本发明公开了一种水牛睾丸曲精细管总蛋白样品的制备方法，该法属于裂解液提取-丙酮沉淀方法，且方法简单易行、快速可靠，结合使用组合酶有效消化和去除了睾丸肌肉组织、结缔组织等多种组织成分以及DNA等，最终将大量白色的睾丸曲精细管富集出来，获得的曲精细管较纯且不含其它杂质，提取的总蛋白质量较好，适合于双向电泳分析。据此，发明人通过不断摸索和优化双向电泳技术体系，从而建立了一套水牛睾丸曲精细管总蛋白样品的双向电泳分离方法，该法可获得质量较好、分辨率较高的双向电泳图谱，对于后续的质谱分析和蛋白鉴定具有非常重要的应用价值。
1.一种水牛睾丸曲精细管总蛋白样品的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)用体积浓度75％酒精消毒水牛阴囊皮肤，切开阴囊并剥离其周围组织，取出睾丸，置于37℃生理盐水中保存并迅速带回实验室；用PBS反复冲洗3次，去掉被膜、白膜，剪取一小块睾丸实质，用镊子将组织慢慢撕开并置于15mL玻璃管中；
(2)向步骤(1)的15mL玻璃管中加入胶原酶Ⅳ和DNaseⅠ的混合酶溶液，使睾丸组织与混合酶溶液的质量体积比为1:10，置于37℃摇床上震摇2～3h，直到看到大量白色的曲精细管富集于管底时停止摇晃，轻轻倒掉上清液，用PBS溶液冲洗2～3次，将纯化后的曲精细管样品分装于1.5mL离心管中；
(3)向步骤(2)的1.5mL离心管中加入纯化的曲精细管样品3～5倍体积的蛋白裂解液，冰浴下震摇30min至曲精细管样品充分裂解，4℃、12000g离心10min，收集上清液；所述蛋白裂解液组成为7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4％CHAPS和1％DTT；
(4)向步骤(3)收集的上清液中加入4倍预冷丙酮，-20℃静置2～3h或过夜，4℃、
12000g离心30min，弃上清，再用预冷丙酮洗涤沉淀2～3次，室温放置10min使残余丙酮尽可能完全挥发，蛋白沉淀用水化液复溶，Bradford法测定蛋白质浓度，-80℃保存备用。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)的混合酶溶液按以下步骤配制：将胶原酶Ⅳ和DNase Ⅰ用PBS进行溶解分别制成浓度1mg/mL和300μg/mL的溶液，然后按照体积比10:3混合，即得。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(4)的水化液的组成为8mol/L尿素和2％CHAPS。
4.用于权利要求1所述水牛睾丸曲精细管总蛋白样品的双向电泳分离方法，其特征在于包括以下步骤：(5)取步骤(4)中得到的蛋白质样品350μg，选取24cm、pH 4～7的IPG胶条进行第一向固相pH梯度等电聚焦，在蛋白质样品中加入2.25μL IPG Buffer和0.01g DTT，并根据蛋白质样品上样体积加入适量水化液使上样总体积达到450μL；
(6)将步骤(5)中混合均匀的450μL上样溶液缓慢加入胶条槽中，IPG胶条胶面朝下轻轻盖住样品混合液，避免产生气泡，最后加入2～3mL Immobiline DryStrip矿物油覆盖防止溶液挥发，盖上盖子水平放置于聚焦仪上进行等电聚焦；
(7)将步骤(6)中等电聚焦后的IPG胶条放入15mL平衡液I中，于摇床上平衡15min，再使用等体积的平衡液II平衡15min；
(8)将步骤(7)中平衡好的胶条转移至12.5％的SDS-PAGE凝胶顶端进行第二向垂直电泳，以恒流15mA/gel电泳15min后，增大电流至25mA/gel，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部停止电泳。
