脑炎比如Rasmussen脑炎以及边缘和/或脑干脑炎，葡萄膜炎例如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎，具有和不具有肾病综合征的肾小球肾炎(GN)例如慢性或急性肾小球肾炎诸如原发性GN、免疫介导的GN、膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜-或膜性增生性GN(MPGN)包括I型和II型和迅速进行性GN，增生性肾炎，自身免疫性多腺体内分泌衰竭，龟头炎包括浆细胞性局限性龟头炎、龟头包皮炎，离心性环状红斑，持久性色素异常性红斑，eythema multiform，环状肉芽肿，光泽苔癣，硬化萎缩苔癣，单纯慢性苔癣，小棘苔癣，扁平苔癣，层状鱼鳞病，表皮松解性角化过度，恶化前角化病，坏疽性脓皮病，变应性病况和响应，变应性反应，湿疹包括变应性或特应性湿疹、干性湿疹、出汗障碍性湿疹和水泡性掌跖湿疹，哮喘例如哮喘支气管炎、支气管哮喘和自身免疫性哮喘，涉及T细胞浸润和慢性炎症响应的病况，针对外来抗原例如妊娠期间胎儿的ABO血型的免疫反应，慢性肺部炎性疾病，自身免疫性心肌炎，白细胞粘附缺陷，狼疮包括狼疮性肾炎、狼疮性脑炎、小儿狼疮、非肾性狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮和盘状红斑狼疮、脱发性狼疮、系统性红斑狼疮(SLE)例如皮肤的SLE或亚急性皮肤SLE，新生儿狼疮综合征(NLE)和播散性红斑狼疮，青少年发病(I型)糖尿病包括小儿胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)，成人发病糖尿病(II型糖尿病)，自身免疫性糖尿病，特发性尿崩症，糖尿病性视网膜病，糖尿病性肾病，糖尿病性大动脉紊乱，细胞因子和T淋巴细胞介导的与急性和迟发性超敏感性相关的免疫响应，结核病，肉状瘤病，肉芽肿病包括淋巴瘤样肉芽肿病、韦格纳肉芽肿，粒细胞缺乏，血管炎包括血管炎、大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏)动脉炎)、中等血管血管炎(包括川崎病和结节性多动脉炎/结节性动脉周围炎)、显微镜下多动脉炎、免疫性血管炎、CNS血管炎、皮肤血管炎、超敏感性血管炎、坏死性血管炎例如系统性坏死性血管炎以及ANCA相关的血管炎例如Churg-Strauss血管炎或综合征(CSS)和ANCA相关的小血管血管炎，颞动脉炎，再生障碍性贫血，自身免疫性再生障碍性贫血，Coombs阳性贫血，Diamond Blackfan贫血，溶血性贫血或免疫溶血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)，恶性贫血(anemia perniciosa)，艾迪生氏病，纯红细胞性贫血或发育不全(PRCA)，凝血因子VIII缺乏，血友病A，自身免疫性嗜中性白血球减少症，全血细胞减少症，白细胞减少症，涉及白血球渗出的疾病，CNS炎性病症，阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，多器官损伤综合征例如败血症、外伤或出血继发的那些，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜病，抗磷脂抗体综合征，变应性神经炎，白塞病/综合征，Castleman综合征，古德帕斯彻综合征，雷诺综合征(Reynaud's syndrome)，肖格伦综合征，Stevens-Johnson综合征，类天疱疮例如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮，天疱疮(包括寻常型天疱疮、落叶性天疱疮、天疱疮粘膜性类天疱疮和红斑性天疱疮)，自身免疫性多内分泌病，赖特病或综合征，热损伤，先兆子痫，免疫复合物病症例如免疫复合物性肾炎，抗体介导的肾炎，多发性神经病，慢性神经病例如IgM型多发性神经病或IgM抗体介导的神经病变，血小板减少(例如由心肌梗死患者所发展的)包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、输血后紫癜(PTP)、肝素诱发的血小板减少症和自身免疫性或免疫介导的血小板减少症例如特发性血小板减少性紫癜(ITP)包括慢性或急性ITP，巩膜炎例如特发性角膜巩膜炎、巩膜外层炎，睾丸和卵巢的自身免疫性疾病包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎，原发性甲状腺功能减退，甲状旁腺功能减退，自身免疫性内分泌疾病包括甲状腺炎例如自身免疫性甲状腺炎，桥本病，慢性甲状腺炎(桥本甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎，自身免疫性甲状腺疾病，特发性甲状腺功能减退，Grave's病，多腺体综合征例如自身免疫性多腺体综合征(或多腺体内分泌综合征)，瘤外综合征包括神经系统瘤外综合征例如兰伯特-伊顿(Lambert-Eaton)肌无力综合征或伊顿-兰伯特综合征，僵人或僵人综合征，脑脊髓炎例如变应性脑脊髓炎(allergic encephalomyelitis)或变应性脑脊髓炎(encephalomyelitis allergica)和实验性变应性脑脊髓炎(EAE)，重症肌无力例如胸腺瘤相关重症肌无力、小脑退化、神经性肌强直、眼阵挛或眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)和感觉神经病变，多灶性运动神经病，席汉氏综合征(Sheehan's syndrome)，自身免疫性肝炎，慢性肝炎，类狼疮肝炎，巨细胞性肝炎，慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎，淋巴间质性肺炎(LIP)，梗阻性细支气管炎(非移植)对比NSIP，格林-巴利综合征，伯杰氏病(Berger'sdisease)(IgA肾病)，特发性IgA肾病，线性IgA皮肤病，急性发热性嗜中性皮肤病，角质层下脓疱性皮肤病，暂时性棘层松解性皮肤病，肝硬化例如原发性胆汁性肝硬化和肺硬变，自身免疫性肠下垂综合征，腹部或腹腔病，口炎性腹泻(麸质肠病)，难治性口炎性腹泻(refractory sprue)，特发性口炎性腹泻，冷沉球蛋白血症，肌萎缩侧索硬化(ALS；Lou Gehrig病)，冠状动脉疾病，自身免疫性耳病例如自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性听力损失，多软骨炎例如难治愈的或复发的或复发性多软骨炎，肺泡蛋白沉积症，柯根综合征(Cogan'ssyndrome)/非梅毒性间质性角膜炎，贝耳氏麻痹，Sweet病/综合征，自身免疫性酒渣鼻，带状疱疹相关疼痛，淀粉样变性，非癌性淋巴细胞增多，原发淋巴细胞增多其包括单克隆的B细胞淋巴细胞增多(例如，良性单克隆性丙种球蛋白病和意义未定的单克隆丙种球蛋白病，MGUS)，周围神经病变，瘤外综合征，离子通道病例如癫痫、偏头痛、心律失常、肌肉紊乱、耳聋、失明、周期性麻痹和CNS的离子通道病，自闭症，炎性肌病，局灶性或节段性或局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)，内分泌性眼病，葡萄膜视网膜炎，脉络膜视网膜炎，自身免疫性肝脏病症，纤维肌痛，多发性内分泌衰竭，施密特综合征，肾上腺炎，胃萎缩，早老性痴呆症，脱髓鞘性疾病例如自身免疫性脱髓鞘性疾病和慢性炎症性脱髓鞘性多神经病，德雷斯勒综合征，alopecia greata，全秃，CREST综合征(钙质沉着、雷诺氏现象、食管运动功能障碍、指端硬化和毛细血管扩张症)，男性和女性的自身免疫性不育例如由于抗精子抗体，混合结缔组织病，恰加斯氏病(Chagas'disease)，风湿热，习惯性流产，农民肺，多形性红斑，心脏切开术后综合征，柯兴氏综合征(Cushing's syndrome)，养鸟人肺，变应性肉芽肿脉管炎，良性淋巴细胞性脉管炎，阿尔波特氏综合征(Alport's syndrome)，牙槽炎例如变应性牙槽炎和纤维化牙槽炎，间质性肺病，输血反应，麻风病，疟疾，寄生虫病例如利什曼病、kypanosomiasis、血吸虫病、蛔虫病、曲霉病，Sampter综合征、卡普兰综合征，登革热，心内膜炎，心内膜心肌纤维化，弥漫性间质性肺纤维化，肺间质纤维化，肺纤维化，特发性肺纤维化，囊性纤维化，眼内炎，持久隆起性红斑et diutinum，胎儿成红细胞增多病，嗜酸性筋膜炎，舒尔曼综合征(Shulman's syndrome)、费耳提综合征(Felty's syndrome)，丝虫病，睫状体炎例如慢性睫状体炎、异色性睫状体炎、虹膜睫状体炎(急性或慢性)或Fuch睫状体炎，亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)，人类免疫缺陷病毒(HIV)感染，SCID，获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，埃可病毒感染，败血症，内毒素血症，胰腺炎，甲状腺毒症，细小病毒感染，风疹病毒感染，疫苗接种后综合征，先天性风疹感染，EB病毒感染，腮腺炎，埃文氏综合征，自身免疫性性腺衰竭，西登哈姆氏舞蹈病，链球菌感染后肾炎，血栓闭塞性血管炎，甲状腺毒症，脊髓痨，绒膜炎，巨细胞多肌痛，慢性过敏性肺炎，干燥性角膜结膜炎，流行性角膜结膜炎，特发性肾炎综合征，微小病变性肾病，良性家族性和缺血再灌注损伤，移植器官再灌注，视网膜自身免疫，关节炎症，支气管炎，慢性阻塞性呼吸道/肺疾病，硅肺病，口疮，口疮性口炎，动脉硬化病症，aspemiogenese,自身免疫性溶血，伯克氏病(Boeck's disease)，冷沉球蛋白血症，杜普伊特伦挛缩，endophthalmia phacoanaphylactica,enteritis allergica，麻风结节性红斑，特发性面神经瘫痪，慢性疲劳综合征，风湿热(febris rheumatica)，Hamman-Rich病,感觉神经性听力损失，血红蛋白尿症发作(haemoglobinuria paroxysmatica)，性腺机能减退，区域性回肠炎(ileitis regionalis)，白细胞减少，传染性单核细胞增多症，横贯性脊髓炎，原发性特发性粘液性水肿，肾病，交感神经性眼炎(ophthalmia symphatica)，肉芽肿性睾丸炎，胰腺炎，多神经根炎，坏疽性脓皮症，Quervain甲状腺炎，获得性脾萎缩，非恶性胸腺瘤，白癜风，中毒性休克综合征，食物中毒，涉及T细胞浸润的病况，白细胞粘附缺陷，细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发超敏反应相关的免疫响应，涉及白血球渗出的疾病，多器官损伤综合征，抗原抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜病，变应性神经炎，自身免疫性多内分泌病，卵巢炎，原发性粘液性水肿，自身免疫性萎缩性胃炎，交感性眼炎，风湿性疾病，混合性结缔组织病，肾病综合征，胰岛炎，多发性内分泌衰竭，自身免疫性多腺体综合征I型，成年发病的特发性甲状旁腺功能减退(AOIH)，心肌症例如扩张型心肌症，后天性大疱性表皮松解(EBA)，血色素沉积症，心肌炎，肾病综合征，原发性硬化性胆管炎，化脓性或非化脓性鼻窦炎，急性或慢性鼻窦炎，筛骨、额骨、上颌骨或蝶骨鼻窦炎，嗜酸性细胞相关病症例如嗜酸性细胞增多、肺浸润嗜酸性细胞增多、嗜酸性细胞增多性肌痛综合征、吕弗勒综合征、慢性嗜酸性肺炎、热带肺嗜酸性粒细胞增多、支气管肺曲霉病、曲霉肿或包含嗜酸性粒细胞的肉芽肿，过敏症，血清阴性脊椎关节炎，多内分泌自身免疫病，硬化性胆管炎，巩膜，巩膜外层，慢性皮肤粘膜念珠菌病，布鲁顿综合征，婴儿的瞬态低丙种球蛋白血症，维-奥二氏综合征，毛细血管扩张运动失调综合征，血管扩张，与胶原病相关的自身免疫性疾病，风湿病，神经系统疾病,淋巴结炎，降低血压反应,血管功能障碍，组织损伤，心血管局部缺血，痛觉过敏，肾缺血，脑缺血和疾病伴随的血管形成，变应性超敏感症，肾小球肾炎，再灌注损伤，缺血性再灌注障碍，心肌或其他组织的再灌注损伤，淋巴瘤气管支气管炎，炎症性皮肤病，具有急性炎症元件的皮肤病，多器官功能衰竭，大疱性疾病，肾皮质坏死，急性化脓性脑膜炎或其他中枢神经系统炎症性疾病，眼和眼眶炎性疾病，粒细胞输血相关的综合征，细胞因子诱导的毒性，发作性睡病，急性严重的炎症，慢性顽固性炎症，肾盂炎，动脉内增生，消化性溃疡，心瓣炎和子宫内膜异位症。

