一种山羊MSTN基因定点修饰系统及其应用转让专利
申请号 : CN201410201664.4
文献号 : CN103952405B
文献日 : 2016-02-10
发明人 : 成勇 , 于宝利
申请人 : 扬州大学
摘要 :
本发明公开了一种山羊MSTN基因定点修饰系统及其应用方法，所述山羊MSTN基因定点修饰系统，即能够有效的识别、修饰山羊MSTN基因靶序列的转录激活样效应因子核酸酶TALENs；本发明提供的转录激活样效应因子核酸酶TALENs由分别能够特异识别所述识别模块TALMEX-1F和TALMEX-1R的核酸酶TALEN-R和TALEN-L组成；所述核酸酶TALEN-L为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示核苷酸序列编码的蛋白质，所述核酸酶TALEN-R为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示核苷酸序列编码的蛋白质。本发明还公开了使用上述敲除系统对山羊细胞MSTN基因进行靶向修饰，获得突变细胞系的方法。本发明对于在山羊上对MSTN基因进行敲除或改造以获得优质瘦肉率的新品种及MSTN基因调控机理研究具有重大应用价值。
权利要求 :
1.一种山羊MSTN基因定点修饰系统，其特征在于有效的基因定点修饰系统为剪切山羊MSTN基因靶序列的转录激活样效应因子核酸酶TALENs；
所述山羊MSTN基因靶序列如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，23-40位核苷酸为识别模块TALMEX-1F，与57-74位核苷酸的互补序列为识别模块TALMEX-1R，41-56位核苷酸为间隔序列；
所述的转录激活样效应因子核酸酶TALENs由识别所述识别模块TALMEX-1F的核酸酶TALEN-L和识别所述识别模块TALMEX-1R的核酸酶TALEN-R组成；
所述核酸酶TALEN-L，由TALMEX-1F识别结构域TALE-L与经过人工改造的DNA切割蛋白Fok-L融合而成；所述核酸酶TALEN-R，由TALMEX-1R识别结构域TALE-R与经过人工改造的DNA切割蛋白Fok-R融合而成；
所述识别结构域TALE-L为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示229-2022位核苷酸编码的蛋白质；所述DNA切割蛋白Fok-L为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示2023-2814位核苷酸编码的蛋白质；所述识别结构域TALE-R为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示229-2022位核苷酸编码的蛋白质；所述DNA切割蛋白Fok-R为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示
2023-2808位核苷酸编码的蛋白质。
2.权利要求1所述山羊MSTN基因定点修饰系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据山羊MSTN基因选择SEQ ID NO.1所示核苷酸序列为靶序列，SEQ ID NO.1所示核苷酸序列23-40位核苷酸为识别模块TALMEX-1F、与57-74位核苷酸互补的序列为识别模块TALMEX-1R、41-56位核苷酸为间隔序列、47-50位核苷酸为剪切靶点并可作为AluI限制性内切酶酶切突变检测位点；
(2)根据步骤(1)所得识别模块TALMEX-1F和识别模块TALMEX-1R合成剪切所述靶序列的转录激活样效应因子核酸酶TALENs；所述转录激活样效应因子核酸酶TALENs由识别所述识别模块TALMEX-1F的核酸酶TALEN-L和识别所述识别模块TALMEX-1R的核酸酶TALEN-R组成；
所述核酸酶TALEN-L，由TALMEX-1F识别结构域TALE-L与经过人工改造的DNA切割蛋白Fok-L融合而成；所述核酸酶TALEN-R，由TALMEX-1R识别结构域TALE-R与经过人工改造的DNA切割蛋白Fok-R融合而成；
