百合通过体细胞胚胎发生途径脱毒的方法

摘要

本发明公开了一种百合通过体细胞胚胎发生途径脱毒的方法，包括如下步骤：1）胚性愈伤组织诱导：以无菌条件下培养的百合鳞片作为外植体，诱导培养出胚性愈伤组织。2）胚性愈伤组织的选择性继代培养：选择由胚性愈伤组织产生的新生球形体细胞胚胎作为继代材料。3）球形体细胞胚胎的继代培养：球形体细胞胚胎接种于固体增殖培养基或液体增殖培养基中进行继代培养，直到继代培养的体细胞胚胎中未检测出病毒为止。本发明操作方法简单，由普通实验员对拟脱毒材料进行多次继代即可，对试验条件和操作人员的要求不高。通过体细胞胚胎的快速繁殖，可彻底脱去病毒，脱毒效果较好。

权利要求

1.百合通过体细胞胚胎发生途径脱毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）胚性愈伤组织诱导：以无菌条件下培养的百合鳞片作为外植体，接种于胚性愈伤组织诱导培养基上，暗光培养28天，诱导培养出胚性愈伤组织；

2）胚性愈伤组织的筛选：对步骤1）中得到的胚性愈伤组织进行筛选，选择出球形体细胞胚胎作为继代材料；

3）球形体细胞胚胎的继代培养：将步骤2）中筛选出来的球形体细胞胚胎接种于固体增殖培养基或液体增殖培养基中进行第一代继代培养，温度保持在24±2℃，暗光培养14天，得到第一代继代培养体细胞胚胎；

在第一代继代培养体细胞胚胎中筛选出新产生的球形体细胞胚胎，将其接种于固体增殖培养基或液体增殖培养基中进行第二代继代培养，温度保持在24±2℃，暗光培养14天，得到第二代继代培养体细胞胚胎；如此循环，直到继代培养的体细胞胚胎中未检测出病毒为止；

-1

其中，所述胚性愈伤组织诱导培养基的组成为：MS培养基+ PIC 1~3mg·L +琼脂 -1 -1

7g·L +蔗糖30g·L ，pH值为5.8；

-1 -1

所述固体增殖培养基的组成为：MS培养基+PIC 1~2mg·L +琼脂 7g·L +蔗糖-1

30g·L ，pH值为5.8；

-1 -1

所述液体增殖培养基的组成为：MS培养基+PIC 1~2mg·L +蔗糖30g·L ，pH值为

5.8。

2.根据权利要求1所述的百合通过体细胞胚胎发生途径脱毒的方法，其特征在于，所-1述液体增殖培养基添加在生物反应器中，生物反应器的气流量保持在20mlmin 。

3.根据权利要求2所述的百合通过体细胞胚胎发生途径脱毒的方法，其特征在于，所述球形体细胞胚胎的筛选采用孔径为0.5-1.0 mm的筛子进行筛选。

说明书

百合通过体细胞胚胎发生途径脱毒的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及百合脱毒育种技术领域，具体涉及一种百合通过体细胞胚胎发生途径脱毒的方法。

背景技术

[0002] 百合作为吉祥之花，素有百年好合之意而深受人们喜爱。香水百合为百合中的女王，因其香气宜人，更为鲜切花中之精品，送人之首选。近年来，百合切花是继世界五大切花（月季、香石竹、菊花、唐菖蒲、非洲菊）之后的一支新秀，也是目前世界上最受欢迎的切花之一。然而，百合种植过程中最大的问题就是百合的品种退化问题——病毒是其主因之一。在百合中，常见的病毒有黄瓜花叶病毒（Cucumber Mosaic Virus,CMV）、郁金香碎锦病毒 （Tulip Breaking Virus,TBV）、百合无症病毒（Lily Symptomless Virus,LSV）等十余种，这些病毒可通过蚜虫的叮咬或土壤线虫进行传播。受病毒感染的百合表现出生长势减弱，植株矮化，提早开花，花朵畸形、变小、花色减退，早春叶片出现花叶、皱缩、扭曲、顶斑、坏死等现象，严重影响了百合鲜切花的产量和品质，为百合鲜切花的生产、销售，尤其是出口带来很大的威胁。百合病毒在其组织体内的扩散速度非常快，百合一旦感染病毒，则终身带毒，长期受害；再加上蚜虫等昆虫介体传播，病毒在各植株之间迅速扩散侵染，扩大了危害范围。对于百合病毒，目前尚难以采用化学药剂或生物制剂进行直接有效的防治。因此，防止百合感染病毒病的应对策略是采用脱毒培养技术获得脱毒苗，隔离繁殖、生产健康种球。