[0136] 本文描述的抗体可具有多种学术、医药和商业用途。所述抗体可被用于不同类型的诊断测试，例如体外或体内检测各种各样的疾病或者药物(drugs)(药品(pharmaceuticals))、毒素或其他蛋白包括激素的存在。本文描述的抗体可用于测试疾病，例如在患者的血清或血液中。所述疾病可包括OX40相关疾病或与OX40不相关的疾病或适应症，包括各种癌症、炎性或自身免疫性疾病。抗体也可用于癌症的放射免疫检测和放射免疫治疗，并且一些新的测试方法可使用这些所描述的抗体以仅靶向特定细胞类型即癌症的细胞膜。

[0137] 本文描述的抗体可被制成试剂盒或其他诊断包的一部分。同样地，本文提供了用于与本文的预处理方法一起使用的诊断试剂盒或制品。诊断试剂盒可包含下列中的任一种或多种：拮抗剂/抗体/药物参照材料；阳性对照中和抗体(优选地食蟹猕猴的山羊)；蛋白A+G柱(例如蛋白A/G柱)；去脂试剂；免疫球蛋白亲和纯化缓冲剂(例如结合、洗脱和中和缓冲剂)；补体血清；细胞的测定稀释剂；使用说明书或文献；小瓶冷冻细胞(例如WIL2细胞)；细胞标记试剂(例如CELLTITER GLO.RTM)等。举例来说，诊断试剂盒可包括但不限于：(a)去脂试剂；(b)用于免疫球蛋白的亲和纯化的缓冲剂(例如结合和洗脱缓冲剂)；和(c)指导诊断试剂盒的使用者在对来自自身免疫性疾病或癌症受试者的生物学样品进行基于细胞的生物测定(例如中和抗体测定)之前使用试剂盒预处理所述样品(例如以避免血清干扰的问题)的使用说明书。所述诊断试剂盒任选地还包含下列中的任一种或多种：药物参照材料、阳性对照中和抗体、补体血清、细胞的测定稀释剂和细胞标记试剂等。

[0138] 本文描述的抗体和其他发现还提供了高通量的筛选方法。更具体地，以及如本领域技术人员所理解的，可能得到筛选与OX40受体结合并抑制Tr1细胞生成和功能或促进Tr1细胞的生成和功能的拮抗型或激动型单克隆抗体或小分子的高通量方法。在一个这样的方法中，将具有产生IL-10的能力的人T细胞系(SU-DHL-1)用人OX40基因(SUOX40)转染。将100,000个SUOX40细胞与100,000个小鼠的成纤维细胞(L细胞)或100，000个表达人OX40-配体的小鼠成纤维细胞(OX40-配体L细胞)在96孔板中一起培养。培养48小时后，收集培养上清液用以通过IL-10特异性ELISA测量IL-10。在代表性的实验中，在OX40-配体不存在的情况下培养的100,000个SUOX40细胞生产高达6,000pg/ml IL-10。在OX40-配体存在的情况下，100,000个SUOX40细胞产生少于1,000pg/mlIL-10。这一培养方法可被用于筛选，尤其，阻断OX40-配体抑制经由SUOX40细胞的IL-10产生的能力的拮抗型单克隆抗体或小分子。作为选择，这一培养方法可通过用对OX40特异的可能的激动型单克隆抗体或小分子替换表达OX40-配体的L细胞进行改进以确定，尤其，它们的抑制经由SUOX40细胞的IL-10产生的能力。

[0139] 本文描述的抗OX40抗体可被用作测定或用在用于测试或测量在有机体或有机样品中发现的药物或其他分子的活性的测定中。它们也可以用于定量测定以测量样品中物质的量。生物测定和免疫测定在可使用这些抗体的许多不同专用生物化学测定之中。本文教导的抗OX40抗体可被用于其他测定中以测量过程例如酶活性、抗原捕获、干细胞活性和竞争性蛋白结合。

[0140] 如本领域技术人员所理解的，表达人GITRL、OX40L、4-1BBL、ICOSL的L细胞通过逆转录病毒介导的转导生成。简单地说，人GITRL(Accession#NM_005092)、OX40L(Accession#NM_003326)、4-1BBL(Accession#NM_003811)、ICOSL(Accession#NM_015259)的全长编码序列用从HSV-1刺激的PBMC制备的RNA通过RT-PCR扩增。随后，将cDNA克隆至基于MSCV的逆转录病毒载体pMIGW2中并且所得到的质粒通过限制性酶消化和DNA测序来证实。为了产生重组逆转录病毒，将每个载体与包装构建体pCL-gp(gag/pol)和pHCMV-VSVg(VSV糖蛋白被膜)在HEK293T细胞中共转染。两天后，收集包含病毒的培养上清液并用于以moi100感染⑶32L细胞。在这一条件下，有成效地转导了>95％的细胞。

[0141] 如本领域技术人员所理解的，将分离的CD14+单核细胞(纯度>94％)在100ng/ml GM-CSF和50ng/ml IL-4(均来自R&D)的存在下培养5天。如本领域技术人员所理解的，将所得到的不成熟的DC洗涤并与IFN-a(1000U/ml,PBLBiomedical Laboratories)、IL-10(10ng/ml，R&D)和受辐照的CD40L转染的L细胞(DC与L细胞的比例4:1)一起培养24h以获得成熟DC。

[0142] 如本领域技术人员所理解的，使用CD4+T细胞分离试剂盒II(MiltenyiBiotec)将幼稚CD4+T细胞和记忆CD4+T细胞(每个纯度>99％)从PBMC分离然后进行细胞分选(CD4+CD45RA+CD45RO-CD25-部分作为幼稚T细胞以及CD4+CD45RA-CD45RO+CD25-部分作为记忆T细4 +
胞)。如本领域技术人员所理解的，将4×10个新鲜纯化的同种异体的幼稚CD4 T细胞与不成熟的或培养的DC(DC与T比例1:10)一起在重组人OX40L(R&D，100ng/ml)的存在或不存在下在圆底96孔培养板中共同培养7天。如本领域技术人员所理解的，还将纯化的CD4+T细胞与IL-12(10ng/ml，R&D)、IL-4(25ng/ml,R&D)或地塞米松(5×10-8M，Life Technologies)和1-7
α,25-二羟维生素D3(10 M)的组合在溶解的抗CD28单克隆抗体(CD28.2,1μg/ml)和IL-2(50U/ml,R&D)的存在下在48孔培养板中已经用抗CD3单克隆抗体(OKT3,0.2μg/ml)预包被的受辐照的CD32/OX40L-L细胞、CD32/GITRL-L细胞、CD32/4-1BBL-L细胞或亲本CD32-L细胞上培养7天。在一些实验中，如本领域技术人员所理解的，将CD4+T细胞在48孔培养板中用抗CD3单克隆抗体(0.2μg/ml)预包被的CD32-L细胞、CD32-L细胞和CD32/ICOSL-L细胞的混合物(比例1:1)或CD32/ICOSL-L细胞和CD32/OX40L-L细胞的混合物(比例1:1)上培养7天。如本领域技术人员所理解的，RPMI1640被使用并用10％FCS、2mM L-谷酰胺、1mM丙酮酸钠、青霉素G和链霉素补充用于所述培养。

[0143] 如本领域技术人员所理解的，收集并洗涤所培养的T细胞，然后用结合板的抗CD3(5μg/ml)和溶解的抗CD28(2μg/ml)以1×106个细胞/ml的浓度再刺激24h。如本领域技术人员所理解的，通过ELISA测量上清液中的IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-α的水平(所有试剂盒来自R&D)。为了细胞内的细胞因子产生，将培养的T细胞用50ng/ml的PMA加上2μg/ml的离子霉素再刺激6h。如本领域技术人员所理解的，在最后2h加入布雷菲德菌素A(10μg/ml)。如本领域技术人员所理解的，使用FIX和PERM试剂盒(CALTAG)用PE-标记的抗IL-4的单克隆抗体或TNF-αFITC-标记的抗IFN-α的单克隆抗体和APC-标记的抗IL-10(所有都来自BD)染色细胞。

[0144] 如本领域技术人员所理解的，收集T细胞并重悬在含有EDTA的培养基中以分离簇。如本领域技术人员所理解的，通过台盼蓝排除死细胞而计数存活的细胞。如本领域技术人员所理解的，对于抑制性功能测定，幼稚CD4+T细胞(A)和通过抗CD3单克隆抗体、抗CD28单克隆抗体、IL-2、Dex和vitD3从幼稚CD4+T细胞生成的Tr1细胞在亲本L细胞(B)或OX40L-L细胞(C)存在的情况下，这三种细胞类型和它们1:1比例的混合物然后通过在5μg/ml抗CD3单克隆抗体和1μg/ml抗CD28单克隆抗体存在的情况下培养来重刺激5天，之后通过[3H]胸腺嘧啶核苷掺入测定细胞增殖。

[0145] 抗人OX40特异性单克隆抗体的生成

[0146] 我们生成多种抗人OX40的激动型小鼠单克隆抗体。抗体的抗原结合特异性通过流式细胞术来证实(图10-12)。抗体的激动剂活性通过功能测定来验证。我们发现20个OX40特+异性抗体中的九个可阻断维生素D3/地塞米松介导的来自CD4T细胞的Tr1细胞的生成(图
13)，增强CD4+T细胞增殖(图14)并抑制ICOS+CD4+CD25highFOXP3+Treg IL-10产生(图16)。我们滴定所述抗体并且发现五种在以低至4ng/ml的浓度抑制Tr1细胞生成中具有有力活性。

