一种基于微粒子化学发光免疫分析技术的睾酮检测试剂

摘要

本发明公开了一种基于微粒子化学发光免疫分析技术的睾酮检测试剂，其按照组成包括以下组分：0.002%-0.01%的顺磁性微球、0.4μg/ml-1.0μg/ml吖啶酯标记的睾酮抗体、复合睾酮释放剂、发光液A和发光液B、0ng/dl-1500ng/dl的睾酮校准品与一定浓度的清洗液；所述睾酮释放剂为双氢睾酮、达那唑与肝素钠的混合物。使本发明具有操作简便、灵敏度高、检测效率快、费用低廉、便于自动化等优点，选用的复合释放剂与不同结合球蛋白结合，可以将血清中结合态的睾酮充分释放出来，使总睾酮的含量测定更为准确。

权利要求

1.一种基于微粒子化学发光免疫分析技术的睾酮检测试剂，其按照组成包括以下组分：0.002%-0.01%的顺磁性微球、0.4μg/ml -1.0μg/ml吖啶酯标记的睾酮抗体、复合睾酮释放剂、发光液A和发光液B、0ng/dl-1500ng/dl的睾酮校准品与一定浓度的清洗液；所述睾酮释放剂为双氢睾酮、达那唑与肝素钠的混合物。

2.根据权利要求1所述的睾酮检测试剂，其特征在于，所述睾酮释放剂按照浓度组成包括以下组分：0.05mg/ml-0.2mg/ml 的双氢睾酮、0.01mg/ml-0.05mg/ml的达那唑与

5-20mg/ml的肝素钠，双氢睾酮、达那唑与肝素钠充分混合形成缓冲溶液。

3.根据权利要求1所述的睾酮检测试剂，其特征在于，所述顺磁性微球为表面包裹带有羧基或氨基活性基团的四氧化三铁，其粒径大小为0.1μm -5μm。

4.根据权利要求1所述的睾酮检测试剂，其特征在于，所述吖啶酯标记的睾酮抗体为单克隆抗体、多克隆抗体中的一种或其混合物。

5.根据权利要求1所述的睾酮检测试剂，其特征在于，所述发光液A为过氧化氢和硝酸水溶液，发光液B为氢氧化钠与聚乙二醇辛基苯基醚水溶液。

6.根据权利要求1所述的睾酮检测试剂，其特征在于，所述的睾酮校准品为含睾酮抗原浓度为0ng/dl-1500ng/dl的溶液；

所述的清洗液包括70g/L的磷酸氢二钠、10g/L的磷酸二氢钠、180g/L的氯化钠、10mL/L的Tween-20 和 2%的液体生物防腐剂Proclin-300。

7.根据权利要求5所述的睾酮检测试剂，其特征在于，所述发光液A中过氧化氢的质量浓度为0.5%-5%，硝酸的浓度为1-2mol/L，发光液B中氢氧化钠的浓度为0.01-2.5 mol/L，TritonX-100的体积浓度为0.1%-5%之间。

说明书

一种基于微粒子化学发光免疫分析技术的睾酮检测试剂

技术领域

[0001] 本发明涉及免疫分析技术领域，尤其涉及一种基于微粒子化学发光免疫分析技术的睾酮检测试剂。

背景技术

[0002] 睾酮是广泛存在于人和动物体内的一种类固醇类激素，准确检测其在生物体内的含量，在判断其生殖性能、正常生理指数及病理浓度而用于疾病的诊治、计划生育、动物的繁殖与育种等方面都有重要的作用。男性体内睾酮由睾丸间质细胞产生，男性血清中睾酮含量是证实可疑睾丸功能紊乱，证明雄性激素缺乏以及检测睾酮代替治疗的最重要的检测参数。女性体内睾酮主要在卵巢中合成，也在肾上腺皮质内合成，女性血清中的睾酮含量用于确定女性雄性激素过多症。