[0003] 目前，百合的脱毒方法主要有：茎尖培养、热处理和抗病毒药剂法等三种。茎尖培养脱毒原理是植物分生组织新产生的细胞不具有病毒，植物体内病毒只能通过维管束系统移动，分生组织中没有维管束，病毒只能靠胞间连丝移动，速度很慢，难以追上生长活跃的分生组织，所以旺盛生长的根尖、茎尖一般都无病毒或很少有病毒分布。在利用茎尖培养进行百合脱毒时，只有在剥取大小为0.3~0.5mm的茎尖或茎尖分生组织时，才有可能获得脱毒苗。由于剥离的茎尖小，需要在解剖镜下操作，操作难度大，而且接种后微小茎尖由于受到剥离时的物理性损伤，难以成活，脱毒率也较低。热处理是依据在高温下病毒出现钝化，其复制明显减弱或不再繁殖。一般来说，温度越高、持续时间越长，脱毒效果越好，但同时植株的成活率也越低。抗病毒药剂法的作用原理是抗病毒药剂在三鳞酸状态下会阻止病毒RNA帽子结构的形成。抗病毒抑制剂在早期破坏RNA聚合酶的形成，在后期破坏病毒外壳蛋白的形成，阻止病毒的繁殖，达到脱毒目的。热处理和抗病毒药剂法一般都需要与茎尖培养结合使用。茎尖培养操作复杂、接种后茎尖容易发生褐化，成活率低。因此，传统脱毒方法需要对试验材料进行物理或化学的抑制性处理，脱毒成功与否与人工切离的分生组织大小有关，受环境和人为因素的影响较大，存在脱毒不彻底的问题。

发明内容

[0004] 针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种百合通过体细胞胚胎发生途径脱毒的方法，简化了脱毒流程，减小操作人员和培养环境对脱毒结果的影响。

[0005] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

[0006] 百合通过体细胞胚胎发生途径脱毒的方法，包括如下步骤：

[0007] 1）胚性愈伤组织诱导：以无菌条件下培养的百合鳞片作为外植体，接种于胚性愈伤组织诱导培养基上，暗光培养28天，诱导培养出胚性愈伤组织。

[0008] 2）胚性愈伤组织的筛选：对步骤1）中得到的胚性愈伤组织进行筛选，选择出新产生的球形体细胞胚胎作为继代材料。

[0009] 3）球形体细胞胚胎的继代培养：将步骤2）中筛选出来的球形体细胞胚胎接种于固体增殖培养基或液体增殖培养基中进行第一代继代培养，温度保持在24±2℃，暗光培养14天，得到第一代继代培养体细胞胚胎。

[0010] 在第一代继代培养体细胞胚胎中筛选出新产生的球形体细胞胚胎，将其接种于固体增殖培养基或液体增殖培养基中进行第二代继代培养，温度保持在24±2℃，暗光培养14天，得到第二代继代培养体细胞胚胎；如此循环，直到继代培养的体细胞胚胎中未检测出病毒为止。

[0011] 其中，所述胚性愈伤组织诱导培养基的组成为：MS培养基+ PIC 1~8mg·L-1+琼-1 -1脂 7g·L +蔗糖30g·L ，PH值为5.8。

[0012] 所述固体增殖培养基的组成为：MS培养基+PIC 1~4mg·L-1+琼脂 7g·L-1+蔗-1糖30g·L ，PH值为5.8。

[0013] 所述液体增殖培养基的组成为：MS培养基+PIC 1~4mg·L-1+蔗糖30g·L-1，PH值为5.8。

[0014] 进一步，所述液体增殖培养基添加在生物反应器中，生物反应器的气流量保持在-120ml•min 。

[0015] 更进一步，所述球形体细胞胚胎的筛选采用孔径为0.5-1.0 mm的筛子进行筛选。

[0016] 相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

[0017] 1、本发明操作方法简单。在脱毒过程中，无需对试验材料进行高温或病毒唑的繁琐的前处理，无需切取体积为0.3~0.5 mm微小分生组织等特定操作，由普通实验员对试验材料进行多次继代即可，对试验条件和操作人员的要求不高。通过体细胞胚胎的快速增殖，可彻底脱去病毒，脱毒效果较好。

[0018] 2、缩短培养时间。传统方法中0.3~0.5 mm的拟脱毒材料必须经过长期培养方可达到病毒检测最少样本量，本发明体细胞胚胎发生途径脱毒方法通过体细胞胚胎的快速增殖在相对较短的时间内即可满足病毒检测最少量样本量的要求。