[0147] OX40抗体抑制CD4+CD25高FOXP3+Treg功能

[0148] OX40单克隆抗体中的一些抑制FOXP3+Treg的抑制性功能(图17)。在有力抑制IL-10从Tr1细胞和CD4+CD25高CD127–FOXP3+Treg产生的五种抗体(119-8B,119-43,119-122,
119-173B和106-222)中，三种(119-43,119-122和106-222)在阻断CD4+CD25高CD127–FOXP3+Treg功能中是有力的(图17)。然而，11种抗体中的两种(119-33和120-140A)没有抗IL-10产生的活性，但阻断CD4+CD25高FOXP3+Treg的功能(图18)。

[0149] 抗人OX40单克隆抗体

[0150] 抗人OX40单克隆抗体的生成通过例如将6-8周龄的BALB/c小鼠与用人OX40按照既定方案转染的小鼠细胞系免疫进行。建立并进一步分析了分泌特异性染色OX40+细胞的单克隆抗体的杂交瘤克隆。

[0151] 我们设计全面筛选以检测通过抑制Tr1细胞的生成和功能触发OX40信号传导的那些克隆(即，激动型抗体)。进一步纯化那些克隆。抗hOX40的激动型抗体可被人源化并且单独或与抗肿瘤疫苗或其他佐剂组合用于人类抗肿瘤治疗的临床方案。几种不同的肿瘤类型可以作为这些抗体的靶标，包括黑色素瘤、淋巴瘤和乳腺癌。

[0152] 在另一个实施方案中，将6-8周龄的BALB/c雌性小鼠用于足垫或皮下免疫。每个小鼠用5百万个用人OX40转染的小鼠L细胞(L-OX40)以3天的间隔注射6次。第六次注射之后三天，使用既定方案将小鼠安乐死并且移除腿弯部的淋巴结(来自足垫免疫)或脾脏(来自皮下免疫)并且将细胞与SP2.0骨髓瘤或NSO骨髓瘤细胞以1比1的比例融合以生成杂交瘤克隆。然后通过ELISA测定筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤克隆的与L-hOX40细胞的结合特异性。通过流式细胞术分析进一步证实与L-hOX40细胞结合但不与L亲本细胞结合的杂交瘤上清液在L-hOX40和SUPM2-hOX40细胞上的结合。

[0153] 在图10的实验中，通过ELISA筛选抗L-hOX40对比L亲本细胞的hOX40杂交瘤上清液。选择了二十种hOX40特异性单克隆抗体。通过将细胞与PBS中的0.01％氯化镁钙混合将两千万个L细胞或表达人OX40的L细胞(L-hOX40)包被在96孔板上并在层流罩中干燥过夜。之后将板在使用前于-20℃冷冻至少一天。对于抗体结合测定，将冷冻的细胞用PBS再水化并用含有PBS加上0.05％Twen20的洗涤缓冲液洗涤并且用洗涤缓冲液中的2％BSA封闭。之后将调整的细胞用于结合OX40抗体上清液。之后用二级抗体(抗小鼠IgG FC HRP)检测与细胞结合的抗体。hOX40特异性杂交瘤上清液识别表达OX40的L细胞但不识别亲本L细胞。

[0154] 在图11的实验中，通过流式细胞术分析筛选hOX40特异性单克隆抗体。将相等数目(100k)的L细胞和L-hOX40在FACS缓冲液(1％FCS/2mM EDTA/PBS)中混合且与0.5μg的FPLC(Protein A HiTrap/Gentle Ag/Ab洗脱缓冲液)纯化抗体一起孵育。之后将细胞洗涤并用二级抗体(PE共轭的抗小鼠IgG)染色。两个峰指示抗hOX40单克隆抗体的阳性和阴性染色。单个峰表明没有抗体结合或抗体的非特异性结合。通过流式细胞术分析证实二十种hOX40特异性单克隆抗体。

[0155] 在图12的实验中，通过使用表达hOX40的SUPM2细胞(SUPM2-hOX40)证实hOX40单克隆抗体特异性。如图11中将相等数目(100k)的SUPM2和SUPM2-hOX40细胞在FACS缓冲液(l％FCS/2mM EDTA/PBS)中混合并用于hOX40单克隆抗体结合。通过流式细胞术分析每种抗体的结合特异性。两个峰指示抗hOX40单克隆抗体的阳性和阴性染色，而单个峰表明没有抗体结合或抗体的非特异性结合。再次证实了二十种hOX40特异性单克隆抗体。

[0156] 在图13的实验中，我们寻求鉴定可抑制Tr1细胞从由VitD3(10微摩尔mM)/Dex(50纳M)、CD32L/ICOSL和抗CD3/CD28(0.2微克/ml)刺激的CD4+T细胞生成的人OX40特异性单克隆抗体。在细胞培养的第0天加入抗hOX40单克隆抗体并且在刺激7天后使CD4+T细胞经历IL-10细胞内染色以及之后的流式细胞术分析。代表性的荧光活化细胞分选(FACS)数据示于A中而占所有抗hOX40单克隆抗体处理的Tr1细胞的百分比示于B。使用从这一实验获得的细胞，我们寻求鉴定刺激CD4+T细胞增殖(图14，在刺激后第7天将细胞计数)并抑制Tr1从CD4+生成(图13)的hOX40特异性单克隆抗体。

[0157] 为了鉴定这些hOX40单克隆抗体抑制Tr1细胞从CD4+T细胞生成的能力，如上文图13的实验中所描述的生成并培养Tr1细胞。代表性的FACS数据示于A中并且用九种抗hOX40单克隆抗体处理之后的Tr1细胞的百分比示于B中。五种hOX40特异性单克隆抗体于4ng/ml的浓度强烈抑制Tr1细胞的生成(图15)。

[0158] 在图16A、16B和16C的实验中，将新鲜分选的ICOS+CD4+CD127-CD25高T细胞用抗CD3(0.2μg/ml))(在CD32L/ICOSL细胞和CD32L/hOX40L细胞存在的情况下)或用抗hOX40单克隆抗体或对照抗体刺激5天。之后将细胞计数并将5×104个细胞用抗CD3/CD28再刺激24h并用Elisa试剂盒检测上清液的IL-10分泌。我们鉴定了抑制Tr1从CD4+T细胞生成也抑制IL-10+ + 高 + -从天然的ICOS CD4CD25 T细胞产生的hOX40特异性单克隆抗体。将新鲜分选的ICOS ICOSCD4+CD127-CD25高Treg与CFSE标记的CD4+CD25低细胞在受辐照的单核细胞和抗CD3(0.3μg/ml)和抗hOX40mAb存在的情况下一起培养。培养3.5天之后，通过FACS通过细胞中CFSE的稀释测定细胞增殖(图16C)。

[0159] 图17A和17B显示抑制Tr1细胞的生成并阻断FOXP3+CD4+CD25高Treg功能的抗hOX40单克隆抗体的鉴定。将新鲜分选的FOXP3+CD4+CD127-CD25高T细胞(3.5×104)与CFSE标记的CD4+CD25低细胞(7×104)一起在受辐照的单核细胞(7×104,6000rad)和0.3μg/ml抗CD3以及各种浓度的抗hOX40单克隆抗体存在的情况下培养。培养3至4天后，通过流式细胞术分析通过测定细胞中CFSE的稀释测定细胞增殖。指示分裂细胞的百分比。代表性的流式细胞术分析示于图17A中。6个单克隆抗体的数据示于图17B中。

[0160] 在图18的实验中，将新鲜分选的FOXP3+CD4+CD127-CD25高T细胞(3.5×104)与CFSE标记的CD4+CD25低细胞(7×104)一起在受辐照的单核细胞(7×104,6000rad)和0.3μg/ml抗CD3以及各种浓度的OX40单克隆抗体存在的情况下培养。培养3至4天后，通过FACS通过细胞中CFSE染料的稀释测定细胞增殖。数据代表两个实验。我们鉴定了不抑制Tr1生成但阻断FOXP3+CD4+CD25高Treg功能的抗hOX40单克隆抗体。

[0161] 在图19A和19B的实验中，将淋巴瘤来源的CD4+CD25高T细胞与从健康供体分离的CFSE标记的CD4+CD25低细胞(7×104)一起在受辐照的同种异体单核细胞(7×104,6000rad)和0.3微克/ml抗CD3和25μg/ml抗hOX40单克隆抗体存在情况下培养。培养3至4天后，通过FACS通过测定CFSE稀释测定细胞增殖。代表性的FACS分析示于图19A中而所有的实验数据示于图19B中。我们发现hOX40激动型抗体阻断淋巴瘤来源的CD4+CD25高Treg功能。

[0162] 图20显示与人和恒河猴OX40特异性结合的OX40激动型抗体的鉴定。恒河猴外周血+ +单个核细胞通过ficoll离心获得。CD4T细胞通过CD4微珠获得。CD4T细胞用10μg/ml的菜豆凝集素(PHA)刺激。刺激后两天，将细胞用抗hOX40mAb染色之后用山羊抗小鼠IgG-APC和CD69-PE染色。106-317作为阴性对照。显示六种强烈活化T细胞增殖的抗hOX40mAb可结合活化的恒河猴CD4+T细胞。这些结果表明可在猴中测试这六种抗hOX40单克隆抗体的毒性。

[0163] 使用传统融合方案获得的500个抗人OX40阳性克隆中仅七个表现出触发OX40的特性，包括但不限于如表1中所公开的阻断产生IL-10的Tr1生成和nTreg抑制性功能的能力。

[0164] 表1.OX40特异性单克隆抗体的列表

[0165]

[0166]

[0167] 基于三个标准选择杂交瘤克隆106-222和119-122

[0168] 1.它们抑制Tr1细胞从CD4+T细胞生成(可诱导的Treg)

[0169] 2.它们逆转FOXP3+nTreg细胞的抑制性功能

[0170] 3.它们表现出Tr1细胞关闭的剂量依赖性抑制以及FOXP3+Treg功能的逆转。

[0171] 嵌合和人源化抗体

[0172] 人源化(也称为重构或CDR移植)是用于减少来自异种来源(包括但不限于啮齿类动物)的单克隆抗体的免疫原性并增加其人类免疫系统活化的既定技术。尽管使用分子生物学的技术产生工程化单克隆抗体的机制是已知的，但是啮齿类互补决定区(CDR)简单移植到人框架区中并不总是重建原始单克隆抗体的结合亲和性和特异性。

[0173] 为了将抗体人源化，人源化抗体的设计成为复制原始分子的功能的关键步骤。这一设计包括各种选择：CDR的范围、使用的人框架以及来自啮齿类单克隆抗体的残基至人框架区的置换(回复突变)。这些回复突变的位点大部分已经通过序列/结构分析或通过可变区的3D结构的同源模型分析进行鉴定。