所述识别结构域TALE-L为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示229-2022位核苷酸编码的蛋白质；所述DNA切割蛋白Fok-L为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示2023-2814位核苷酸编码的蛋白质；所述识别结构域TALE-R为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示229-2022位核苷酸编码的蛋白质；所述DNA切割蛋白Fok-R为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示
2023-2808位核苷酸编码的蛋白质。
3.含有权利要求1所述山羊MSTN基因定点修饰系统的重组表达载体、重组菌或重组细胞系。
4.权利要求1所述山羊MSTN基因定点修饰系统在山羊细胞MSTN基因识别、修饰中的应用。
5.根据权利要求1所述MSTN基因定点修饰系统在山羊细胞MSTN基因修饰中的应用。
说明书 :
一种山羊MSTN基因定点修饰系统及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用，具体的说是利用一对转录激活效应因子核酸酶定点修饰山羊MSTN基因。
背景技术
[0002] 肌生成抑制素(Myostatin，MSTN)广泛存在于动物骨骼肌内，是骨骼肌生长的负调控因子，MSTN基因在动物胚胎发育期和成年期的骨骼肌中都有表达。小鼠、大鼠、人、牛、猪、羊、鸡、火鸡、斑马鱼的MSTN基因的cDNA已经被克隆、测序。研究结果表明，MSTN基因含有3个外显子，并且在不同物种间MSTN基因序列高度保守。敲除MSTN基因会导致动物肌纤维广泛性增生和肥大，骨骼肌量显著增加。小鼠、大鼠、人、猪、鸡、牛、绵羊、狒狒和斑马鱼等物种的MSTN基因编码序列发生点突变或移码突变，均呈现“双肌症状”(double muscling)，表现出肌肉量显著增加的性状。目前已经在人、牛、绵羊、狗等物种中发现了自然发生的MSTN基因的突变，如比利时兰牛(Belgian blue)、皮埃蒙特牛(Piedmontese)等在exon3序列上发生突变，机体表现出双肌性状。
[0003] 按照人类意愿对基因组进行定向修饰一直是许多科学家的梦想。通过对MSTN基因进行突变、缺失、敲除等遗传修饰，获得基因突变动物，一方面可以构建出具有“双肌症状”的动物模型用于生物学研究和疾病机理研究，另一方面可以达到改进肌肉质量和重量的目的，生产具有商业化性质的优良品种家畜。
[0004] 人们一直在寻找简单高效的方法对基因组进行靶向修饰。传统的基因打靶技术-6 -8依赖于细胞内自然发生的同源染色体随机重组交换，中靶比例极低，通常只有10 -10 ，未被广泛应用。近年来核酸酶指导的基因组靶向修饰技术发展迅速。这类核酸酶通常由一个DNA识别结构域和一个非特异性核酸内切酶结构域构成，由DNA识别结构域特异的识别靶位点，把核酸酶定位到需要进行编辑的基因组区域，然后由非特异性核酸内切酶切断DNA双链，引起DNA自我修复机制，从而引发基因序列的突变和促进同源重组的发生。
[0005] 人工锌指核酸酶(Zinc Finger Nucleases，ZFN)技术是近年来发展起来的基因组定点修饰技术。ZFN是一种由能够识别特异的DNA序列的结构域与Fok I内切酶结构域融合而成的蛋白，通过识别特定的DNA序列使得Fok I核酸内切酶在靶位点形成二聚体产生内切酶活性，造成靶位点DNA双链的断裂，从而引发非同源末端连接以及同源重组修复机制。在修复过程中产生的移码突变可被用来对目的基因进行基因敲除，同源重组伴随外源基因的插入可被用来执行特异位点的基因敲入。ZFN技术曾被认为对基因功能或产生转基因动物意义重大，但是饱含着希望与失望，由于ZFN受上下文依赖效应影响与靶点DNA序列之间结合不稳定，不能靶向所有序列，使用前需要大量的筛选和鉴定工作，并且产生脱靶性切割引入无法预期的基因突变可能性高。此外，商业购买高效特异的ZFN价格昂贵，而研究者很难自行设计出特异和高效的ZFN。