[0003] 目前对睾酮激素检测所采用的方法多是放射免疫分析法和酶免疫分析法。由于放射性元素对环境的污染及其半衰期短等，给操作使用带来不便，限制放射免疫分析的应用；而酶免疫分析法存在灵敏度低、检测范围窄等缺陷无法满足临床要求。因此，现有技术有待于更进一步的改进和发展。

发明内容

[0004] 鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于微粒子化学发光免疫分析技术的睾酮检测试剂，以提高检测灵敏度与检测效率。

[0005] 为解决上述技术问题，本发明技术方案包括：

[0006] 一种基于微粒子化学发光免疫分析技术的睾酮检测试剂，其按照组成包括以下组分：0.002%-0.01%的顺磁性微球、0.4μg/ml-1.0μg/ml的吖啶酯标记的睾酮抗体、复合睾酮释放剂、发光液A和发光液B、0ng/dl-1500ng/dl的睾酮校准品与一定浓度的清洗液；所述睾酮释放剂为双氢睾酮、达那唑与肝素钠的混合物。

[0007] 所述的睾酮检测试剂，其中，所述睾酮释放剂按照浓度组成包括以下组分：0.05mg/ml-0.2mg/ml的双氢睾酮、0.01mg/ml-0.05mg/ml的达那唑与5-20mg/ml的肝素钠，双氢睾酮、达那唑与肝素钠充分混合形成缓冲溶液。

[0008] 所述的睾酮检测试剂，其中，所述顺磁性微球为表面包裹带有羧基或氨基活性基团的四氧化三铁，其粒径大小为0.1μm-5μm。

[0009] 所述的睾酮检测试剂，其中，所述吖啶酯标记的睾酮抗体为单克隆抗体、多克隆抗体中的一种或其混合物。

[0010] 所述的睾酮检测试剂，其中，所述发光液A为过氧化氢和硝酸水溶液，发光液B为氢氧化钠与聚乙二醇辛基苯基醚水溶液。

[0011] 所述的睾酮检测试剂，其中，所述的睾酮校准品为含睾酮抗原浓度为0ng/dl-1500ng/dl的溶液。

[0012] 所述的睾酮检测试剂，其中，所述的清洗液包括70g/L的磷酸氢二钠、10g/L的磷酸二氢钠、180g/L的氯化钠、10mL/L的Tween-20和2%的液体生物防腐剂Proclin-300。

[0013] 所述的睾酮检测试剂，其中，所述发光液A中过氧化氢的浓度为0.5%-5%，硝酸的浓度为1-2mol/L，发光液B中氢氧化钠的浓度为0.01-2.5mol/L，TritonX-100的浓度为0.1%-5%。

[0014] 本发明提供的一种基于微粒子化学发光免疫分析技术的睾酮检测试剂，检测睾酮采用化学发光微粒免疫分析方法，由于激素为小分子，因此选用竞争法进行检测，在血清中，只有2%左右的睾酮处于游离状态，剩下的98%睾酮与性激素结合球蛋白(SHBG)、白蛋白、皮质醇结合球蛋白(CBG)、α1酸性糖蛋白和某些脂蛋白等结合，在体内与游离睾酮保持一定的动态平衡，其中睾酮与性激素结合球蛋白结合力最强，是特异性结合，不易解离；睾酮与白蛋白亲和力较小，但结合的睾酮量极多，属非特异性结合，比较疏松，睾酮易于解离而进入靶组织；睾酮与皮质醇结合球蛋白亲和力小，所占比例较小，睾酮与血液中其他蛋白亲和力很弱，结合的睾酮数量极少，起的作用不大，因此，要将结合态睾酮释放出来需要复合释放剂。其中，双氢睾酮与性激素结合球蛋白的结合力远大于睾酮，能将睾酮从性激素球蛋白上置换出来；肝素钠可以使睾酮与白蛋白的结合力减弱，从而使睾酮释放出来；达那唑等皮质醇类激素与皮质醇结合球蛋白的结合力大于睾酮，从而使睾酮释放出来，使本发明具有操作简便、灵敏度高、检测效率快、费用低廉、便于自动化等优点，选用的复合释放剂与不同结合球蛋白结合，可以将血清中结合态的睾酮充分释放出来，使总睾酮的含量测定更为准确。