[0174] 近来，噬菌体文库已经被用于改变所选择的位点的氨基酸。相似地，许多方法已经被用于选择将啮齿类CDR移植其中的最适合的人类框架。早期实验使用有限亚型的良好表征的人单克隆抗体(其中结构常常但不总是可得的)，不考虑与啮齿类单克隆抗体的序列同一性(所谓的固定的框架法)。某些小组使用具有与啮齿类可变区高度氨基酸序列同一性(同源匹配或最佳拟合)的可变区；其他的使用共有或种系序列而还有其他的选择在来自若干不同人单克隆抗体的轻链或重链可变区中的框架区序列的片段。还有用在人单克隆抗体中存在的最常见的残基取代表面啮齿类残基的已开发的人源化方法(“表面重建”或“贴面”)和使用CDR范围的不同定义的那些。人源化抗体描述于下文。然而，包含SEQ IDNO:4和10或SEQ ID NO:16和22的可变重链区和轻链区的嵌合抗体同样描述于本文。

[0175] 人源化单克隆抗体来源于小鼠抗OX40抗体。

[0176] 分离的人源化抗OX40抗体可具有包含SEQ ID NO:1或13氨基酸序列的可变重链CDR1。分离的人源化抗OX40抗体可具有包含SEQ ID NO:2或14氨基酸序列的可变重链CDR2。分离的人源化抗OX40抗体可具有包含SEQ ID NO:3或15氨基酸序列的可变重链CDR3。

[0177] 分离的人源化抗OX40抗体可具有包含SEQ ID NO:7或19氨基酸序列的可变轻链CDR1。分离的人源化抗OX40抗体可具有包含SEQ ID NO:8或20氨基酸序列的可变轻链CDR2。分离的人源化抗OX40抗体可具有包含SEQ ID NO:9或21氨基酸序列的可变轻链CDR3。

[0178] 分离的人源化抗OX40抗体可具有包含SEQ ID NO:11或23的氨基酸序列，或与SEQID NO:11或23的氨基酸序列具有至少90百分比同一性的氨基酸序列的可变轻链。分离的人源化抗OX40抗体可具有包含SEQ ID NO:5或17的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5或17的氨基酸序列具有至少90百分比同一性的氨基酸序列的可变重链。

[0179] 分离的人源化抗OX40抗体可具有由SEQ ID NO:12或24的核酸序列或与SEQ ID NO:12或24的氨基酸序列具有至少90百分比同一性的核酸序列编码的可变轻链。分离的人源化抗OX40抗体可具有由SEQ ID NO:6或18的核酸序列，或与SEQ ID NO:6或18的氨基酸序列具有至少90百分比同一性的的核酸序列编码的可变重链。

[0180] 人源化抗OX40抗体的表达

[0181] 可通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链基因和重链基因，制备本发明的抗体或抗体部分。为了重组表达抗体，用一个或多个携带编码所述抗体的免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段的重组表达载体转染宿主细胞，使得所述轻链和重链在宿主细胞中表达，并且优选分泌入培养所述宿主细胞的培养基中，从该培养基中可回收所述抗体。使用标准的重组DNA的方法以获得抗体重链基因和抗体轻链基因，将这些基因整合入重组表达载体，并将所述载体引入宿主细胞，比如在Sambrook，Fritsch和Maniatis(编辑)，Molecular Cloning；ALaboratory Manual,第二版，ColdSpring Harbor,N.Y.,(1989),Ausubel,F.M.等(编辑)CurrentProtocoIs in MolecuarBiology,Greene Publishing Associates,(1989)和Boss等的美国专利第4,816,397号中描述的那些。

[0182] 可从各种动物细胞，优选从哺乳动物细胞，特别优选从小鼠和人细胞生产抗体以及抗体片段和变体。同样，重组DNA表达系统可包括利用已经被工程化以生产高水平的特定蛋白的宿主细胞和表达构建体的那些。这些宿主细胞和表达构建体可包括大肠杆菌(Escherichia coli)，携带来源于质粒或病毒(噬菌体)的表达构建体；酵母例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisieae)或毕赤酵母(Pichiapastoras)，携带游离的或染色体整合的表达构建体；昆虫细胞和病毒例如Sf9细胞和杆状病毒；以及哺乳动物细胞，携带游离的或染色体整合的(包括但不限于逆转录病毒)表达构建体(此类方法，可由稿件Verma et al.,J.Immunol.Methods216:165-181,1998看出)。抗体也可在植物中(此类方法，例如，可由美国专利第6,046,037号；Ma et al.,Science268:716-719,1995看出)或通过噬菌体展示技术(此类方法，例如，可由Winter et al.,Annu.Rev.Immunol.12:433-455,1994看出)生产。

[0183] 显示所期望的活性和结合特异性/亲和性水平的人抗OX40抗体可进一步通过标准重组DNA技术操作，例如以将可变区基因转换为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段可操作地连接编码另一蛋白例如抗体恒定区或弹性连接子的DNA片段。如本文背景下所用的。术语“可操作地连接”意图指两个DNA片段连接以使由两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在框内。

[0184] 在另一方面，编码VH区的分离的DNA可通过使编码VH的DNA与另一种编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的DNA分子可操作地连接而被转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)以及包含这些区的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。所述重链恒定区可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区及如Kabat中(,Kabat,E.A.,etal.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)所描述的其中的任何同种异型变体，但是最优选为IgGl或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可以与另一种只编码重链CH1恒定区的DNA分子可操作地连接。

[0185] 同样，与表面抗原结合的人源化抗体可与负载FcR的细胞相互作用。这样的相互作用可引起效应子功能例如ADCC和/或由于Fe介导的交联而增强信号传导。所述相互作用对于治疗可能是有利或有害的。这样的有害的副作用包括发冷、发烧、低血压，以及在某些情况下，呼吸困难(Thistlethwaite JR Jr.,CosimiAB,Delmonico FL,et al.)。

[0186] 某些有害影响可起源于T细胞表面上存在的蛋白复合物中。一旦所述T细胞活化，所述蛋白复合物便参与经由抗原受体产生的信号的传导。简单地说，所述T细胞的活化起动级联事件，其包括抗原受体的增强的交联。所述受体的交联可有助于导致某些细胞因子例如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素2(IL-2)和干扰素γ(IFNγ)的诱导的强烈的促有丝分裂信号传导。已知大量生成的话这些细胞因子是有毒的。

[0187] 例如，抗CD3mAb目前用于自身免疫性疾病包括I型糖尿病的治疗，其中T细胞介导抗胰岛(胰岛素的生产者)的攻击(Kaufman A,and Herold K.Anti-CD3mAbs for treatment of type1diabetes Diabetes Metab Res Rev2009；25:302–306)。已知抗CD3抗体抑制经由T细胞的靶标溶解并且增强抗原受体CD3的交联。此外，连同其有力的促有丝分裂活性，所述抗CD3抗体已知是细胞因子尤其是肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素2(IL-2)和干扰素γ(IFN-γ)的有力的诱导剂。响应于药物(Chatenoud L.)从T细胞大量释放细胞因子尤其是TNF-α产生毒性效应。这些不期望的副作用已被归因于负载CD3分子的T细胞与抗体的Fc部分结合的负载FcR的细胞的交联。所述交联活化所述T细胞和负载FcR的细胞，导致如上文提及的细胞因子的大量释放。

[0188] 相似地，使用抗OX40抗体可产生潜在的不期望的副作用。例如，与表达OX40的T细胞结合的抗OX40抗体也可结合负载FcR的细胞并且触发对用所述抗体治疗的患者有利或有害的细胞因子的产生。为了克服这一潜在的问题，我们已经设计并且在本文提供了突变抗OX40抗体的FcR部分的方法以避免毒性效应并提供所述FcR部分的突变(其可能是所期望的)。

[0189] 与FcR(CD16、CD32和CD64)相互作用的人IgG1的位点已知的。将其作图至上游CH2结构域。最重要的氨基酸是位点234和235的两个Leu残基。通过将这两个残基突变为两个Ala残基，废除了IgG1与所有FcR的相互作用。掺入这些突变的人源化抗CD3(HuOKT3AA)是更安全的药物并且具有与HuOKT3不同的作用机制。参见例如，美国专利第6,491,916号，其通过引用全文并入本文。

[0190] 所述AA突变的位点如下所示：

[0191] 234235

[0192] ---A---P---E---L---L---G---G---P---野生型IgG1上游CH2

[0193] ---A---P---E---A---A---G---G---P---AA突变体IgG1上游CH2

[0194] 本文描述的Hu222AA和Hu122AA可含有这些突变。如果测定系统包含负载FcR的细胞，你可以看见野生型和AA突变体之间的差异。否则，两种抗体将表现一样。

[0195] 编码VL区的分离DNA可通过使编码VL的DNA与另一种编码轻链恒定区CL的DNA分子可操作地连接而转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)并且包含这些区段的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。所述轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。

[0196] 为了创建scFv基因，使编码VH和VL的DNA片段与另一种编码弹性连接子例如编码氨基酸序列(Gly.sub.4-Ser).sub.3的片段可操作地连接，这样使得VH和VL序列可表达为连续的单链蛋白，并且VL和VH区通过弹性连接子连接在一起(参见例如，Bird et al.(1988)Science242:423-426；Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；McCafferty et al.,Nature(1990)348:552-554)。

[0197] 本文描述的抗体的氨基酸序列修饰是所预期的。例如，可期望的是提高抗体的结合亲和性和/或其他生物学特性。抗体的氨基酸序列变体通过将适合的核苷酸变化引入抗体核酸或通过肽合成来制备。这样的修饰包括例如将抗体氨基酸序列中的残基缺失和/或插入和/或置换。可进行缺失、插入和置换的任意组合以达到最终的构建体，只要最终的构建体具有所期望的特征。氨基酸变化可在制得序列的同时被引入目标抗体氨基酸序列中。

[0198] 用于鉴定抗体的某些残基或区域为诱变的优选部位的有效方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham and Wells(1989)Science,244:1081-1085所描述的。这里，鉴定了靶残基的残基或基团(例如，带电荷残基如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸及谷氨酸)并由中性或带负电荷氨基酸(最优选丙氨酸或多丙氨酸)取代以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后将显示对所述置换的功能敏感性的那些氨基酸部位通过在或对置换的位点导入其它变体进行细化。因此，虽然预先确定了引入氨基酸序列变异的位点，但突变本身的性质不需要预先确定。例如，为分析在给定位点突变的性能，在靶密码子或靶区域进行了丙氨酸扫描或随机诱变并筛选所表达的免疫球蛋白的所期望的活性。

[0199] 氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至包含一百或更多残基的多肽的氨基和/或羧基端融合体，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N或C端与增加抗体血清半衰期的酶(例如用于ADEPT的)或多肽的融合体。抗体的另一类氨基酸变体改变抗体的原始糖基化模式。这样的变化包括缺失抗体中存在的一个或多个碳水化合物部分和/或加入一个或多个抗体中不存在的糖基化位点。

[0200] 另一类变体是氨基酸置换变体。这些变体具有由不同残基取代的抗体分子中的至少一个氨基酸残基。最有兴趣进行置换诱变的位点包括超变区，但是FR改变也是预期的。保守置换示于美国专利第7,812,133号的表1中，第43栏第55列至第44栏第49列，通过引用并入本文，并在“优选的置换”的标题下。如果这样的置换引起生物学活性的改变，则可引入表1中称作“示例性置换”或如下文参考氨基酸分类而进一步描述的更实质性改变并筛选产物。