[0006] 近几年研究发现，转录激活样效应因子(transcription activator-like effector,TALE)具有DNA结合特异性，并且其识别密码具有模块化和简单化特点，TALE-DNA结合结构域由串联重复单元组成，大部分单元含34个氨基酸，单元的第12和13位氨基酸高度可变，成为重复可变区(repeat variable diresidues,RVDs)。TALE的RVDs识别DNA序列的4个碱基具有高度专一性，第13位氨基酸直接与DNA的碱基特异结合。研究者能够根据DNA序列，在任意位点构建特异的TALE-DNA识别结合域，可以广泛用于基因序列突变修饰和基因打靶等。
[0007] 设定DNA靶序列，组装TALE-DNA结合域，融合Fok I内切酶的非特异性DNA切割域，组装成TALE核酸酶(tanscription activator-like effector nucleases，TALENs)。TALENs靶向结合DNA，Fok I非特异性切割DNA序列，产生DNA双链断裂(DNA double-srand breaks,DSBs)。在真核细胞内DSBs激活两条保守的DNA修复通路：非同源末端连接修复(non-homologous end joining,NHEJ)可以将断裂的染色体重新连接，在连接过程中断裂位点有可能引入小片段碱基的丢失或插入，从而影响基因功能或产生基因敲除效应。若此时引入同源重组载体；同源指导修复(homology-directed repair,HDR)能够利用相似的DNA模板指导修复，替代断裂点周围的DNA序列，实现特定突变或定点导入外源DNA。
发明内容
[0008] 本发明目的在于提供一种山羊MSTN基因定点修饰系统及其在山羊MSTN基因修饰中的应用方法。
[0009] 本发明中术语山羊MSTN基因是指山羊肌肉生成抑制蛋白(Myostatin，MSTN)基因。
[0010] 为了解决上述问题，本发明采取了如下技术方案：
[0011] 一种山羊MSTN基因定点修饰系统，所述定点修饰系统为一对山羊MSTN基因靶序列的转录激活样效应因子核酸酶TALENs，能够有效剪切山羊MSTN基因靶序列；
[0012] 所述山羊MSTN基因靶序列如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，23-40位核苷酸为识别模块TALMEX-1F，57-74位核苷酸的反向互补序列为识别模块TALMEX-1R，41-56位核苷酸为间隔序列；
[0013] 所述的转录激活样效应因子核酸酶TALENs由识别所述识别模块TALMEX-1F的核酸酶TALEN-L和识别所述识别模块TALMEX-1R的核酸酶TALEN-R组成；
[0014] 所述核酸酶TALEN-L，其特征在于，由TALMEX-1F识别结构域TALE-L与经过人工改造的DNA切割蛋白Fok-L融合而成；所述核酸酶TALEN-R，其特征在于，由TALMEX-1R识别结构域TALE-R与经过人工改造的DNA切割蛋白Fok-R融合而成；
[0015] 所述识别结构域TALE-L为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示229-2022位核苷酸编码的蛋白质；所述DNA切割蛋白Fok-L为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示2023-2814位核苷酸编码的蛋白质；所述识别结构域TALE-R为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示229-2022位核苷酸编码的蛋白质；所述DNA切割蛋白Fok-R为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示2023-2808位核苷酸编码的蛋白质。
[0016] 本发明还提供上述山羊MSTN基因定点修饰系统的制备方法，包括以下步骤：
[0017] (1)根据山羊MSTN基因选择SEQ ID NO.1所示核苷酸序列为靶序列，SEQ ID NO.1所示核苷酸序列中23-40位核苷酸为识别模块TALMEX-1F，与57-74位核苷酸反向互补的序列为识别模块TALMEX-1R，41-56位核苷酸为间隔序列；