具体实施方式

[0015] 本发明提供了一种基于微粒子化学发光免疫分析技术的睾酮检测试剂，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0016] 本发明提供了一种基于微粒子化学发光免疫分析技术的睾酮检测试剂，其按照组成包括以下组分：0.002%-0.01%的顺磁性微球、0.4μg/ml-1.0μg/ml的吖啶酯标记的睾酮抗体、复合睾酮释放剂、发光液A和发光液B、0ng/dl-1500ng/dl的睾酮校准品与一定浓度的清洗液。

[0017] 更具体的，所述睾酮释放剂按照浓度组成包括以下组分：0.05mg/ml-0.2mg/ml的的双氢睾酮、0.01mg/ml-0.05mg/ml的达那唑与5-20mg/ml的肝素钠，双氢睾酮、达那唑与肝素钠充分混合形成缓冲溶液。

[0018] 在本发明的另一较佳实施例中，所述顺磁性微球为表面包裹带有羧基或氨基活性基团的四氧化三铁，其粒径大小为0.1μm-5μm。并且所述吖啶酯标记的睾酮抗体为单克隆抗体、多克隆抗体中的一种或其混合物。所述发光液为过氧化氢和硝酸水溶液以及氢氧化钠与聚乙二醇辛基苯基醚水溶液。

[0019] 更进一步的，所述的睾酮校准品为含一定量睾酮抗原的溶液。所述的清洗液包括70g/L的磷酸氢二钠、10g/L的磷酸二氢钠、180g/L的氯化钠、10mL/L的Tween-20和2%的液体生物防腐剂Proclin-300。而且所述发光液中过氧化氢的浓度为0.5%-5%，硝酸的浓度为1-2mol/L，氢氧化钠的浓度为0.01-2.5mol/L，TritonX-100的浓度为0.1%-5%之间。

[0020] 顺磁性微球-睾酮类似物悬液的制备：

[0021] 顺磁性微球活化：取适量顺磁性微球用磷酸缓冲液清洗，重悬于上述缓冲液中；采用EDC活化，在30-40℃条件下，震荡混匀；

[0022] 包被抗原：将适量的睾酮抗原类似物加入至顺磁性微球重悬液中，25℃-37℃条件下反应2-3小时；25℃-37℃条件下封闭20分钟-40分钟；将包被好的顺磁性微球用磷酸缓冲液清洗，得到免疫顺磁性微球，即免疫磁珠。

[0023] 吖啶酯标记的睾酮抗体的制备：

[0024] 取适量睾酮抗体，用pH9.5,0.5mol/L的磷酸缓冲液稀释至终浓度为20mg/ml，加入适量吖啶酯，缓慢震荡，避光反应二十四小时；混合液经过葡聚糖凝胶G-25柱纯化后得到吖啶酯标记的睾酮抗体。

[0025] 释放剂的制备：

[0026] 取适量双氢睾酮、达那唑分别用DMF溶解，使双氢睾酮和达那唑的浓度为10mg/ml，再将双氢睾酮和达那唑的DMF溶液加入到上述磷酸缓冲液中，使双氢睾酮终浓度为0.1mg/ml，达那唑终浓度为0.01mg/ml；取适量的肝素钠加入到上述磷酸缓冲液中，使肝素钠的浓度为5mg/ml，制得释放剂。