[0201] 此外，抗体的生物学特性的实质性修改可通过选择其对维持(a)置换区多肽骨架的结构，例如片状或螺旋构象，(b)靶位点处该分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的大小的效应上显著不同的置换来完成。天然存在的残基根据共有的侧链特性可分为：(1)疏水性：正亮氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸、异亮氨酸；(2)中性亲水：半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；(3)酸性:天冬氨酸，谷氨酸；(4)碱性：组氨酸，赖氨酸，精氨酸；(5)影响链定向的残基：甘氨酸，脯氨酸；和(6)芳香族：色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。非保守置换将限定上述某一类的成员被改变为另一类。

[0202] 为了表达本文描述的抗体或抗体部分，将如上所述获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入表达载体中以使所述基因与转录控制序列和翻译控制序列可操作地连接。在此背景下，术语“可操作地连接”意图指抗体基因连接入载体，这样使得所述载体内的转录控制序列和翻译控制序列发挥其预期的调节所述抗体基因的转录和翻译的功能。选择与所用的表达宿主细胞匹配的表达载体和表达控制序列。抗体轻链基因和抗体重链基因可插入独立的载体，而更常见的是，将这两种基因插入同一表达载体。所述抗体基因通过标准方法插入表达载体中(例如，在抗体基因片段和载体上的互补限制性位点的连接，或者如果没有限制性位点时则平端连接)。

[0203] 如图23中所示，用于Hu106-222IgG1/κ抗体的表达载体的一个这样的图示结构。从顶部的SalI位点顺时针前进，所述质粒含有从人巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子和增强子(CMV启动子)开始的重链转录单元以起始抗体重链基因的转录。CMV启动子之后是VH外显子、含有包括CH1、铰链区、CH2和CH3外显子以及介于中间的内含子的人γ-1重链恒定区的基因组序列以及CH3外显子之后的多腺苷酸化位点。重链基因序列之后，轻链转录单元从CMV启动子开始，之后是VL外显子和含有人κ链恒定区外显子(CL)与在其前面的部分内含子的基因组序列以及CL外显子之后的多腺苷酸化位点。轻链基因之后是SV40早期启动子(SV40启动子)，大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)和含有SV40多腺苷酸化位点的片段(SV40poly(A)位点)。最后，质粒含有质粒pUC19的一部分，包含细菌的复制起点(pUC ori)和β内酰胺酶基因(β内酰胺酶)。相关限制性内切酶位点示于图中。

[0204] 重组表达载体可编码有助于抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可克隆入载体以使信号肽在框内连接于抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即非免疫球蛋白蛋白的信号肽)。

[0205] 如上文所指出的，除了抗体链基因之外，本发明重组表达载体携带有控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语“调节序列”意图包括控制抗体链基因转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。这样的调节序列描述于例如Goeddel；Gene Expression Technology:Methodsin Enzymology185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)中。应当理解的是，表达载体的设计，包括调节序列的选择，可能取决于诸如有待转化的宿主细胞的选择、所期望的蛋白的表达水平等的因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平蛋白表达的病毒元件，例如来源于以下病毒的启动子和/或增强子:巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒。对于病毒调节元件及其序列的进一步描述，参见例如Stinski的美国专利第5,168,062号、Bell等的美国专利第4,510,245号和Schaffner等的美国专利第4,968,615号，Bujard等的美国专利第5,464,758号和Bujard等的美国专利第5,654,168号。

[0206] 除了抗体链基因和调节序列之外，本发明重组表达载体可携带其他序列，例如调节所述载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因有助于选择所述载体已经引入其中的宿主细胞(参见例如均为Axel等的美国专利第4,399,216、4,634,665和5,179,017号)。例如，选择标记基因通常赋予载体已经引入其中的宿主细胞对药物如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr.sup.宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。

[0207] 为了表达轻链和重链，编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染入宿主细胞中。各种形式的术语“转染”意图包括通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的各种各样的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染等。尽管理论上可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明抗体，但是在真核细胞中并最优选哺乳动物宿主细胞中表达抗体是最优选的，因为这样的真核细胞、尤其是哺乳动物细胞较原核细胞更可能装配和分泌适当折叠的以及免疫活性的抗体。用于表达本文描述的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国苍鼠卵巢细胞(CHO细胞)(比如在Urlaub and Chasin ,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220中描述的，与DHFR选择标记一起使用的dhfr-CHO细胞，如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621中所描述的)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当编码抗体基因的重组表达载体被引入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞以足够允许抗体在宿主细胞中表达更优选所述抗体分泌至宿主细胞在其中生长的培养基中的时间来生产所述抗体。抗体可使用标准蛋白纯化方法从培养基中回收。

[0208] 宿主细胞也可以用来产生完整抗体的一部分，例如Fab片段或scFv分子。应该理解的是，关于上述方法的各种改变也在本发明的范围内。例如，最好用编码本发明抗体的轻链或重链(而不是同时的二者)的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可用来去除结合OX40非必需的编码轻链和重链之一或二者的DNA的一部分或全部。本发明的抗体也包括这样的截短DNA分子表达的分子。另外，可以通过标准化学交联方法交联本发明抗体与第二种抗体制备双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本发明的抗体，而另一条重链和轻链是非OX40抗原特异性的。

[0209] 药物组合物和药物施用

[0210] 本发明的抗体和抗体部分可掺入适合向受试者施用的药物组合物中。通常，所述药物组合物包含本发明抗体或抗体部分以及药学上可接受的载体。如本文使用的，“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等。药学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的组合物中的一种或多种。在许多情况下，所述组合物中包括等渗剂，例如糖类、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠将是优选的。药学上可接受的载体还可包括微量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，它们延长抗体或抗体部分的保存限期或效力。

[0211] 本发明的抗体和抗体部分可掺入适用于胃肠外施用(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)的药物组合物中。本发明的组合物可以为各种形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如，注射溶液和输注溶液)、分散剂或悬浮剂、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。优选形式取决于预期的施用模式和治疗应用。典型的组合物为注射溶液或输注溶液形式，例如类似于用于与其他抗体一起被动免疫接种人类的那些的组合物。所述抗体可通过静脉输注或注射或肌肉内或皮下注射来施用。

[0212] 施用途径和/或模式取决于所期望的结果。在某些实施方案中，活性化合物可用将保护所述化合物避免快速释放的载体制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴片和微胶囊递送系统。可使用可生物降解、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这类制剂的许多方法是专利方法或本领域技术人员公知的方法。参见，例如，Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。

[0213] 补充的活性化合物也可以掺入所述组合物中。在某些实施方案中，本发明抗体或抗体部分可与对治疗OX40失活起有害作用的病症有用的一种或多种其他治疗剂共同配制和/或共同施用。例如，本发明的抗OX40抗体或抗体部分可与结合其他靶标的一种或多种其他抗体(例如结合其他细胞因子或结合细胞表面分子的抗体)共同配制和/或共同施用。此外，本发明的一种或多种抗体可与两种或两种以上的前述治疗剂组合使用。这样的组合治疗可有利地使用较低剂量的所施用的治疗剂，因此避免与各种单一治疗相关的可能的毒性或并发症。熟练医师将理解，当本发明抗体作为组合治疗的一部分使用时，比仅将所述抗体施用于受试者时更低剂量的抗体可能是所期望的(例如通过使用组合治疗可达到协同治疗效果，其反过来允许使用较低剂量的所述抗体而达到所期望的治疗效果)。

[0214] 本发明描述的抗体或其抗原结合部分可单独或组合使用以治疗这些疾病。应该理解的是，这些抗体或其抗原结合部分可单独使用或与其它剂例如治疗剂组合使用，所述其它剂由技术人员选择以达到预期目的。例如，所述其它剂可以是本领域已知的对治疗本文教导的所述抗体所治疗的疾病或病况有用的治疗剂。所述其它剂也可以是赋予所述治疗组合物有益特性的剂，例如影响所述组合物粘度的剂。

[0215] 本文描述的药用组合物可包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明抗体或抗体部分。“治疗有效量”是指达到所期望的治疗结果(在必要的剂量和时间周期)有效的量。抗体或抗体部分的治疗有效量可随各种因素例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体或抗体部分在个体中引起所期望的响应的能力而变化。治疗有效量也可以为抗体或抗体部分的治疗有益效应超过其任何毒性或有害效应的量。“预防有效量”是指达到所期望的预防结果(在必要的剂量和时间周期)有效的量。

[0216] 可调整给药方案以提供最佳的所期望的响应(例如治疗响应或预防响应)。例如，可施用单次大剂量，可随时间施用若干分开的剂量或者可根据治疗情况的需要成比例减少或增加剂量。特别有利的是配制为剂量单位形式的胃肠外组合物以便于施用而且剂量均匀。本文使用的剂量单位形式是适于作为待治疗的哺乳动物受试者的单位剂量的物理独立单位；每个单位含有计算产生所期望治疗效果的预定量活性化合物和需要的药用载体。剂量单位形式的规格取决于或直接取决于(a)活性化合物的独特特性和需要达到的具体治疗效果或预防效果，以及(b)配制领域固有的限制，例如活性化合物在个体中的治疗敏感性。

[0217] 实施例I

[0218] 如附录A和B中所描述的用蛋白A柱将嵌合和人源化106-222IgG1/κ单克隆抗体(分别为Ch222和Hu222)从相应的NS0稳定转染子的培养上清液中纯化。通过两种不同方式将Hu222从柱中洗脱。简单的说，用低pH缓冲液洗脱Hu222批次I以及用Pierce’s Gentle Ag/Ab洗脱缓冲液洗脱批次II。当使用低pH缓冲液洗脱时Hu222的产量较好。Ch222用Gentle Ag/Ab洗脱缓冲液从柱中洗脱。

[0219] 根据标准程序将纯化的Hu222批次I和II抗体与小鼠106-222—起通过SDS-PAGE表征。在还原条件下分析每种抗体5μg。如图21所示，Hu222批次I和II抗体的每一种由具有约50kD分子量的重链和约25kD分子量的轻链组成。Hu222批次I和II抗体的纯度显示超过
95％。

[0220] 用Lonza’s Limulus Amebocyte Lysate(LAL)QCL-1000试剂盒分析人源化抗体中的内毒素杂质。Hu222批次I和II抗体的内毒素水平都小于0.5EU/mg蛋白。

[0221] 与L/OX40细胞结合的Hu106-222的特征

[0222] 小鼠106-222、Ch106-222和Hu106-222抗体与OX40的结合基本上根据由Laura Bover博士提供的方案在FACS结合测定中用L/hOX40细胞进行检测。与L/hOX40细胞结合的抗体用PE标记的山羊抗小鼠IgG抗体(用于小鼠106-222)或PE标记的山羊抗人IgG抗体(用于Ch106和Hu106)进行检测。

[0223] 图22显示对于小鼠106-222、Ch106和Hu106-222(批次II)抗体与L/OX40细胞结合的分析。Hu106-222(批次II)的滴定曲线几乎与Ch106-222的相同，表明小鼠106-222的抗原结合亲和性保留在Hu106-222中。小鼠106-222的滴定曲线与Ch106和Hu106的相似；然而，由于二级抗体的不同，数据仅显示小鼠106-222的亲和性与Hu106-222的相似。

