从混合核酸样品分离靶核酸

摘要

本发明提供了用于将靶核酸从混合核酸样品中分离的方法、组合物和试剂盒。所述方法、组合物和试剂盒包括非进行型内切核酸酶(例如，限制性内切酶)或结合靶核酸(例如，具有甲基化特异性)的抗体。混合核酸样品可包含原核和真核生物核酸和/或来自超过一种原核或真核生物体的核酸。

权利要求

1.一种用于从包含靶核酸和非靶核酸的混合样品分离靶核酸的方法，包括：(i)将所述混合样品与非进行型内切核酸酶接触；

其中所述非进行型内切核酸酶结合靶核酸，但不切割靶核酸；

其中形成所述非进行型内切核酸酶与所述靶核酸的复合物；和(ii)将包含所述复合物的样品的第一级份与包含所述非靶核酸的样品的第二级份分开；

所述混合样品包含来自至少两种不同原核生物体的核酸，来自人和细菌生物体的核酸，来自原核和真核生物体的核酸，来自至少两种不同的真核生物体的核酸，或来自未知生物体的核酸。

2.权利要求1的方法，其中所述混合样品包含腐殖酸，或环境或临床污染物。

3.权利要求1的方法，其中所述混合样品包含柴油机烟尘。

4.权利要求1的方法，其中所述接触在具有适合于所述非进行型内切核酸酶结合靶核酸但不切割所述靶核酸的条件的缓冲液中进行。

5.权利要求4的方法，其中所述述缓冲液包含适合于所述非进行型内切核酸酶结合靶核酸但不切割靶核酸的Mg2+浓度。

6.权利要求4的方法，其中所述缓冲液包含浓度为至少50mM的Ca2+。

7.权利要求4的方法，其中所述缓冲液包含为缓冲液的Mg2+浓度至少500倍的Ca2+浓度。

8.权利要求1的方法，其中所述非进行型内切核酸酶结合甲基化的核苷酸。

9.权利要求8的方法，其中所述非进行型内切核酸酶结合N4-甲基胞嘧啶或N6-甲基腺嘌呤。

10.权利要求1的方法，其中所述非进行型内切核酸酶被C5-甲基胞嘧啶抑制。

11.权利要求1的方法，其中所述非进行型内切核酸酶以等于或大于靶DNA的摩尔比存在。

12.权利要求1的方法，其中所述非进行型内切核酸酶包含可检测的标记。

13.权利要求1的方法，其中所述非进行型内切核酸酶具有低于结合靶核酸且切割靶核酸的对照内切核酸酶的10％的催化活性。

14.权利要求1的方法，其中所述非进行型内切核酸酶是重组酶、解离酶、转座酶、整合酶、修复酶或硫代磷酸酯蛋白。

15.权利要求1的方法，其中分离的核酸是至少90％的靶基因组。

16.权利要求1的方法，其中所述方法需要少于80分钟来完成。

17.权利要求1的方法，其中所述混合样品中的至少90％的靶核酸被分离至所述第一级份中。

18.权利要求1的方法，其中所述混合样品包含：相对于靶核酸的量至少100,000倍的量的非靶核酸。

19.权利要求1的方法，其中所述混合样品包含少于10pg的靶核酸。

20.权利要求1的方法，其还包括：

(iii)将(ii)的第一级份与非进行型内切核酸酶接触；

其中所述非进行型内切核酸酶结合所述靶核酸，但不切割所述靶核酸；

其中形成所述非进行型内切核酸酶与所述靶核酸的复合物；和(vi)将包含(iii)的复合物的级份与包含非靶核酸的样品的级份分开。

21.权利要求1的方法，其中所述非进行型内切核酸酶结合至固体基质。

22.一种用于从包含靶核酸和非靶核酸的混合样品分离靶核酸的方法，包括：(i)将所述混合样品与非进行型限制性内切酶接触；

其中所述非进行型限制性内切酶结合靶核酸，但不切割靶核酸；

其中形成所述非进行型限制性内切酶与所述靶核酸的复合物；和(ii)将包含所述复合物的样品的第一级份与包含所述非靶核酸的样品的第二级份分开。

23.权利要求22的方法，其中所述非进行型限制性内切酶是DpnI。

24.权利要求22的方法，其中所述混合样品包含腐殖酸，或环境或临床污染物。

25.权利要求22的方法，其中所述混合样品包含柴油机烟尘。

26.权利要求22的方法，其中所述接触在具有适合于所述非进行型限制性内切酶结合靶核酸但不切割所述靶核酸的条件的缓冲液中进行。

27.权利要求22的方法，其中所述方法需要少于80分钟来完成。

28.权利要求22的方法，其中所述混合样品中的至少90％的靶核酸被分离至所述第一级份中。

29.权利要求22的方法，其中所述混合样品包含少于10pg的靶核酸。