5.根据权利要求4所述的双向电泳分离方法，其特征在于还包括以下步骤：(9)步骤(8)中第二向SDS-PAGE电泳结束后，取出玻璃板，将凝胶剥离后进行硝酸银染色，染色结束后，使用Image Scanner扫描仪扫描凝胶并将图像保存，应用Image Master
6.根据权利要求5所述的双向电泳分离方法，其特征在于步骤(5)的水化液的组成为
7.根据权利要求6所述的双向电泳分离方法，其特征在于步骤(6)中等电聚焦按以下程序进行：30V，6h、60V，6h、200V，1h、500V，1h、1000V，1h、8000V，1h、80000Vhs，10h、1000V，
8.根据权利要求7所述的双向电泳分离方法，其特征在于步骤(7)中平衡液I的的组成为6mol/L尿素，2％ SDS，1.5mol/L Tris-HCl，87％甘油，1％ DTT；平衡液II的组成为
6mol/L尿素，2％ SDS，1.5mol/L Tris-HCl，87％甘油，4％ IAA。
水牛睾丸曲精细管总蛋白样品的制备方法和双向电泳分离
方法
技术领域
[0001] 本发明属于蛋白质提取和蛋白质组学分离技术领域，尤其涉及一种水牛睾丸曲精细管总蛋白样品的制备方法和双向电泳分离方法。
背景技术
[0002] 睾丸内曲精细管是精子发生的重要场所，曲精细管组织中含有精原细胞和支持细胞等，精原细胞通过自身的分裂和增殖并在支持细胞的分泌作用下分化成各级生殖细胞，支持细胞对生精细胞起着支持、营养和保护等作用，其对于精母细胞最终发育成具有完整形态的精子具有至关重要的作用。目前国内外对于睾丸曲精细管的研究大多是对其精原细胞或支持细胞进行体外分离培养，很少涉及睾丸曲精细管总蛋白的提取和蛋白质组学研究。
[0003] 双向电泳技术是蛋白质组学研究领域的关键技术之一，其基本原理是第一向基于蛋白质等电点的不同在水平方向进行等电聚焦分离，第二向根据蛋白分子量大小在垂直方向进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将复杂蛋白混合物中的蛋白在二维平面上分离开来，并最终结合质谱技术对分离的蛋白进行鉴定。然而，该技术本身存在蛋白分离范围有限、歧视效应及人为误差较大等的不足，尤其是所分析蛋白样品制备的好坏在很大程度上影响双向电泳技术的有效性和可靠性。
发明内容
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种提取质量较好、纯度较高的适合于双向电泳分析的水牛睾丸曲精细管总蛋白样品的制备方法。
[0005] 本发明要解决的另一技术问题是提供一种分辨率较高、分离质量较好的水牛睾丸曲精细管总蛋白样品的双向电泳分离方法。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：水牛睾丸曲精细管总蛋白样品的制备方法，包括以下步骤：
[0007] （1）用体积浓度75%酒精消毒水牛阴囊皮肤，切开阴囊并剥离其周围组织，取出睾丸，置于37℃生理盐水中保存并迅速带回实验室；用PBS反复冲洗3次，去掉被膜、白膜，剪取一小块睾丸实质，用镊子将组织慢慢撕开并置于15mL玻璃管中；
[0008] （2）向步骤（1）的15mL玻璃管中加入胶原酶Ⅳ和DNaseⅠ的混合酶溶液，使睾丸组织与混合酶溶液的质量体积比为1:10，置于37℃摇床上震摇2～3h，直到看到大量白色的曲精细管富集于管底时停止摇晃，轻轻倒掉上清液，用PBS溶液冲洗2～3次，将纯化后的曲精细管样品分装于1.5mL离心管中；
[0009] （3）向步骤（2）的1.5mL离心管中加入纯化的曲精细管样品3～5倍体积的蛋白裂解液，冰浴下震摇30min至曲精细管样品充分裂解，4℃、12000g离心10min，收集上清液；
[0010] （4）向步骤（3）收集的上清液中加入4倍预冷丙酮，-20℃静置2～3h或过夜，4℃、12000g离心30min，弃上清，再用预冷丙酮洗涤沉淀2～3次，室温放置10min使残余丙酮尽可能完全挥发，蛋白沉淀用水化液复溶，Bradford法测定蛋白质浓度，-80℃保存备用。