[0224] 图24显示Hu106-222批次I和II抗体与L/hOX40细胞结合的比较。尽管需要进一步的分析，但是两个批次的Hu106-222的亲和性如果不相同那么也显示是彼此相似的。因此，将Hu106-222从蛋白A柱的酸性洗脱似乎不影响其亲和性。

[0225] Ch106-222的纯化

[0226] NS0稳定转染子C8在滚瓶中在500ml的Invitrogen’s Hybridoma SFM培养基中生长至衰竭。将培养物在Corning的250ml离心管(目录号430776)中于Beckman Coulter的Allegra X-12R离心机中旋转离心(2000RPM,15min)。将培养上清液用Pharmacia P1泵上样在1ml GE Healthcare HiTrap MabSelect SuRe柱(目录号11-034-95)上。将柱用Tris缓冲的盐水(Pierce，目录号28379)洗涤并用Pierce的Gentle Ag/Ab洗脱缓冲液(目录号21027)洗脱。收集流份(约1ml)并于280nm读取它们的OD。

[0227]流份编号# 280nm的OD
3 0.12
4 0.30
5 0.18
6 0.11

[0228] 将流份3至6合并(体积＝3.0ml，280nm的OD＝0.14)。将合并的流份在PBS中在10ml Sephadex G25medium柱上脱盐。收集1ml的流份。

[0229]流份编号 280nm的OD
5 0.09
6 0.19

[0230]7 0.12
8 0.12
9 0.00

[0231] 将流份6至9合并(体积＝3.0ml，280nm的OD＝0.11)。将合并的流份在PBS中透析过夜。透析之后，体积为3.0ml且280nm的OD为0.19。该制品称为Ch106，批次8/31/09，具有0.13mg/ml的浓度。

[0232] Hu106-222的纯化

[0233] NS0稳定转染子1-C6于滚瓶中在500ml的Invitrogen的Hybridoma SFM培养基中生长至衰竭。将培养基在Corning的250ml离心管(目录号430776)中于BeckmanCoulter的Allegra X-12R离心机中旋转离心(2000RPM,15min)。

[0234] 批次1：用Pharmacia P1泵将150ml的培养上清液上样至1ml GE HealthcareHiTrap MabSelect SuRe柱(目录号11-034-95)上。将柱用PBS洗涤并且用0.1M甘氨酸-HCl、0.1M NaCl(pH3.0)洗脱结合的抗体。洗脱流份(每个1ml)收集至含有50μl1M Tris-HCl(pH8.0)的管中。

[0235]流份编号 280nm的OD
2 0.88
3 2.84
4 1.29
5 0.63
6 0.18

[0236] 将流份2至5合并(体积＝4.2ml，280nm的OD＝1.59)。将合并的流份在PBS中透析过夜。透析之后，体积为4.2ml且280nm的OD为1.54。将抗体溶液(批次9/18/09I；1.1mg/ml)过滤除菌。

[0237] 批次II：

[0238] 使用Pharmacia Pl泵将剩余的培养上清液(350ml)上样至1ml GE HealthcareHiTrap MabSelect SuRe柱上。将柱用Tris缓冲的盐水洗涤并用Gentle Ag/Ab洗脱缓冲液洗脱。收集流份(约1ml)并于280nm读取它们的OD。

[0239]流份编号 280nm的OD
2 0.12
3 0.85
4 2.17
5 1.47
6 1.02
7 0.81
8 0.66
9 0.54
10 0.44
11 0.46

[0240] 将流份3至7合并(体积＝4.2ml，280nm的OD＝1.22)。将柱用Tris缓冲的盐水洗涤并用0.1M甘氨酸-HCl,0.1M NaCl(pH3.0)洗脱抗体以检测通过GentleAg/Ab洗脱缓冲液的洗脱是否有效。

[0241]流份编号 280nm的OD
1 0.05
2 0.05
3 1.23
4 0.49
5 0.10

[0242] 将用GentleAg/Ab洗脱缓冲液洗脱的流份3至7合并并在PBS中在10mlSephadex G25medium柱上脱盐。收集1ml的流份。

[0243]流份编号 280nm的OD
4 0.38
5 0.96
6 1.38

[0244]7 1,33
8 1.10
9 0.12

[0245] 将流份5至8合并(体积＝4.0ml，280nm的OD＝1.12)。将合并的流份在PBS中透析过夜。透析后，体积为4.0ml且280nm的OD为1.12。将抗体溶液(批次9/18/09II；0.8mg/ml)过滤除菌。

[0246] 使用Pierce的Gentle Ag/Ab洗脱缓冲液的高盐洗脱方法不如低pH方法那么有效地从蛋白A柱洗脱结合的人IgG1抗体。由于使用Gentle Ag/Ab洗脱缓冲液时抗体未在一个尖锐的峰中洗脱，因此有必要合并许多流份以便收集洗脱的IgG并且在透析前将合并的流份脱盐。使用Gentle Ag/Ab洗脱缓冲液的不良的洗脱概况和额外的纯化步骤影响了抗体的产量。建议仅在有待纯化的IgG为酸不稳定的时候使用高盐洗脱方法。

[0247] 实施例II

[0248] Ch119-122and Hu119-122抗体的纯化

[0249] 用蛋白A柱将嵌合119-122IgG1/κ单克隆抗体(Ch119)从Hybridoma-SFM培养基(Invitrogen)中生长的相应的NS0稳定转染子(克隆G11)的培养上清液中纯化。用Pierce的Gentle Ag/Ab洗脱缓冲液洗脱后，通过凝胶过滤和之后的透析将Ch119的缓冲液更换为PBS。Ch119的浓度为0.21mg/ml。

[0250] 用蛋白A柱将人源化119-122IgG1/κ单克隆抗体(Hu122)从Hybridoma-SFM培养基中生长的相应的NS0稳定转染子(克隆2F5)的培养上清液中纯化。将Hu106-222用低pH缓冲液从柱上洗脱，用1M Tris-HCl(pH8.0)中和并在PBS中透析。Hu122的浓度为1.6mg/ml。

[0251] 根据标准程序将纯化的Hu106-222与小鼠119-122一起通过SDS-PAGE表征。在还原条件下分析每种抗体5μg。如图25所示，Hu119-122由具有约50kD分子量的重链和约25kD分子量的轻链组成。Hu119的纯度显示超过95％。

[0252] Hu119-122结合L/hOX40细胞的表征

[0253] 基本上根据由Laura Bover博士提供的方案在FACS结合测定中用L/OX40细胞检测小鼠119-122、Ch119-122和Hu119-122抗体与OX40的结合。用PE标记的山羊抗小鼠IgG抗体(用于小鼠119-122)或PE标记的山羊抗人IgG抗体(用于Ch119-122和Hu119-122)检测与L/OX40细胞结合的抗体。

[0254] 图26显示FACS分析的结果。Hu119-122的滴定曲线与Ch119-122的相似，表明小鼠119-122的抗原结合亲和性保留在Hu119-122中。然而，较高抗体浓度的Ch109-122和Hu119-
122时的MCF值没有正确落入相应曲线。调整实验条件后，应重复FACS分析。

[0255] 实施例III

[0256] 为了评估我们的人源化抗人OX40抗体增强T细胞增殖的能力，我们使用抗CD3包被+的CD32-L细胞和新鲜分选的幼稚CD4T细胞进行增殖测定。图27显示人源化抗人OX40mAb克隆119-122(Hu122)及其结合FcR的突变抗体(Hu122-AA)增强幼稚CD4+T细胞增殖。与亲本小鼠抗人OX40mAb(小鼠122)相比Hu122产生较好的T细胞刺激活性(图27)。

[0257] 结合FcR的突变人源化抗人OX40mAb克隆106-222(Hu222-AA)和嵌合的抗人+
OX40mAb克隆106-222(Ch222)增强抗CD3刺激的幼稚CD4 T细胞增殖。与亲本小鼠抗人OX40mAb(小鼠106-222)相比，这些抗体具有相似的刺激活性。然而，完全人源化的抗人OX40Ab，Hu106，不增强T细胞增殖(图28)。

[0258] 为了评估人源化抗人OX40抗体阻断CD4+调节型T细胞(Treg)抑制性功能的能力，我们使用新鲜分选的幼稚CD4+T细胞和CD4+CD25高CD127低Treg进行了增殖测定。我们发现嵌合抗体Ch122和结合Fc的突变的人源化抗体(Hu122-AA)在阻断CD4+Treg抑制性功能上表现出比亲本小鼠抗人OX40mAb(小鼠122)更好的效力(图29A-B)。

[0259] 在图27的实验中，将新鲜分选的CD4+CD25低CD127+CD45RO-CD45RA+幼稚T细胞用由四种浓度的抗CD3抗体加上2μg/ml的抗人OX40Ab克隆119抗体或对照抗体包被的表达CD32的L细胞(CD32-L)刺激。刺激后三天，加入放射性同位素氚并且在细胞收获前培养另外16-18h。数据代表来自两个供体的实验。表达hOX40配体的CD32-L细胞(CD32-L/hOX40L)作为阳性对照，而人和小鼠IgG1作为阴性对照。

[0260] 在图28的实验中，将新鲜分选的幼稚CD4+T细胞用由四种浓度的抗CD3抗体加上2μg/ml的抗人OX40mAb克隆106-222(Hu222)抗体或对照抗体包被的CD32-L细胞刺激。刺激后三天，加入放射性同位素氚并且在细胞收获前培养另外16-18h。数据代表来自两个供体的实验。CD32-L/hOX40L作为阳性对照，而人和小鼠IgG1作为阴性对照。

[0261] 在图29的实验中，将新鲜分选的幼稚CD4+T细胞在CD4+CD25高CD127低Treg存在的情况下以三种Treg:T效应子比例培养和并且用由0.2μg/ml的抗CD3抗体加上10μg/ml的抗人OX40mAb克隆119-122抗体或对照抗体包被的CD32-L细胞刺激。刺激后三天，加入放射性同位素氚并且在细胞收获前培养另外16-18h。数据代表三个实验。CD32-L/hOX40L作为阳性对照，而人和小鼠IgG1作为阴性对照。

[0262] 实施例IV

[0263] 由于抗体在经由静脉注射给予患者时将遇到全部外周血单核细胞(PBMC)，因此我们在我们的增殖测定中使用PBMC作为抗原呈递细胞(APC)测试了我们的抗人OX40抗体刺激T细胞增殖的能力。然而，我们在使用PBMC作为APC时用我们的小鼠抗人OX40mAb获得高度变化的数据其在使用单核细胞作为APC时未见到，表明我们的抗体需要某种利于活性的交联。为了测试这种可能性，将板用我们的抗人OX40mAb和抗CD3包被，洗涤，并用于在辅佐细胞不存在的情况下刺激CD4+或CD8+T细胞增殖。图30显示抗人OX40抗体增强CD4+和CD8+T细胞增殖的结果。

