本发明公开了一种毛蠓特异基因序列。该基因属于COⅠ基因，利用该基因序列可对特定的毛蠓种类进行分子鉴定，从而实现毛蠓的快速鉴定。本发明采用传统的形态学鉴定对毛蠓进行种类鉴定并经权威专家复核，然后通过分子生物学方法获取相应毛蠓种类的特异基因序列，可确保物种鉴定的准确性和可靠性。为该蠓的分子鉴定提供依据。该新种可在植物花粉的传播及环境无害化反应中发挥一定作用。
一种毛蠓特异基因序列
技术领域
[0001] 本发明属于物种鉴定和分子生物学领域，具体涉及毛蠓种类鉴定及其特异基因序列。
背景技术
[0002] 毛蠓是城市绿化带和园林中常见的微型昆虫，属双翅目（Diptera）蠓科（Ceratopogonidae）毛蠓亚科。据目前所知，毛蠓亚科仅包含毛蠓属（Dasyhelea Kieffer，
1911）1属。因毛蠓是非吸血蠓类，对人畜无害，往往不被重视。但毛蠓在传播植物花粉以
及环境无害化反应中的作用已逐渐被人们所关注。
[0003] 长期以来，对毛蠓等蠓类的鉴定主要依靠形态学特征来实现，但近几年，随着DNA测序等技术的进步，人们陆续采用分子生物学方法对蠓类的特征DNA进行研究，以期建立
新的分类方法，与传统分类方法相互作证。
[0004] 线粒体COⅠ基因是蠓类鉴定研究中应用最为广泛的分子标记，目前主要应用于吸血蠓的分子鉴定研究，已成功地鉴定灰黑库蠓和不显库蠓等多个种团中的物种，同样可
以应用于毛蠓的分子鉴定。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供用于毛蠓种类鉴定的特异基因序列。该基因属于CO 基因，利用该基因序列可实现特定毛蠓种类的快速鉴定。
[0006] 为实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：
[0007] 将所得标本制成玻片，在生物显微镜下进行观察，根据标本的形态特征，参照《中国蠓科昆虫》（虞以新主编，2005），进行物种鉴定。
[0008] 采用小型昆虫微量DNA模板制备方法，通过改进的PCR反应条件，由合成的引物扩增该毛蠓新种的COⅠ基因，PCR产物序列送由专业生物公司测定。测序结果通过手工校对、
序列拼接，并在NCBI中进行Blast相似性搜索，确保所得序列为目标序列。所述用于毛蠓
种类鉴定的特异基因序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2（均不含引物序列）所示：
[0009] 、SEQ ID No.1：
[0010] aacattatat tttattttag gagtatgatc tggaatagta ggaacctctc ttagaatttt 60
[0011] aattcgaata gaattagggc atcctggagc tttaattgga gatgatcaaa tttataatgt 120
[0012] aattgtcact gcacatgcat ttattataat tttttttata gttataccta ttataattgg 180
[0013] aggatttgga aattgattag ttcctttaat attaggggcc cctgatatag cttttccccg 240
[0014] aataaataat ataagatttt gaatgttacc cccttcatta tcattattat taattagtag 300
[0015] aatagtagaa aatggagcag gaactggatg aacaatttac ccccccttag caaataacat 360
[0016] tgctcataga ggagcctctg tagatttagc tattttttct cttcatttag ccggtatctc 420
[0017] atcaatttta ggagcaataa attttatcac tactattata aatatacgat caaatggaat 480
[0018] atcttttgac cgaatgccat tatttgtttg atcagtatta attacagcaa tcctattact 540
[0019] tctctcttta cccgttctag ctggagccat tacaatacta ttaacagatc gaaatttaaa 600
[0020] tacatctttt tttgaccctg cgggaggagg agatcctatc ttatatcaac atttattt 658
[0021] 或者
[0022] 、SEQ ID No.2：
[0023] aactttatat tttattctgg gggtatgagc aggaatagta ggaacttctc taagtgtttt 60
[0024] aattcgaaca gaattaggcc accctggaac ttttattgga aatgatcaaa tttataatgt 120
[0025] aattgttact gcccatgctt ttattataat tttttttatg gttataccta ttataatcgg 180
[0026] aggatttgga aattgattag tacctttaat actaggggca ccagatatag ctttcccacg 240
[0027] aataaataat ataagatttt gaatattacc tccttcttta tctttattat taattagtag 300
[0028] aatagtagaa aatggagcag gaacaggatg aactgtttat cctcctttag caagtaatat 360
[0029] tgctcataga ggggcatctg ttgatttggc aattttctct ttacatttag cgggaatttc 420
[0030] atcaatttta ggagctgtaa attttattac tactatcatt aatatacgat ctagcggaat 480
[0031] ttcatttgat cgaatacctt tatttgtgtg atctgttctt attacagcaa ttttattgct 540