[0018] (2)根据步骤(1)所得识别模块TALMEX-1F和识别模块TALMEX-1R合成剪切所述靶序列的转录激活样效应因子核酸酶TALENs；所述转录激活样效应因子核酸酶TALENs由识别所述识别模块TALMEX-1F的核酸酶TALEN-L和识别所述识别模块TALMEX-1R的核酸酶TALEN-R组成；
[0019] 所述核酸酶TALEN-L的核苷酸编码序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示，所述核酸酶TALEN-R的核苷酸编码序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示；
[0020] 本发明还公开了含有上述山羊MSTN基因定点敲除系统编码基因的重组表达载体、重组菌或重组细胞系；
[0021] 公开了所述山羊MSTN基因定点敲除系统在靶细胞中修饰目的基因核酸序列的应用。所述MSTN基因定点敲除系统在其他哺乳动物细胞MSTN基因修饰中的应用。
[0022] 一种定点敲除山羊MSTN基因的方法，包括在山羊细胞中表达上述定点敲除系统的步骤。
[0023] 进一步提供了能够表达所述TALENs的mRNA，其特征在于，所述mRNA序列以TALEN-L和TALEN-R所示的核苷酸序列为转录模板。以及所述mRNA在山羊细胞或受精卵中删除MSTN基因的应用。
[0024] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0025] 1、已经发现牛、绵羊和人等物种出现MSTN基因的天然突变，并且能够引起双肌性状，但受限于技术因素，应用同源打靶技术或ZFN方法很难实现山羊MSTN基因的高效突变。因此，本发明通过TALEN技术对山羊MSTN基因进行TALENs编辑，获得MSTN基因靶序列发生突变的细胞系，为进一步验证MSTN基因对山羊肌肉生长的调控机制提供了可行的材料和方法。
[0026] 2、本发明获得的MSTN基因靶序列发生突变的细胞系，能够作为体细胞核移植制备MSTN基因突变山羊的核供体细胞，为改善山羊肉质和提高山羊出肉率提供新的技术途径，对于在山羊上对MSTN基因进行敲除或改造以获得优质瘦肉率的新品种及研究MSTN基因对山羊肌肉生长的调控机理具有重大应用价值。
[0027] 3、本发明TALENs构建是针对山羊MSTN基因特定靶序列的重组核酸酶，在特异的位点切断基因DNA，引发非同源末端连接修复，进而产生MSTN基因Knock-out突变。他克服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，脱靶率高，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题；也克服了同源重组工作量大，突变率低，需要引入外源基因或标记基因等问题；而具有ZFN相等或更高的活性，在不引入外源基因或标记基因情况下，使MSTN基因定点突变变得更加简单、方便，并且使用此类突变细胞在后续应用中能够获得生物安全性更高的基因突变动物品系。
附图说明
[0028] 图1为TALENs定点修饰山羊MSTN基因的作用原理示意图；
[0029] 图2为pTALEN-L和pTALEN-R质粒示意图；
[0030] 图3为细胞样品扩增产物电泳图；
[0031] 图4为细胞样品扩增产物AluI酶切电泳图；
[0032] 图5为TALENs活性检测测序峰图；
[0033] 图6为突变细胞株L4测序峰图
[0034] 图7为L4、L6、L7、L10、L11、L13样品TA克隆测序结果；注：WT表示野生型基因序列；△表示出现基因缺失突变；fragmesshift表示发生碱基替换；
[0035] 图8为L9、L16样品测序峰值图；注：峰值单一无套峰，表明发生双等位基因发生的突变情况完全一致；
具体实施方式
[0036] 下面结合附图和具体实施案例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定，具体操作过程按照下面步骤进行：
[0037] 第一步、根据需敲除的基因序列设计出具有特异性的序列TALEN靶点；
[0038] 第二步、根据设计出的TALEN靶点构建出TALEN质粒；
[0039] 第三步、将TALEN质粒转染受体细胞；
[0040] 第四步、对转然后的细胞进行筛选、培养、挑取单克隆，单克隆扩大培养，鉴定单克隆细胞基因组突变情况，挑选出符合突变要求的阳性细胞克隆，以备后续实验使用。