[0264] 将新鲜分选的1×105个CD4+CD25低CD45RO-CD45RA+幼稚T细胞(图30Α)或CD3+CD8+T细胞(图30Β)用结合板的抗CD3(3μg/ml)和抗人OX40小鼠mAb(2μg/ml)刺激。在培养第三天加入氚化胸腺嘧啶并在孵育另外15小时后收获细胞。通过胸腺嘧啶掺入评估T细胞的增殖。抗人OX40mAb来源于三个杂交瘤融合。融合数目之后的数目表示特定的抗体。小鼠IgG1和
119-42作为阴性对照。每个处理一式三份进行。显示来自4个T细胞供体的代表性数据(图
30C)。所有三种人源化抗人OX40mAb[Hu106-222和Hu119-122；Hu106-222AA和Hu119-122AA(AA表示两个结合Fc的残基突变为氨基酸丙氨酸)；和Ch119-122(除了小鼠可变区“互补位”被保留之外，类似于人源化119-122)]刺激幼稚CD4+T细胞增殖。抗CD28作为阳性对照。

[0265] 如图30所示，图板A和B显示结合板的小鼠抗人OX40mAb以10至40倍的范围有力地刺激幼稚CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖。我们将我们的实验延伸到我们的人源化抗人OX40mAb并且发现我们的三种版本的人源化抗体，无论是完全人源化的、嵌合的或具有其中负责结合Fc受体的残基被改变为丙氨酸的AA突变体，都是幼稚CD4+T细胞增殖的有力的刺激剂(图30C)。

[0266] 图31显示小鼠和人源化抗人OX40抗体需要交联以便增强T细胞增殖。将新鲜分选的幼稚CD4+T细胞用结合板的抗CD3(3μg/ml)加上结合板的或溶解的人源化抗人OX40mAb(2μg/ml)在辅佐细胞不存在的情况下刺激。在培养第三天加入氚化胸腺嘧啶并在孵育另外15小时后收获细胞。通过胸腺嘧啶掺入评估T细胞的增殖。小鼠IgG1和抗CD28分别作为阴性对照和阳性对照。显示来自于两个供体的代表性数据。将幼稚CD4+T细胞在辅佐细胞不存在的情况下用结合板的抗CD3刺激。第二天，将抗人OX40mAb119-122(2μg/ml)单独或与等量的抗Fc第二抗体组合加入。如图板A中所描述的评估细胞增殖。

[0267] 将我们的人源化抗人OX40mAb Hu106-222和Hu119-122的效力与抗CD28的相比较。相比之下，当将溶解的抗人OX40抗体加至T细胞培养物时，刺激性效应被终止(图31A)。然而，当将溶解的抗人OX40mAb119-122与F(ab’)2片段山羊抗小鼠IgG、Fc片段特异性二级抗体一起加入时，刺激性效应被恢复(图31B)。这些结果证实抗人OX40mAb需要交联以便它们的生物学活性。丨

[0268] 为了评估我们的激动型的抗人OX40mAb阻断CD4+CD25高CD12T nTreg的抑制性功能的能力，我们在CD4+CD25低CD127+CD45RO+T效应子细胞(Teff)和CD4+nTreg存在的情况下进行增殖测定。通过使用我们的结合板的系统(其中抗人OX40mAb与抗CD3—起被包被在板上)并且在辅佐细胞不存在的情况下，我们的抗人OX40小鼠mAb中的十二个(222、132、8B、33A、43、58B、122、157A、173B、220C、140A、270)有力地抑制nTreg抑制(图32A和32B)。尽管在这些测定中所用的nTreg与T效应子细胞的比例是1:1，但是这些抗体能够在nTreg不存在的情况下刺激T效应子细胞增殖超过由T效应子细胞获得的百分比10至35个百分比。我们的人源化抗人OX40mAb同样以相似的水平逆转nTreg的抑制性功能(图32C)。这些结果结合在一起表明我们的抗人OX40小鼠mAb是OX40的有力刺激剂，导致T细胞增殖的显著增强和nTreg抑制性功能的抑制。此外，我们的人源化抗人OX40mAb保留了它们的亲本小鼠抗体的有力的生物活性。

[0269] 图32显示抗人OX20mAb阻断CD4+FOXP3+nTreg的活性。CFSE标记的CD4+CD25-CD45RO+T效应子细胞和CD4+FOXP3+Treg来自于相同的健康供体。将T细胞用溶解的抗CD28(0.5μg/ml))和结合板的抗CD3(3μg/ml))和抗人OX40mAb(2μg/ml)刺激。通过对CFSE稀释的流式细胞术评估T效应子细胞的增殖。nTreg与T效应子细胞的比例是1:1。小鼠IgG1作为阴性对照。幼稚CD4+T细胞作为对照T细胞以证实T效应子细胞增殖被nTreg的特异性抑制。图32A是代表性的FACS数据，显示在幼稚CD4+T细胞、nTreg或nTreg加上抗人OX40mAb119-33A存在的情况下T效应子细胞的增殖。图32B显示在用小鼠抗人OX40mAb处理后的nTreg存在的情况下T效应子细胞增殖的百分比(测试20个)。图32C显示所有三种版本的人源化抗人OX40mAb恢复T效应子细胞的增殖。

[0270] 近来的报道表明，OX40触发可诱导表达OX40的人T细胞系的凋亡(Yoshiaki Takahashi et aI.,200B,Aids Research and human Retroviruses,24)。我们因此测试了在单核细胞存在的情况下逐渐增加浓度的抗人OX40mAb106-222加上固定的低剂量的抗CD3对三种T细胞亚类的存活的影响。图33A显示高浓度的抗人OX40mAb106-222(20-30μg/ml)优+选地杀死活化的FOXP3 nTreg而活化的幼稚和记忆CD4+T对这一效应具有抗性或较低的敏感性。为了测试抗人OX40mAb是否直接作用于Treg以诱导细胞死亡，我们在辅佐细胞不存在的情况下进行了新的实验。图33B显示与抗CD3组合的强的OX40信号传导在辅佐细胞不存在的情况下特异性杀死nTreg。为了证实抗人OX40mAb介导的杀死效应模拟经由天然OX40配体的OX40触发，我们使用过量表达hOX40L的小鼠成纤维L细胞系并将其用于在低剂量抗CD3存在的情况下刺激nTreg并且获得对nTreg的相似的杀死效应(图33C)。这些结果表明强的OX40触发杀死表达OX40的Treg细胞。

[0271] 特别地，图33显示高浓度的抗人OX40mAb优先杀死FOXP3+Treg。在图33A中，T细胞亚类(幼稚的，CD4+CD25低CD127+CD45RO-CD45RA+；记忆的，CD4+CD25低CD127+CD45RA-CD45RO+和nTreg，CD4+CD25高CD127低)每种与等比例的CD14+单核细胞在溶解的抗CD3(0.3μg/ml)和逐渐增加浓度的小鼠抗人OX40mAb106-222存在的情况下培养。培养3天后通过流式细胞术分析测定细胞活力，对有活力的淋巴细胞设门。显示来自两个T细胞供体的数据。图33B和33C显示OX40的强触发杀死CD4+FOXP3+Treg。图33B显示将CD4+FOXP3+Treg用结合板的抗CD3(2μg/ml)加上溶解的119-122mAb(30μg每百万个细胞)或小鼠IgG1对照抗体刺激。用血细胞计数+ +器计数培养一天后的台盼蓝阴性活细胞。图33C显示将CD4FOXP3Treg用溶解的抗CD3(0.2μg/ml)加上L细胞或表达hOX40配体的L细胞(L/hOX40L)刺激。刺激一天之后计数活细胞。

[0272] 接下来我们试图确定抗人OX40mAb是否直接作用于T细胞以阻断nTreg抑制性功能。将新鲜分选的CD4+T效应子细胞或nTreg用抗CD3预活化过夜并且之后用抗人OX40mAb冲+击4小时。之后将T效应子细胞洗涤、用CFSE标记并在等量的CD14 单核细胞和抗CD3存在的情况下与nTreg共培养。相似地，将预刺激的nTreg洗涤并与未处理的CFSE标记的T效应子细胞一起培养。

[0273] 图34显示抗人OX40mAb直接作用于T细胞以阻断Treg的抑制性功能。图34A显示抗人OX40mAb直接作用于效应子记忆T细胞以赋予它们对经由nTreg的抑制的抗性。将CD4+CD25低CD127+CD45RA-CD45RO+记忆T细胞用结合板的抗CD3(0.8μg/ml)在培养基(RPMI/10％FCS/P/S加上30IU/ml的IL-2)中刺激12小时，之后在培养基中用抗人OX40mAb(119-122，22μg每50万个细胞)冲击4小时，洗涤3次并且将8×104个CFSE标记的效应子T细胞与逐渐降低比例的nTreg一起培养。通过对CFSE稀释的流式细胞术评估效应子T细胞的增殖。抗人OX40mAb作用于Treg使得它们不能够抑制T效应子细胞增殖(图34B)。将CD4+CD25高CD127低nTreg在培养基中用结合板的抗CD3(2μg/ml)预刺激12小时，之后用抗人OX40mAb，119-122或106-222，或对照抗体，抗ICOS或小鼠IgG1冲击，如图板A中所描述的，洗涤并用CFSE标记的T效应子记忆细胞培养。通过对CFSE稀释的流式细胞术评估T效应子细胞的增殖。

[0274] 用抗人OX40mAb处理的T效应子细胞变得对经由nTreg细胞的抑制有抗性(图34A)。相比之下，用小鼠IgG1对照抗体处理的T效应子细胞的增殖仍然对经由nTreg的抑制敏感。
图34B显示用抗人OX40mAb处理的nTreg不能够抑制T效应子细胞的增殖。相比之下，用对照抗体例如抗I COS或小鼠IgG1处理的nTreg保持抑制性。这些结果表明我们的抗人OX40mAb直接作用于T效应子细胞和nTreg两者以恢复T效应子细胞增殖。

[0275] 实施例V

[0276] 补充的体内预备数据显示在小鼠中起作用的抗人OX40抗体增强小鼠中的T细胞扩增和肿瘤排斥。之前显示了抗人OX40mAb可在用人OX40转导的小鼠CD8+T细胞中特异地活化+NF-κB级联。为了确定抗hOX40mAb是否能够通过促进效应子CD8T细胞体内存活和克隆扩增来增强肿瘤排斥，将用荧光素酶基因和hOX40转导的转基因Pmel CD8+T细胞适应性地转移至负载无色素MC38肿瘤的C57BL/6白化病小鼠中。适应性地转移所转导的T细胞之后，将小鼠用Ab处理。发现，与用IgG1对照抗体处理的小鼠相比，在用抗hOX40mAb处理的小鼠中在第
4天有明显更多的人OX40+荧光素酶+Pmel T细胞转移至肺中(图35B)，表明小鼠中的hOX4触发促进CD8+T细胞扩增。在处理后第8天(数据未显示)和第12天，发现用抗hOX40mAb处理的同组小鼠与用IgG1处理的对照组小鼠相比在肿瘤位点保留明显更多的荧光素酶+Pmel T细胞(图35B)，再次表明小鼠中的hOX40触发促进CD8+T细胞存活。最后，接受hOX40+Pmel CD8+T细胞并随后用抗hOX40mAb处理的小鼠的肿瘤尺寸与接受未转导的Pmel T细胞并用抗hOX40mAb或hOX40+PmelT细胞处理之后用对照小鼠IgG1匹配抗体处理的小鼠的那些相比明显更小。这些结果显示小鼠中人OX40的触发导致与小鼠OX40的那些(Gough MJ et，2008)相似的生物学效应。因此，所述数据证明了抗人OX40mAb刺激CD+T细胞体内扩增和存活并增强肿瘤排斥的能力。