[0011] 步骤（2）的混合酶溶液按以下步骤配制：将胶原酶Ⅳ和DNaseⅠ用PBS进行溶解分别制成浓度1mg/mL和300μg/mL的溶液，然后按照体积比10:3混合，即得。
[0012] 步骤（3）的蛋白裂解液组成为7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%CHAPS和1%DTT，每小管分装1mL，-80℃保存。
[0013] 步骤（4）的水化液的组成为8mol/L尿素和2%CHAPS，每小管分装1mL，-80℃保存。
[0014] 用于上述水牛睾丸曲精细管总蛋白样品的双向电泳分离方法，包括以下步骤：
[0015] （5）取步骤（4）中得到的蛋白质样品350μg，选取24cm、pH4～7的IPG胶条进行第一向固相pH梯度等电聚焦，在蛋白质样品中加入2.25μL IPG Buffer和0.01g DTT，并根据蛋白质样品上样体积加入适量水化液使上样总体积达到450μL；
[0016] （6）将步骤（5）中混合均匀的450μL上样溶液缓慢加入胶条槽中，IPG胶条胶面朝下轻轻盖住样品混合液，避免产生气泡，最后加入2～3mL Immobiline DryStrip矿物油覆盖防止溶液挥发，盖上盖子水平放置于聚焦仪上进行等电聚焦；
[0017] （7）将步骤（6）中等电聚焦后的IPG胶条放入15mL平衡液I中，于摇床上平衡15min，再使用等体积的平衡液II平衡15min；
[0018] （8）将步骤（7）中平衡好的胶条转移至12.5%的SDS-PAGE凝胶顶端进行第二向垂直电泳，以恒流15mA/gel电泳15min后，增大电流至25mA/gel，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部停止电泳。
[0019] 上述的双向电泳分离方法，还包括以下步骤：
[0020] （9）步骤（8）中第二向SDS-PAGE电泳结束后，取出玻璃板，将凝胶剥离后进行硝酸银染色，染色结束后，使用Image Scanner扫描仪扫描凝胶并将图像保存，应用ImageMaster2D platinum软件分析图像。
[0021] 步骤（5）的水化液的组成为8mol/L尿素和2%CHAPS，每小管分装1mL，-80℃保存。
[0022] 步骤（6）中等电聚焦按以下程序进行：30V，6h（水化）、60V，6h（水化）、200V，1h（除盐）、500V，1h（除盐）、1000V，1h（除盐）、8000V，1h（升压）、80000Vhs，10h（聚焦）、1000V，10h（保持）。
[0023] 步骤（7）中平衡液I的的组成为6mol/L尿素，2%SDS，1.5mol/L Tris-HCl，87%甘油，1%DTT；平衡液II的组成为6mol/L尿素，2%SDS，1.5mol/L Tris-HCl，87%甘油，4%IAA。
[0024] 本发明系国内外首次对于水牛睾丸曲精细管总蛋白提取和蛋白质组学分离方法进行研究。针对双向电泳分析对蛋白样品要求高的问题，发明人建立了一种行之有效的水牛睾丸曲精细管总蛋白样品的制备方法。该法属于裂解液提取-丙酮沉淀方法，且方法简单易行、快速可靠，结合使用组合酶（即适合比例的胶原酶Ⅳ（1mg/mL）和DNaseⅠ（300μg/mL）混合酶溶液）有效消化和去除了睾丸肌肉组织、结缔组织等多种组织成分以及DNA等，最终将大量白色的睾丸曲精细管富集出来，获得的曲精细管较纯且不含其它杂质，提取的总蛋白质量较好，适合于双向电泳分析。据此，发明人通过不断摸索和优化双向电泳技术体系（水化液配方、蛋白上样量、IPG胶条等参数），从而建立了一套水牛睾丸曲精细管总蛋白样品的双向电泳分离方法，该法可获得质量较好、分辨率较高的双向电泳图谱，对于后续的质谱分析和蛋白鉴定具有非常重要的应用价值。