[0041] 下述实例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
[0042] 下述实例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购买获得，可用类试剂或试剂盒替代。
[0043] 实例山羊胎儿成纤维细胞MSTN基因修饰
[0044] MSTN基因与肌肉生长调控有关。本发明应用TALENs技术，针对山羊MSTN基因exon1的AGCT位点进行密码子突变操作，从而实现MSTN基因的修饰。
[0045] 1、本实例所需材料与试剂
[0046] FastTALETM TALEN Assembly kit 试 剂 盒 由 Sidansai Biotechnology CO.,LTD(http://www.sidansai.com/)提供。该试剂盒由8个骨架载体，172个RVD单体识别模块及5种模块连接操作液等组成。
[0047] 感受态细胞购自生兴生物技术(南京)有限公司，Cla I、AluI内切酶、DNA Marker等购自宝生生物工程(大连)有限公司，测序及引物合成由华大基因(北京)科技有限公司完成，其他生化试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司，Multiporator、Hypotonic ElectroporationBuffer及electroporation cuvettes购自Eppendorf公司，山羊胎儿成纤维细胞取自怀孕35～40天萨能奶山羊。
[0048] pL15、pR11骨架载体均来源于FastTALETM TALEN Assembly kit。
[0049] 2、山羊MSTN基因特异性TALENs靶点的选择
[0050] 本实例的针对山羊MSTN基因exon1序列，采用TAL effector Nucleotide Targer2.0(https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen)设计识别模块，5'端保留T碱基。选取TALMEX-1F和TALMEX-1R为识别模块对山羊MSTN基因exon1序列的AGCT位点进行修饰。
[0051] TALMEX-1F CCTCAGTAAACTTCGCCT
[0052] TALMEX-1R TATAGCATCTTTGCTGAT
[0053] 识别模块TALMEX-1F对应的RVD序列：
[0054] HD-HD-NG-HD-NI-NN-NG-NI-NI-NI-HD-NG-NG-HD-NN-HD-HD-NG或
[0055] HD-HD-NG-HD-NI-NH-NG-NI-NI-NI-HD-NG-NG-HD-NH-HD-HD-NG
[0056] 识别模块TALMEX-1F对应的RVD序列：
[0057] NG-NI-NG-NI-NN-HD-NI-NG-HD-NG-NG-NG-NN-HD-NG-NN-NI-NG或
[0058] NG-NI-NG-NI-NH-HD-NI-NG-HD-NG-NG-NG-NH-HD-NG-NH-NI-NG
[0059] 其中HD识别C，NI识别A，NG识别T，NN或NH识别G。
[0060] 本实例编码TALEN-L识别区蛋白质的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3序列229-2022位核苷酸所示，编码TALEN-R识别区蛋白质的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ IDNO.4序列229-2022位核苷酸所示，分别能够特异的识别MSTN基因中的18个核苷酸(TALEN-L识别CCTCAGTAAACTTCGCCT；TALEN-R识别TATAGCATCTTTGCTGAT)，由TALEN-L与TALEN-R共同组成TALENs突变系统，其作用原理如图1所示。
[0061] 3、TALENs表达载体的构建