[0032] tctttcttta cctgttttag caggggctat tacaatatta ttaacagatc gaaatttaaa 600
[0033] tacctcattt tttgaccccg caggcggggg agacccaatt ttataccaac acttattt 658。
[0034] 所述的毛蠓种类鉴定特异基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列为：
[0035] 正向引物 5’GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G 3’
[0036] 反向引物 5’TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA 3’
[0037] 5、一种用于毛蠓种类鉴定的分子生物学方法，包括：
[0038] 1）从待鉴定的毛蠓组织中分离提取DNA；
[0039] 2）以该DNA为模板，用一对引物：正向引物 5’GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTGG 3’，反向引物 5’TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA 3’，通过聚合酶链式反应扩增出
该毛蠓COⅠ基因；
[0040] 3）然后取适量步骤2）的聚合酶链式反应扩增出的COⅠ基因用琼脂糖电泳分离，经溴乙锭染色后于凝胶成像系统检测，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性扩增
出大小为710 bp的条带，则送生物公司测序；
[0041] 4）根据测序结果，如果与所述基因序列SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的相似性在98%以上，即可分别判断所述的待鉴定毛蠓为泸定毛蠓或西部毛蠓。
[0042] 本发明可用琼脂糖凝胶电泳检测方法检测扩增结果。
[0043] 本发明采用传统的形态学鉴定对毛蠓进行种类鉴定并经权威专家复核，然后通过分子生物学方法获取相应毛蠓种类的特异基因序列，可确保物种鉴定的准确性和可靠性。
附图说明
[0044] 图1为本发明的泸定毛蠓COⅠ基因PCR扩增产物电泳鉴定图。编号说明如下：泳道1为泸定毛蠓雄虫的COⅠ基因，检出大小为710 bp的条带。M为Bio-100 bp的DNA
marker，CK为阴性对照。
[0045] 图2为本发明的西部毛蠓COⅠ基因PCR扩增产物电泳鉴定图。编号说明如下：泳道1为西部毛蠓雄虫的COⅠ基因，检出大小为710 bp的条带。M为Bio-100 bp的DNA
marker，CK为阴性对照。
[0046] 图3未知毛蠓COⅠ基因PCR扩增产物电泳鉴定图。编号说明如下：泳道1为未知毛蠓雄虫的COⅠ基因，检出大小为710bp的条带。M为Bio-100 bp的DNA marker，CK为
阴性对照。
[0047] 图4 未知毛蠓COⅠ基因PCR扩增产物电泳鉴定图。编号说明如下：泳道1为未知毛蠓雄虫的COⅠ基因，检出大小为710 bp的条带。M为Bio-100 bp的DNA marker，CK
为阴性对照。
具体实施方式
[0048] 实施例1
[0049] 1、标本的采集与保存
[0050] 采用挥网法进行采集，采获的标本经冷冻处死后直接保存于95%酒精中。
[0051] 2、标本制作和鉴定
[0052] 取出保存于95%酒精中的标本，用解剖针将头、生殖器部分和翅切下，便于制片。标本制作和鉴定参照《中国蠓科昆虫》（虞以新主编，2005）所描述的方法进行。
[0053] 标本剩余部分移入PCR管中，95%酒精保存，每管一只，并进行唯一性编号，用于DNA提取。若需较长时间保存，则应将装有剩余组织部位的PCR管置于-20℃冰箱冻存。
[0054] 3、DNA模板制备
[0055] 采用小型昆虫微量DNA模板制备方法提取泸定毛蠓DNA（文礼章主编.昆虫学研究方法与技术导论[M]. 北京：科学出版社，2010.278-286），提取的DNA样品于-20℃保存
备用。
[0056] 4、引物合成
[0057] 本实施例所用引物如下：
[0058] 正向引物 5’GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G 3’
[0059] 反向引物 5’TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA 3’。
[0060] 5、PCR扩增
[0061] 本实施例的PCR反应体系如表1所示。
[0062] 表1 毛蠓COⅠ基因PCR反应体系（50uL体系）
[0063]
[0064] 本实施例的反应程序如表2所示。
[0065] 表2毛蠓COⅠ基因PCR反应程序
[0066]
[0067] PCR产物于4℃保存备用。
[0068] 6、PCR扩增产物检测
[0069] 取5μL PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳（130V电压，电泳35 min）。溴乙锭染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱参见附图1。
[0070] 7、基因序列测定
[0071] 选取2-3个效果较好的PCR扩增产物送由生物公司纯化后测序（测序所用引物与PCR所用引物相同），所得基因序列经校正拼接后即为该泸定毛蠓的CO 基因序列—SEQ ID
No.1。
[0072] 实施例2
[0073] 1、标本的采集与保存
[0074] 采用挥网法进行采集，采获的标本经冷冻处死后直接保存于95%酒精中。
[0075] 2、标本制作和鉴定
[0076] 取出保存于95%酒精中的标本，用解剖针将头、生殖器部分和翅切下，便于制片。标本制作和鉴定参照《中国蠓科昆虫》（虞以新主编，2005）所描述的方法进行。