附图说明
[0025] 图1是实施例1青年期水牛睾丸曲精细管总蛋白样品双向凝胶电泳图谱。
[0026] 图2是实施例2老年期水牛睾丸曲精细管总蛋白样品双向凝胶电泳图谱。
具体实施方式
[0027] 实施例1
[0028] 1、水牛睾丸曲精细管的收集和纯化
[0029] （1）从本地屠宰场获取青年期水牛睾丸（用体积浓度75%酒精消毒水牛阴囊皮肤，切开阴囊并剥离其周围组织，取出睾丸），置于37℃生理盐水中保存并迅速带回实验室；用PBS反复冲洗3次，去掉被膜、白膜，剪取一小块睾丸实质，用镊子将组织慢慢撕开并置于15mL玻璃管中；
[0030] （2）向步骤（1）中的15mL玻璃管中加入胶原酶Ⅳ和DNaseⅠ的混合酶溶液（将胶原酶Ⅳ和DNaseⅠ用PBS进行溶解分别制成浓度1mg/mL和300μg/mL的溶液，然后按照体积比10:3混合，即得），使睾丸组织与混合酶溶液的质量体积比为1:10，置于37℃摇床上震摇2～3h，直到看到大量白色的曲精细管富集于管底时停止摇晃，轻轻倒掉上清液，用PBS溶液冲洗2～3次，将纯化后的曲精细管样品分装于1.5mL离心管中。
[0031] 2、水牛曲精细管总蛋白样品制备
[0032] （1）纯化后的曲精细管样品中加入3～5倍体积的蛋白裂解液（7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS，1%DTT），冰浴下震摇30min至曲精细管样品充分裂解，4℃、12000g离心10min，收集上清液；
[0033] （2）向步骤（1）中收集的上清液加入4倍预冷丙酮，-20℃静置2～3h或过夜，4℃、12000g离心30min，弃上清，再用预冷丙酮洗涤沉淀2～3次，室温放置10min使残余丙酮尽可能完全挥发，蛋白沉淀用水化液（8mol/L尿素、2%CHAPS）复溶，Bradford法测定蛋白质浓度，-80℃保存备用；
[0034] 3、双向电泳分离
[0035] （1）一向等电聚焦：根据蛋白质定量结果，取蛋白上样量350μg，选取24cm、pH4～7的IPG胶条进行第一向固相pH梯度等电聚焦，在蛋白质样品中加入2.25μL IPGBuffer和0.01g DTT，并根据蛋白质样品上样体积加入适量水化液（8mol/L尿素和2%CHAPS）使上样总体积达到450μL，然后将上样溶液缓慢加入胶条槽中，IPG胶条胶面朝下轻轻盖住样品混合液，避免产生气泡，最后加入2～3mL Immobiline DryStrip矿物油覆盖防止溶液挥发，盖上盖子水平放置于聚焦仪上，按照如下程序进行等电聚焦：30V，6h、60V，6h、200V，1h、
500V，1h、1000V，1h、8000V，1h、80000Vhs，10h、1000V，10h；
[0036] （2）胶条平衡：将等电聚焦后的IPG胶条放入15mL平衡液I中（6mol/L尿素，2%SDS，1.5mol/L Tris-HCl，87%甘油，1%DTT），于摇床上平衡15min，再使用等体积的平衡液II（6mol/L尿素，2%SDS，1.5mol/L Tris-HCl，87%甘油，4%IAA）平衡15min；
[0037] （3）第二向SDS-PAGE电泳：平衡好的胶条转移至12.5%的SDS-PAGE凝胶顶端进行第二向垂直电泳，以恒流15mA/gel电泳15min后，增大电流至25mA/gel，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部停止电泳。
[0038] 4、凝胶染色及图像分析
[0039] 第二向SDS-PAGE电泳结束后，取出玻璃板，将凝胶剥离后进行硝酸银染色，染色结束后，使用Image Scanner扫描仪扫描凝胶并将图像保存，应用Image Master2Dplatinum软件分析图像。