[0277] 抗人OX40mAb促进T细胞体内扩增和存活。

[0278] 我们的治疗性疫苗接种方案示于图35A中。将5只一组的C57BL/6白化病小鼠用5×105个无色素的MC38/gp100肿瘤细胞皮下(S.C)植入(第0天)。在第6天，通过施用350cGy剂量的放射诱导淋巴细胞减少。在第7天，将1×106个具有或不具有人OX40表达的荧光素酶转导的Pmel-1T细胞适应性地转移至负载肿瘤的小鼠中(n＝5只每组)，之后静脉注射5×
5
10Gp100肽脉冲的DC。T细胞转移后将重组的人IL-2腹膜内施用3天。在第7、9和11天分别以每只小鼠每次注射100，50和50μg抗体进行施用(图35B)。体内生物发光成像显示在第4和12天表达荧光素酶的CD8+pmel-1T细胞在肺和肿瘤位点的累积。在第4天和12天时每组五只小鼠中的两只被显示(图35C)。肿瘤响应于使用抗hOX40mAb的处理。每3天测量肿瘤尺寸。
Pmel-1和Pmel-1加上小鼠IgG1作为对照。

[0279] 实施例VI

[0280] 小鼠119-43-1可变区基因的克隆和测序

[0281] 将小鼠119-43-1杂交瘤细胞在含20％胎牛血清(FBS；HyClone,Logan,UT)、10mM HEPES(Sigma,St.Louis,MO)、2mM谷氨酸盐(Mediatech,Herndon,VA)、1mM丙酮酸盐(Mediatech)、1×MEM非必需氨基酸(Sigma)、1×HT混合物(Sigma)、1×青霉素-链霉素混合物(Mediatech)和50μMβ-巯基乙醇(bioWORLD,Dublin,OH)的DME培养基中，于37℃、7.5％CO2培养箱中生长。根据供应商的方案，使用TRIzol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)从大约107个杂交瘤细胞中提取总RNA。使用SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech,Mountain View,CA)按照供应商的方案合成用于5’-RACE的以Oligo dT为引物的cDNA。119-43-1重链和轻链的可变区cDNA使用分别与小鼠γ-1和κ链恒定区退火的3’引物和SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒中提供的5’-RACE引物(通用引物A混合物或者巢式通用引物A)、用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs,Beverly,MA)、通过聚合酶链反应(PCR)进行扩增。对于重链可变区(VH)的PCR扩增，所述3’引物具有序列5'-GCCAGTGGATAGACAGATGG-3'。对于轻链可变区(VL)的PCR扩增，所述3’引物具有序列5'-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3'。将所扩增的VH和VL cDNA亚克隆至pCR4Blunt-TOPO载体(Invitrogen)以进行序列确定。在Tocore(Menlo Park,CA)进行DNA测序。测序若干重链和轻链克隆并鉴定唯一的与典型的小鼠重链可变区和轻链可变区同源的序列。119-43-1VH和VL的一致cDNA序列连同推导出的氨基酸序列分别示于图44和45中。在成熟的119-43-1VH和VL氨基酸序列中没有注意到不寻常的特征。119-43-1VH的cDNA序列和推导出的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:28和29所表示。119-
43-1VL的cDNA序列和推导出的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:35和36表示。

[0282] 嵌合的119-43-1IgG1/κ抗体的构建

[0283] 编码119-43-1VH的基因通过使用119-43-1VH cDNA作为模板、5’-GCTACTAGTACCACCATGTACTTGGGACTGAACTATG-3’(SpeI位点为下划线的)作为5’引物和5’-GGGAAGCTTGTTTTAAGGACTCACCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCC-3’(HindIII位点为下划线的)作为3’引物的PCR作为包括剪接供体信号和适当的侧翼的限制性酶切位点的外显子而生成。
所述VH基因中的HindIII位点通过定点诱变而消除。设计的119-41-1VH的cDNA和推导出的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:30和31表示。编码119-43-1VL也通过使用119-43-1VL cDNA作为模板、5’-GCAGCTAGCACCACCATGAGACCGTCTATTCAGTTC-3’(NheI位点为下划线的)作为5’引物和5’-GCAGAATTCAGAAAAGTGTACTTACGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCC-3’(EcoRI位点为下划线的)作为3’引物的PCR作为包括剪接供体信号和适当的侧翼的限制性酶切位点的外显子而生成。设计的119-41-1VL的cDNA和推导出的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:37和38表示。所述119-43-1VH和VL外显子的剪接供体信号分别来自小鼠种系JH2和Jκ5序列。PCR扩增片段使用NucleoSpin Extraction II试剂盒(Macherey-Nagel,Bethlehem PA)进行胶纯化并被克隆至pCR4Blunt-TOPO载体(Invitrogen)用于序列确认。正确的V片段用SpeI和HindIII(对于VH)或NheI和EcoRI(对于VL)进行消化、胶纯化并被克隆至携带人γ-1和κ恒定区的哺乳动物表达载体以产生嵌合的119-43-1IgG1/κ抗体。所得表达载体pCh119-43-1的图示结构示于图48中。

[0284] 产生NS0稳定转染子的嵌合119-43-1IgG1/κ抗体的生成

[0285] 为了获得稳定产生Ch119-43-1抗体的细胞系，将表达载体pCh119-43-1引入小鼠骨髓瘤细胞系NS0(European Collection of Animal Cell Cultures,Salisbury,Wiltshire,UK)的染色体中。NS0细胞在含10％FBS的DME培养基中于37℃、7.5％CO2的培养箱中生长。向NS0的稳定转染通过Bebbington et al.(Bio/Technology10:169-175,1992)中描述的电穿孔进行。在转染前，将pCh119-43-1载体使用FspI进行线性化。大约107个细胞用悬浮在含10％FBS的DME培养基中的20μg的线性化质粒转染，并被接种到若干96孔板。48小时后，应用选择培养基(含10％FBS、HT培养基补充物(Sigma)、0.25mg/ml黄嘌呤和1μg/ml霉酚酸的DME培养基)。在选择开始后大约10天，测定培养基上清的抗体产生。

[0286] Ch119-43-1抗体的表达通过夹心ELISA测量。在典型的实验中，将ELISA板在PBS中用100μl/孔的1/2,000稀释的山羊抗人IgG Fcγ链特异的多克隆抗体(Sigma)在4℃包被过夜，用洗涤缓冲液(含0.05％吐温20的PBS)洗涤，并用300μl/孔的封闭缓冲液(含2％脱脂牛奶和0.05％吐温20的PBS)在室温封闭30min。用洗涤缓冲液洗涤后，将100μl/孔的适当地在ELISA缓冲液(PBScontaining1％Skim Milk and0.025％Tween20)中稀释的样品施加于所述ELISA板。适当人源化的IgG1/κ抗体用作标准。在将所述ELISA板在室温孵育1小时并用洗涤缓冲液洗涤后，使用100μl/孔的1/2,000稀释的HRP共轭的山羊抗人κ链多克隆抗体(SouthernBiotech,Birmingham,AL)检测结合的抗体。在室温孵育30min并用洗涤缓冲液洗涤后，通过加入100μl/孔的ABTS底物(bioWORLD)进行显色。通过加入100μl/孔的2％草酸停止显影。吸光度在405nm处读出。使用Hybridoma SFM(Invitrogen)使产生NS0稳定转染子的高水平的Ch119-43-1抗体(NS0-Ch119-43-11-C6)适合于在无血清的培养基中生长。

[0287] 重链和轻链在NS0-Ch119-43-11-C6中产生的真实性通过cDNA测序确认。按照供应商的方案，使用TRIzol试剂(Invitrogen)从细胞中提取总RNA，并使用SuperScript III第一链合成系统合成以oligo dT为引物的cDNA用于RT-PCR(Invitrogen)。γ-1重链的编码区通过使用CMV3和JNT082，以及JNT097和JNT098作为引物组和Phusion DNA聚合酶的两个PCR反应进行扩增(图48)。将PCR片段进行胶纯化并用CMV3(SEQ ID NO:39)、JNT082(SEQ ID NO:41)、JNT097(SEQ ID NO:42)和JNT098(SEQ ID NO:43)作为引物进行测序。同样地，κ轻链的编码区使用CMV3和JNT026(SEQ ID NO:40)进行扩增(图49)。将胶纯化的DNA片段用CMV3和JNT026作为引物进行测序。所获得的每个Ch119-43-1重链和轻链的编码区的核苷酸序列与pCh119-43-1中的相应序列完美匹配(图50和51)。pCH119-43-1中的重链的编码区的核苷酸和氨基酸序列分别由SEQ ID NO:44和45表示。pCH119-43-1中的轻链的编码区的核苷酸和氨基酸序列分别由SEQ ID NO:46和47表示。

[0288] Ch119-43-1抗体的纯化

[0289] NS0-Ch119-43-11-C6细胞在滚瓶中在450ml的Hybridoma-SFM中生长至约106个/ml的密度，供应50ml溶解于SFM4MAb培养基(HyClone中的60mg/ml的Ultrafiltered Soy Hydrolysate(Irvine Scientific,Santa Ana,CA)，并进一步生长直到细胞存活率小于50％。离心和过滤后，将培养上清液上样至蛋白-A Sepharose柱(HiTrap MABSelect SuRe,GE Healthcare,Piscataway,NJ)上。在将抗体用0.1M甘氨酸-HCl(pH3.0)洗脱前，将所述柱用PBS洗涤。在用1M Tris-HCl(pH8)中和后，将洗脱抗体的缓冲液通过透析改为PBS。抗体浓度通过测量280nm处的吸光度进行测定(1mg/ml＝1.4OD)。产量为5mg。

[0290] 纯化的Ch119-43-1根据标准程序通过SDS-PAGE进行表征。在还原条件下的分析表明，Ch119-43-1由具有约50kDa分子量的重链和具有约25kDa分子量的轻链组成(图52)。抗体的纯度显示超过95％。

[0291] Ch119-43-1抗体的表征

[0292] Ch119-43-1抗体与OX40的结合使用稳定表达人OX40的小鼠成纤维细胞系(L/OX40)通过流式细胞术进行检测。在典型的实验中，将各种浓度的Ch119-43-1与105L/OX40细胞在含有0.5％BSA和0.05％NaN3(FACS缓冲液)的PBS中在4℃孵育1小时。然后将细胞用冰冷的FACS缓冲液洗涤并与FITC标记的山羊抗人IgG抗体在4℃孵育30min。在用FACS缓冲液洗涤后，使用FACScan流式细胞分析仪(BD Biosciences,San Jose,CA)分析染色的细胞。结果示于图53中。使用GraphPad Prism(GraphPad Software,San Diego,CA)计算的Ch119-
43-1的EC50值为0.96μg/ml。