[0077] 标本剩余部分移入PCR管中，95%酒精保存，每管一只，并进行唯一性编号，用于DNA提取。若需较长时间保存，则应将装有剩余组织部位的PCR管置于-20℃冰箱冻存。
[0078] 3、DNA模板制备
[0079] 采用小型昆虫微量DNA模板制备方法提取西部毛蠓DNA（文礼章主编.昆虫学研究方法与技术导论[M]. 北京：科学出版社，2010.278-286），提取的DNA样品于-20℃保存
备用。
[0080] 4、引物合成
[0081] 本实施例所用引物如下：
[0082] 正向引物 5’GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G 3’
[0083] 反向引物 5’TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA 3’
[0084] 5、PCR扩增
[0085] 本实施例的PCR反应体系如表3所示。
[0086] 表3 毛蠓COⅠ基因PCR反应体系（50uL体系）
[0087]
[0088] 本实施例的反应程序如表4所示。
[0089] 表4 毛蠓COⅠ基因PCR反应程序
[0090]
[0091] PCR产物于4℃保存备用。
[0092] 6、PCR扩增产物检测
[0093] 取5μL PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳（130V电压，电泳35 min）。溴乙锭染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱参见附图2。
[0094] 7、基因序列测定
[0095] 选取2-3个效果较好的PCR扩增产物送由生物公司纯化后测序（测序所用引物与PCR所用引物相同），所得基因序列经校正拼接后即为该西部毛蠓的CO 基因序列—SEQ ID
No.2。
[0096] 实施例3
[0097] 1、标本的采集与保存
[0098] 采用挥网法进行采集，采获的标本经冷冻处死后直接保存于95%酒精中。
[0099] 2、试样的选取和和前处理
[0100] 从采集到的蠓类标本中，随机挑选出一只毛蠓，用解剖针将头、生殖器部分和翅切下。剩余部分移入PCR管中，95%酒精保存，每管一只，并进行唯一性编号，用于DNA提取。
[0101] 3、DNA模板制备
[0102] 采用小型昆虫微量DNA模板制备方法提取未知毛蠓DNA（文礼章主编.昆虫学研究方法与技术导论[M]. 北京：科学出版社，2010.278-286），提取的DNA样品于-20℃保存
备用。
[0103] 4、引物合成
[0104] 本实施例所用引物如下：
[0105] 正向引物 5’GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G 3’
[0106] 反向引物 5’TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA 3’
[0107] 5、PCR扩增
[0108] 本实施例的PCR反应体系如表5所示。
[0109] 表5 未知毛蠓COⅠ基因PCR反应体系（50uL体系）
[0110]
[0111] 本实施例的反应程序如表6所示。
[0112] 表6未知毛蠓COⅠ基因PCR反应程序
[0113]
[0114] PCR产物于4℃保存备用。
[0115] 6、PCR扩增产物检测
[0116] 取5μL PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳（130V电压，电泳35 min）。溴化乙锭染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱参见附图3。由附图3看出实施例3的未知毛蠓也
能特异性扩增出大小为710 bp 的产物，将大小为710 bp 的产物送生物公司测序，测试结
果显示与基因序列SEQ ID NO. 1的相似性为99.9%，因而可以确认该未知毛蠓即为泸定毛
蠓。
[0117] 实施例4
[0118] 1、标本的采集与保存
[0119] 采用挥网法进行采集，采获的标本经冷冻处死后直接保存于95%酒精中。
[0120] 2、试样的选取和和前处理
[0121] 从采集到的蠓类标本中，随机挑选出一只毛蠓，用解剖针将头、生殖器部分和翅切下。剩余部分移入PCR管中，95%酒精保存，每管一只，并进行唯一性编号，用于DNA提取。
[0122] 3、DNA模板制备
[0123] 采用小型昆虫微量DNA模板制备方法提取未知毛蠓DNA（文礼章主编.昆虫学研究方法与技术导论[M]. 北京：科学出版社，2010.278-286），提取的DNA样品于-20℃保存
备用。
[0124] 4、引物合成
[0125] 本实施例所用引物如下：
[0126] 正向引物 5’GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G 3’
[0127] 反向引物 5’TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA 3’
[0128] 5、PCR扩增
[0129] 本实施例的PCR反应体系如表7所示。
[0130] 表7 未知毛蠓COⅠ基因PCR反应体系（50uL体系）
[0131]
[0132] 本实施例的反应程序如表8所示。
[0133] 表8未知毛蠓COⅠ基因PCR反应程序
[0134]
[0135] PCR产物于4℃保存备用。
[0136] 6、PCR扩增产物检测
[0137] 取5μL PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳（130V电压，电泳35 min）。溴化乙锭染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱参见附图4。由附图4看出实施例4的未知毛蠓也
能特异性扩增出大小为710 bp 的产物，将大小为710 bp 的产物送生物公司测序，测试结
果显示与基因序列SEQ ID NO. 2的相似性为99.9%，因而可以确认该未知毛蠓即为西部毛
蠓。