[0019] 3、提高脱毒效率。传统脱毒方法的脱毒结果无保障，受人为和环境影响较大。每个分生组织切割的大小不同导致其脱毒效果不同，因此需要对每个分生组织进行病毒检测，如病毒检测发现仍含有病毒，则该分生组织无用，长期培养工作无效。体细胞胚胎脱毒方法中，可对不同继代次数的体细胞胚胎进行检测，如未脱去病毒，可继续进行增殖培养直至脱去病毒。如脱去病毒，亦可进行增殖培养，短期内实现脱毒材料的大量繁殖，不浪费材料。

[0020] 4、脱毒效果好。传统脱毒方法受人为和环境影响较大，这取决于茎尖分生组织切取的大小，切取得大些，病毒不能彻底脱除；切取得小些，茎尖无法成活。往往存在脱去一种病毒，其他种病毒未脱去的现象。体细胞胚胎脱毒受人为和环境影响较小，脱毒效果较好，可同时脱去多种病毒。

附图说明

[0021] 图1为胚性愈伤组织在含有PIC2 mg·L-1的液体培养条件下胚性愈伤组织的生长表现。

具体实施方式

[0022] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。

[0023] 实施例一：

[0024] 百合通过体细胞胚胎发生途径脱毒的方法，包括如下步骤：

[0025] 1）胚性愈伤组织诱导：以无菌条件下培养的百合鳞片作为外植体，接种于胚性愈伤组织诱导固体培养基上，培养28天，诱导培养出胚性愈伤组织。

[0026] 其中，胚性愈伤组织诱导培养基的组成为：MS培养基+PIC 1~3mg·L-1+琼-1 -1脂 7g·L +蔗糖30g·L ，PH值为5.8。PIC为植物生长调节剂中的一种，其英文全称为Picloram，中文名称为毒莠定。

[0027] 胚性愈伤组织诱导培养基是在MS基本培养基中加入7g·L-1琼脂和30g·L-1蔗糖，保持PH值为5.8，并加入以下配方的物质：

[0028]PIC（mg·L-1）BA（mg·L-1） NAA（mg·L-1）效果
配方1 1 0 0 鳞片基部形成较少愈伤组织，伴有少量小仔球分化，胚性愈伤组织得率较低
配方2 2 0 0 鳞片基部形成较多结构疏松的愈伤组织，无小仔球分化，胚性愈伤组织得率较高
配方3 3 0 0 鳞片形成大量结构紧密的愈伤组织，无小仔球分化，胚性愈伤组织得率较高
对比配方1 1 2 1 鳞片基部形成大量愈伤组织，伴有大量小仔球分化，胚性愈伤组织得率较低，并与非胚性愈伤组织混生
对比配方2 2 2 1 鳞片基部形成大量愈伤组织，伴有少量小仔球分化，胚性愈伤组织得率一般，并与非胚性愈伤组织混生
对比配方3 3 2 1 鳞片基部形成较少量愈伤组织，无小仔球分化，胚性愈伤组织得率较高，呈现颗粒状分布于鳞片上

[0029] 由上述配方可知，BA（6-苄氨基腺嘌呤）和NAA（萘乙酸）对百合胚性愈伤组织诱导的影响较小。在对比配方1~对比配方3中，BA、NAA和PIC混合使用，容易导致胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织的混合共生，对百合胚性愈伤组织的分离和纯化造成困难。当PIC浓度低于BA和NAA时，特别是当PIC浓度为1mg·L-1时，百合鳞片更易分化出小仔球，而非愈伤组织，对后续百合的脱毒培养无用。因此，本发明在基本培养基中仅加入PIC，不添加BA和NAA，诱导培养胚性愈伤组织。

[0030] 2）胚性愈伤组织的筛选：对步骤1）中得到的胚性愈伤组织进行筛选，选择出幼小球形体细胞胚胎作为继代材料。胚性愈伤组织表现为疏松分布的颗粒状结构，用镊子可轻松的分离，颜色呈嫩黄色或乳白色半透明状，球形体细胞胚胎在MS基本培养基中即可生长为完整植株。

[0031] 3）固体培养基中球形体细胞胚胎的继代培养：将步骤2）中筛选出来的幼小球形体细胞胚胎接种于固体增殖培养基中进行第一代继代培养，温度保持在24±2℃，暗光培养14天，得到第一代继代培养体细胞胚胎。

[0032] 在第一代继代培养体细胞胚胎中筛选出新产生的球形体细胞胚胎，将其接种于固体增殖培养基中进行第二代继代培养，温度保持在24±2℃，暗光培养14天，得到第二代继代培养体细胞胚胎；如此循环，直到继代培养的体细胞胚胎未检测出病毒为止。