[0040] 双向电泳结果如图1所示，结果表明该水牛睾丸曲精细管总蛋白样品的制备和分离效果良好，最终得到分辨率较高、重复性较好的双向电泳图谱。
[0041] 实施例2
[0042] 1、水牛睾丸曲精细管的收集和纯化
[0043] （1）从本地屠宰场获取老年期水牛睾丸（用体积浓度75%酒精消毒水牛阴囊皮肤，切开阴囊并剥离其周围组织，取出睾丸），置于37℃生理盐水中保存并迅速带回实验室。用PBS反复冲洗3次，去掉被膜、白膜，剪取一小块睾丸实质，用镊子将组织慢慢撕开并置于15mL玻璃管中；
[0044] （2）向步骤（1）中的15mL玻璃管中加入胶原酶Ⅳ和DNaseⅠ的混合酶溶液（将胶原酶Ⅳ和DNaseⅠ用PBS进行溶解分别制成浓度1mg/mL和300μg/mL的溶液，然后按照体积比10:3混合，即得），使睾丸组织与混合酶溶液的质量体积比为1:10，置于37℃摇床上震摇2～3h，直到看到大量白色的曲精细管富集于管底时停止摇晃，轻轻倒掉上清液，用PBS溶液冲洗2～3次，将纯化后的曲精细管样品分装于1.5mL离心管中。
[0045] 2、水牛曲精细管总蛋白样品制备
[0046] （1）纯化后的曲精细管样品中加入3～5倍体积的蛋白裂解液（7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS，1%DTT），冰浴下震摇30min至曲精细管样品充分裂解，4℃、12000g离心10min，收集上清液；
[0047] （2）向步骤（1）中收集的上清液加入4倍预冷丙酮，-20℃静置2～3h或过夜，4℃、12000g离心30min，弃上清，再用预冷丙酮洗涤沉淀2～3次，室温放置10min使残余丙酮尽可能完全挥发，蛋白沉淀用水化液（8mol/L尿素、2%CHAPS）复溶，Bradford法测定蛋白质浓度，-80℃保存备用；
[0048] 3、双向电泳分离
[0049] （1）一向等电聚焦：根据蛋白质定量结果，取蛋白上样量350μg，选取24cm、pH4～7的IPG胶条进行第一向固相pH梯度等电聚焦，在蛋白质样品中加入2.25μL IPGBuffer和0.01g DTT，并根据蛋白质样品上样体积加入适量水化液（8mol/L尿素和2%CHAPS）使上样总体积达到450μL，然后将上样溶液缓慢加入胶条槽中，IPG胶条胶面朝下轻轻盖住样品混合液，避免产生气泡，最后加入2～3mL Immobiline DryStrip矿物油覆盖防止溶液挥发，盖上盖子水平放置于聚焦仪上，按照如下程序进行等电聚焦：30V，6h、60V，6h、200V，1h、
500V，1h、1000V，1h、8000V，1h、80000Vhs，10h、1000V，10h；
[0050] （2）胶条平衡：将等电聚焦后的IPG胶条放入15mL平衡液I中（6mol/L尿素，2%SDS，1.5mol/L Tris-HCl，87%甘油，1%DTT），于摇床上平衡15min，再使用等体积的平衡液II（6mol/L尿素，2%SDS，1.5mol/L Tris-HCl，87%甘油，4%IAA）平衡15min；
[0051] （3）第二向SDS-PAGE电泳：平衡好的胶条转移至12.5%的SDS-PAGE凝胶顶端进行第二向垂直电泳，以恒流15mA/gel电泳15min后，增大电流至25mA/gel，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部停止电泳。
[0052] 4、凝胶染色及图像分析
[0053] 第二向SDS-PAGE电泳结束后，取出玻璃板，将凝胶剥离后进行硝酸银染色，染色结束后，使用Image Scanner扫描仪扫描凝胶并将图像保存，应用Image Master2Dplatinum软件分析图像。
[0054] 双向电泳结果如图2所示，结果表明该水牛睾丸曲精细管总蛋白样品的制备和分离效果良好，最终得到分辨率较高、重复性较好的双向电泳图谱。