[0062] 参照FastTALETM TALEN Assembly kit使用说明，根据TALMEX-1F和TALMEX-1R识别模块选择对应的连接模块，TALMEX-1F选择9个识别单体模块(CC1-T2-CA3-CT4-AA5-AC6-TT7-CG8-CC9)与pL15骨架载体连接，构建pTALEN-L质粒；TALMEX-1R选择9个识别单体模块(TA1-T2-AG3-CA4-TC5-TT6-TG7-CT8-GA9)与pR11骨架载体连接，构建pTALEN-R质粒。
[0063] 转化感受态细胞并进行筛选，ClaI酶切鉴定及测序获得连接正确的pTALEN-L和pTALEN-R质粒，pTALEN-L和pTALEN-R示意图如图2所示。
[0064] 4、TALENs活性检测及单克隆突变细胞株的获得
[0065] pTALEN-L和pTALEN-R质粒扩增、提取与纯化参照《分子克隆实验指南》第二版的方法进行。
[0066] 手术方法取35日龄萨能奶山羊胎儿，在超净工作台内用D-Hank’s液洗涤三次，用眼科剪剪去胎儿头、四肢及内脏，剩余组织用剪刀剪成1mm3的小块组织，移入10ml离心管中并加入0.25％Trypsin消化液手握吹打消化15min，静置2min后，吸取下部较大组织块至新离心管，重复消化操作，将上清1500r/min、5min离心，弃去上清，加入新鲜的DMEM培养5
液(含10％FBS+1％PS)重悬细胞，稀释成3×10个/ml，铺板培养(37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2)。细胞生长至汇合度80％时，用0.25％胰蛋白酶消化处理，洗涤收集后获得山羊胎儿成纤维细胞备用。
液(含10％FBS+1％PS)重悬细胞，稀释成3×10个/ml，铺板培养(37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2)。细胞生长至汇合度80％时，用0.25％胰蛋白酶消化处理，洗涤收集后获得山羊胎儿成纤维细胞备用。
[0067] 向收集的细胞中加入1ml Electroporation Buffer悬浮细胞，1500r/min离心5min，弃上清液，将细胞重悬于400μL的转染液(Hypotonic Electroporation Buffer分
6
别含有20μg/ml的pTALEN-L和pTALEN-R质粒)中，使细胞密度为1～3×10个/ml，将
400μl的细胞悬液转移至electroporation cuvettes(径宽2mm)内，放入Multiporator电转染槽中进行电转染(转染模式(Mode)为：Eukaryotes“⊙”、Voltage(V)400V、Time constant(τ)300us、No.of pulse(n)1次)。电脉冲后，使细胞悬液在cuvette(转染杯)中室温条件下静置5min；将细胞悬液加入正常细胞培养液，铺于6孔板后置于37℃、5％CO2、饱和湿度培养。
6
别含有20μg/ml的pTALEN-L和pTALEN-R质粒)中，使细胞密度为1～3×10个/ml，将
400μl的细胞悬液转移至electroporation cuvettes(径宽2mm)内，放入Multiporator电转染槽中进行电转染(转染模式(Mode)为：Eukaryotes“⊙”、Voltage(V)400V、Time constant(τ)300us、No.of pulse(n)1次)。电脉冲后，使细胞悬液在cuvette(转染杯)中室温条件下静置5min；将细胞悬液加入正常细胞培养液，铺于6孔板后置于37℃、5％CO2、饱和湿度培养。
[0068] 铺板24h后更换筛选培养液(DMEM+10％FBS+1％PS+3μg/ml Puro)，筛选72h后更换为正常细胞培养液继续培养，消化收集3孔细胞进行活性检测，编号为L1～L3，其余细胞继续扩大培养5～10天，挑取细胞克隆96个至48孔板继续培养至汇合度70％时，收集部分细胞进行突变检测，编号为L4～L45，同时收集部分正常细胞作为对照组，编号为W1～W3。
[0069] 通过单细胞PCR方法进行活性检测及突变检测。收集的细胞样品编号为：L1～L3为筛选72h后收集的细胞；L4～L45为单克隆细胞株；W1～W3为未转染细胞。将细胞样品置于200μl离心管内，离心去除培养液，加入10μL细胞裂解液(见表1)，45℃孵育15min，96℃孵育20min后直接作为普通PCR检测的DNA模板，-20℃保存备用。
[0070] 表1细胞裂解液