[0027] 发光液的制备：

[0028] 发光液包括A液和B液；

[0029] A液：过氧化氢的质量浓度在0.5%-3%之间，硝酸的摩尔浓度在1-1.5M之间。

[0030] B液：氢氧化钠的摩尔浓度在0.05-1.5M之间，TritonX-100的体积浓度在0.1%-2%之间。

[0031] 睾酮校准品的配制：

[0032] 将睾酮抗原用含3%BSA的去睾酮人血清基质校准品稀释液配制成校准品浓储液，以国家校准品进行定标，将校准品浓储液用校准品稀释液稀释至工作浓度，分别为0，75，250，500，750，1000，1500ng/dL。

[0033] 清洗液的配制：

[0034] 清洗液洗液包括70g/L磷酸氢二钠，10g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/L，Tween-20和2%的液体生物防腐剂Proclin-300，将上述物质充分混合得到清洗液。

[0035] 睾酮检测试剂盒由上述顺磁性微球、吖啶酯标记的睾酮抗体、睾酮释放剂、发光液、睾酮校准品与清洗液组成。。

[0036] 当然，以上说明仅仅为本发明的较佳实施例，本发明并不限于列举上述实施例，应当说明的是，任何熟悉本领域的技术人员在本说明书的教导下，所做出的所有等同替代、明显变形形式，均落在本说明书的实质范围之内，理应受到本发明的保护。

[0037] 实验结果：

[0038] 分析灵敏度定义为：对20次零校准品的测定，取其2倍的平均偏差，其在标准曲线上所对应的浓度即为分析灵敏度；分析灵敏度<10ng/dl，符合标准，数据如下表1所示：

[0039] 表1

[0040]自测
灵敏度 9.98ng/dl

[0041] 线性范围：用Logit-log模型拟合，浓度范围为10-1500ng/dL，对于浓度大于1500ng/dL的标本应先进行稀释后再进行测定；线性系数：r2≥0.99；如表2所示[0042] 表2

[0043]理论浓度（ng/dL） 测试浓度（ng/dL）
1472.73 1317.58
916.97 875.28
496.53 479.69
303.27 295.83
150.56 148.89
77.87 78.01
37.28 37.89
21.25 21.84
13.85 14.35
10.24 10.79

[0044] 精密性：如表3所示

[0045] 表3

[0046]

[0047]

[0048] 试剂盒稳定性：将试剂盒中各试剂组分分别置于4℃和37℃下放置7d，衰减率<10%，稳定性良好。如表4所示，衰减情况如下：

[0049] 表4

[0050]理论值ng/dl 4℃浓度（ng/dL） 37℃浓度（ng/dL） 衰减率
0.0 0.01 0.02 ——
78.3 78.5 80.4 2.42%
297.2 300.4 312.8 4.13%
516.1 519.2 540.6 4.12%
735.0 742.8 769.9 3.65%

[0051] 校准品稳定性：将校准品分别置于4℃和37℃下放置7d，衰减率<10%，稳定性良好。如表5所示，衰减情况如下：

[0052] 表5

[0053]理论值ng/dl 4℃浓度（ng/dL） 37℃浓度（ng/dL） 衰减率
0 0.05 0.09 ——
75 74.8 76.9 2.81%
250 258.6 263.9 2.05%
500 510.2 528.5 3.59%
750 763.1 775.4 1.61%
1000 1086.7 1152.1 6.02%

[0054]1500 1521.1 1545.8 1.62%

[0055] 特异性：如表7所示，与主要类似物的交叉反应情况：

[0056] 表7

[0057]干扰物质 添加量ng/ml 交叉反应百分数
5-α-二氢睾酮 100ng/mL 5.4
雄烯二酮 100ng/mL 0.94
甲基睾酮 100ng/mL 0.68
17β-雌二醇 100ng/mL 0.02
睾酮 1μg/mL 0.1
皮质醇 1μg/mL <0.1
皮质酮 1μg/mL <0.1
环丙氯地孕酮 100ng/mL <0.1
丹那唑 1μg/mL <0.1
雄脂酮硫酸盐 1μg/mL <0.1
11-脱氧皮质醇 1μg/mL <0.1
地塞米松 1μg/mL <0.1