[0033] 其中，固体增殖培养基的组成为：MS培养基+PIC 1~2mg·L-1+琼脂 7g·L-1+蔗-1糖30g·L ，PH值为5.8。

[0034] 实施例二：

[0035] 本实施例中，步骤1）和步骤2）与实施例一相同，步骤3）为生物反应器中球形体细胞胚胎的继代培养：将实施例一中步骤2）得到的球形体细胞胚胎接种于添加有液体增殖培养基的生物反应器中进行第一代继代培养，每个生物反应器中接种的球形体细胞胚胎的质量体积比浓度为0.5-5%（w/v），即每个生物反应器中添加100ml的液体增殖培养基，可接种0.5~5g的球形体细胞胚胎。本实施例中，每个生物反应器中接种1g的球形体细胞胚胎，-1接种后将生物反应器的气流量调节至20ml•min ，温度保持在24±2℃，置于暗光培养条件下培养14d，得到第一代继代培养体细胞胚胎。

[0036] 在第一代继代培养体细胞胚胎中筛选出新产生的球形体细胞胚胎，将其接种于添加有液体增殖培养基的生物反应器中进行第二代继代培养，接种后将生物反应器的气流量-1调节至20ml•min ，温度保持在24±2℃，暗光培养14天，得到第二代继代培养体细胞胚胎；
如此循环，直到继代培养的体细胞胚胎未检测出病毒为止。

[0037] 在筛选球形体细胞胚胎时，由于球形体细胞胚胎的直径小于或等于1mm，因此，可采用孔径为0.5~1.0 mm的筛子进行筛选，通过筛子的材料即为幼小球形体细胞胚胎。

[0038] 其中，液体增殖培养基的组成为：MS培养基+PIC 1~2mg·L-1+蔗糖30g·L-1，PH值为5.8。

[0039] 本发明中，胚性愈伤组织诱导培养基、固体增殖培养基和液体增殖培养基均在-21.05kg·cm 和121℃的条件下，灭菌20min。

[0040] 对于球形体细胞胚胎的继代培养，可仅采用固体增殖培养基进行培养（如实施例一），也可仅采用生物反应器的液体增殖培养基进行培养（如实施例二），还可以采用固体增殖培养基和生物反应器的液体增殖培养基交替进行培养；如第一代继代培养在固体增殖培养基中进行，第二代继代培养在生物反应器的液体增殖培养基中进行，第三代继代培养在固体增殖培养基中进行，如此交替循环；也可以第1~4次继代培养在固体增殖培养基中进行，第5~10次继代在生物反应器的液体增殖培养基中进行等培养方式。

[0041] 本发明脱毒的原理为：体细胞胚胎起源于单个或少数未分化或脱分化的体细胞，初期表现为球形体细胞胚胎，每个体细胞胚胎都可以发育成一个完整的植物个体。在新形成的球形体细胞胚胎中鲜有病毒存在。由于没有维管系统与其母体组织连通，故病毒难以从母体组织扩散至新形成的球形体细胞胚胎中。球形体细胞胚胎易于从母体分离。分离的球形体细胞胚胎受伤少，在适当的条件下能继续形成更多新的球形体细胞胚胎或经过鱼雷胚阶段生长成成熟体细胞胚胎，进而发育成完整的植株。

[0042] 本发明能够在确保植物材料高效分化、快速生长的前提下，依据细胞和病毒增殖速度的不同，通过体细胞胚胎的快速繁殖，逐渐减少直至脱去细胞内的病毒。本发明具有高效，操作简单，植物组织增生快，脱毒效果好的优点。

[0043] 在继代培养过程中，每一次继代产生的体细胞胚胎都可直接进行病毒检测，即在每一次继代培养后，都对继代培养产生的体细胞胚胎进行筛选，从中筛选出幼小球形体细胞胚胎用作下一次继代培养的材料，而剩余的体细胞胚胎用于病毒检测，如剩余的体细胞胚胎中未检测出病毒，则脱毒成功。当然，在实际操作过程中，并非将每一次继代产生的体细胞胚胎都进行病毒检测，一般需根据脱去病毒的种类不同，在继代培养4次后，将往后的每一次继代培养的体细胞胚胎都进行病毒检测。也可以将继代培养过程中产生的体细胞胚胎接种于MS固体培养基中分化出小仔球用于病毒检测。对于本发明而言，一般经过8-10次继代后，百合外植体内的病毒可完全脱除。

[0044] 对于已脱去病毒的体细胞胚胎，可继续进行增殖培养，以培养出更多的脱毒体细胞胚胎。也可以置于MS固体培养基中进行分化培养，以分化出生长健壮的脱毒小仔球，进行炼苗移栽。

[0045] 最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制技术方案，尽管申请人参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，那些对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。