[0071]组成成分 体积(μl)
10×PCR buffer 1
1％tween20 1
0.1％triton 1
Protin K(25mg/ml) 0.2
双蒸水 6.8
10×PCR buffer 1
1％tween20 1
0.1％triton 1
Protin K(25mg/ml) 0.2
双蒸水 6.8
[0072] 取2μl裂解产物作为模板进行PCR反应，PCR引物在山羊MSTN基因组内设计，山羊细胞基因组提取质量良好，均能扩增出目的条带，引物序列见表2，反应体系见表3。
[0073] 表2PCR引物
[0074]
[0075] 表3PCR反应体系
[0076]组成成分 体积(μl) 终浓度
10×PCR buffer 4.8 1×
dNTP(10Mm) 2 200μM
TAL-2se(10μM) 0.3 0.1μM
TAL-2an(10μM) 0.3 0.1μM
Taq酶(5U/μl) 0.3 2.5U/reaction
10×PCR buffer 4.8 1×
dNTP(10Mm) 2 200μM
TAL-2se(10μM) 0.3 0.1μM
TAL-2an(10μM) 0.3 0.1μM
Taq酶(5U/μl) 0.3 2.5U/reaction
[0077]模板 2
ddH2O 40.3
ddH2O 40.3
[0078] PCR反应条件为：95℃5min；95℃50sec，52℃30sec，72℃45sec，共35个循环；72℃10min；4℃保存。取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，部分检测结果如图3所示，L1、L4～L17、L19、W1细胞样品均扩增出439bp特异性目的条带。取10μl L1、L4～L17、W1样品PCR产物用AluI限制性内切酶进行酶切鉴定，电泳检测酶切情况，检测结果如图4所示，结果表明：L1样品PCR产物仅能够被部分切开，说明PCR产物混合有多种片段，部分片段存在AGCT酶切位点的突变，不能被切开；L4、L5、L6、L8、L11、L12、L14样品PCR产物仅能够被部分切开，说明PCR产物为混合片段，所获得的的细胞克隆为单等位基因突变；
L7、L9、L10、L13、L16样品PCR产物不能被切开，说明所获得的细胞内存在的突变为双等位基因突变；L15、L17、W1样品PCR产物能够被完全切开，说明L15、L17、W1细胞样品未发生突变。
L7、L9、L10、L13、L16样品PCR产物不能被切开，说明所获得的细胞内存在的突变为双等位基因突变；L15、L17、W1样品PCR产物能够被完全切开，说明L15、L17、W1细胞样品未发生突变。
[0079] 将L1、L4、L6、L11、L7、L9、L10、L13、L16细胞基因组扩增产物，以及扩增产物连接T载体后，送华大基因(北京)科技有限公司测序，测序引物为CX-se：TTGGCTTGGCGTTACTCA。
[0080] 测序结果显示：
[0081] (1)L1细胞基因组扩增产物测序结果如图5所示，在山羊MSTN基因exon1序列AGCT位点出现明显套峰，说明在此位点有多种序列信号出现，存在特异的序列改变，证明本实例设计的TALENs具有MSTN基因突变活性；
[0082] (2)L4、L6、L7、L9、L10、L11、L13、L16样品测序结果显示：L4、L6、L7、L9、L10、L11、L13扩增产物直接测序显示在MSTN基因exon1序列AGCT位点附近出现碱基缺失及替换，同时出现重叠峰(如L4样品测序峰图见图6)；扩增产物连接TA克隆测序结果显示L4、L6、L11样品单染色体基因发生突变，L7、L10、L13双染色体等位基因均发生突变，每样品含有的突变情况如图7所示；L9、L16样品等位基因靶位点的突变情况完全一致，为纯合突变，突变情况如图8所示。
[0083] (3)检测结果说明使用本发明的TALENs处理山羊胎儿成纤维细胞时，能够高效定点的对山羊肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)基因进行修饰，从而实现MSTN基因编码序列的改造或敲除。
[0084] 以上实例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。