30.权利要求22的方法，其中所述非进行型内切核酸酶结合至固体基质。

31.一种用于从包含靶核酸和非靶核酸的混合样品分离靶核酸的试剂盒，其包括：(i)结合靶核酸但不切割所述靶核酸的非进行型内切核酸酶；和(ii)具有适合所述非进行型内切核酸酶结合靶核酸但不切割所述靶核酸的条件的缓冲液，其中所述缓冲液包含至少50mM的Ca2+浓度。

32.权利要求31的试剂盒，其中所述缓冲液包含为缓冲液的Mg2+浓度至少500倍的Ca2+浓度。

33.权利要求31的试剂盒，其中所述缓冲液包含小于10mM的Mg2+浓度。

34.权利要求33的试剂盒，其中所述缓冲液包含至少10mM的EDTA浓度。

35.权利要求33的试剂盒，其中所述缓冲液包含约100mM的EDTA浓度。

36.权利要求31的试剂盒，其中所述缓冲液包含至少10mM的EDTA浓度。

37.权利要求31的试剂盒，其中所述缓冲液包含约100mM的EDTA浓度。

38.权利要求31的试剂盒，其中所述非进行型内切核酸酶结合N4-甲基胞嘧啶或N6-甲基腺嘌呤。

39.权利要求31的试剂盒，其中所述非进行型内切核酸酶被C5-甲基胞嘧啶抑制。

40.权利要求31的试剂盒，其中所述非进行型内切核酸酶是非进行型限制性内切酶。

41.权利要求31的试剂盒，其中所述非进行型限制性内切酶是DpnI。

42.权利要求31的试剂盒，其中所述非进行型内切核酸酶包含可检测的标记。

43.权利要求31的试剂盒，其中所述非进行型内切核酸酶是生物素化的。

44.一种用于从包含靶核酸和非靶核酸的混合样品分离靶核酸的试剂盒，其包括：(i)结合靶核酸但不切割所述靶核酸的非进行型内切核酸酶；和(ii)具有适合所述非进行型内切核酸酶结合靶核酸但不切割所述靶核酸的条件的缓冲液，其中所述缓冲液包含小于10mM的Mg2+浓度。

45.权利要求44的试剂盒，其中所述缓冲液包含至少10mM的EDTA浓度。

46.权利要求44的试剂盒，其中所述非进行型内切核酸酶结合N4-甲基胞嘧啶或N6-甲基腺嘌呤。

47.权利要求44的试剂盒，其中所述非进行型内切核酸酶被C5-甲基胞嘧啶抑制。

48.权利要求44的试剂盒，其中所述非进行型内切核酸酶是非进行型限制性内切酶。

49.权利要求44的试剂盒，其中所述非进行型内切核酸酶是DpnI。

50.权利要求44的试剂盒，其中所述非进行型内切核酸酶包含可检测的标记。

51.权利要求44的试剂盒，其中所述非进行型内切核酸酶是生物素化的。

52.一种用于从包含靶核酸和非靶核酸的混合样品分离靶核酸的试剂盒，其包括：(i)结合靶核酸但不切割所述靶核酸的非进行型内切核酸酶，其中所述非进行型内切核酸酶包含可检测的标记；和(ii)具有适合所述非进行型内切核酸酶结合靶核酸但不切割所述靶核酸的条件的缓冲液。

53.权利要求52的试剂盒，其中所述非进行型内切核酸酶是生物素化的。

54.权利要求52的试剂盒，其中所述非进行型内切核酸酶结合N4-甲基胞嘧啶或N6-甲基腺嘌呤。

55.权利要求52的试剂盒，其中所述非进行型内切核酸酶被C5-甲基胞嘧啶抑制。

56.权利要求52的试剂盒，其中所述非进行型内切核酸酶是非进行型限制性内切酶。

57.权利要求52的试剂盒，其中所述非进行型限制性内切酶是DpnI。

58.权利要求52的试剂盒，还包含：

(iii)结合所述非进行型内切核酸酶的固体支持材料。

59.权利要求58的试剂盒，还包含：

(iv)特异于生物素化的结合剂。

60.权利要求59的试剂盒，还包含：

(v)甲基化的核酸阳性对照。

说明书

从混合核酸样品分离靶核酸

[0001] 关于联邦政府资助的研究或开发的声明

[0002] 本发明是在由国土安全部授予的合同号：

[0003] HSHQDC‐10‐C‐00019下通过政府支持进行的。政府具有本发明的某些权利。

[0004] 关于电子提交的序列表

[0005] 将电子提交的序列表(名称：

[0006] 3179_0010001_SEQIDListingPCTascii.txt；大小:2,226字节；创建日期：2012年6月26日)的内容通过引用整体并入本文。

[0007] 发明背景

[0008] 本发明总地来说涉及用于从混合核酸样品分离靶核酸的方法和组合物。

[0009] 生物威胁物的快速检测和详尽分析在缓和对目标群体的影响中是非常重要的。检测和分析的一般方法是收集环境样品(空气、水、食物、人组织)并且确定样品是否包含来自生物威胁物(细菌、病毒等)的任何核酸(DNA或RNA)。该方法中主要遇到的问题是环境样品不是纯的，通常包含比靶生物威胁物核酸显著更多的本底真核生物核酸，从而使得难以分离或扩增靶核酸。事实上，原核和真核生物核酸的复杂混合物在自然界中是常见的；生物体的混合群体存在于空气、水和土壤中，并且细菌和植物或人的共生体是生命的真实状态。除了检测样品中的这些生物威胁物外，还存在从更大的真核生物基因组(2.3兆碱基-16千兆碱基)分开和分离相对小的生物威胁物例如细菌(4-6兆碱基)的基因组的研究和商业原因。换句话说，该基因组大小差异相当于单个人细胞给混合物提供为单个大肠杆菌(E.coli)细胞的约1000倍的遗传物质。这具有从大多数混合样品产生巨大量的真核生物DNA的作用， 从而妨碍混合样品中细菌的检测和鉴定。

[0010] 败血症是其中生物威胁物的检测是非常困难的状况的一个实例。败血症是世界范围内非冠脉重症监护病房的首要致死原因，并且其复杂病原范围包括革兰阳性和革兰阴性细菌。已报道血液中的细菌水平超过1000个菌落形成单位(CFU)/mL血液，在其它情况下少于1CFU/mL血液。即使在最高浓度水平(约1000个细菌/ml血液)，细菌DNA相较于相同体积中的109个血细胞(107个包含DNA)(这等同于人DNA是细菌DNA的1000万倍)也是微不足道的。

[0011] 从包含真核生物DNA的混合样品分开和分离细菌DNA的综合解决方法目前还不可获得。通常培养混合样品以差异性扩大细菌在样品中的百分比。实际上，对于败血症，参照实验室中病原体鉴定的标准仍然是通过培养物的检测。一般地，培养物需要1至5天来使病原体充足地生长出来以进行确认。培养法也是用于食品测试和环境样品的标准。通过监控炭疽芽孢杆菌(B.anthraxcis)-特异性噬菌体产生的斑，细菌感染的鉴定在炭疽感染中变得更快，提供了大于90%的灵敏度和特异度。然而，FDA批准的噬菌体裂解测定是基于实验室的，需要由熟练技术员花费8-24小时来完成，并且仅仅是枚举细菌而非将其纯化出来进行分析。

[0012] 作为基于培养物的检测法的替代法，可将从混合原核/真核生物环境样品分离的核酸经历基于高灵敏性聚合酶链式反应(PCR)的测定来检测生物威胁物靶序列。例如，FDA已批准了用于从鼻拭子鉴定特定威胁物例如金黄色葡萄球菌(S.aureus)和链球菌属的某些种(Streptococcus spp.)的快速实时PCR技术。金黄色葡萄球菌Gene Ohm试剂盒(Becton Dickinson,USA)需要鼻拭子的悬浮物，快速裂解，随后在约2小时内以公布的98.9%的灵敏度和96.7%的特异度进行扩增。然而，鼻拭子样品的真核生物核酸本底相较于血液样品较低。此外，该方法限定于特定细菌的单纯检测，从而不允许分离和纯化细菌靶基因组以进行分析，从而在检测未知原核生物威胁物中是无效的。

[0013] 血液中细菌的检测已从通过机械/化学裂解产生的粗制裂解物实 现。在该方法中，原核生物DNA的检测需要昂贵的实时PCR测定，例如Roche SeptiFastTM系统，或可选择地，质谱测定例如Abbot Plex-ID系统。这些系统未被FDA批准，并且仅可处理1.5ml的血液，限制了其灵敏度。此外，这些测定也不允许从原核生物威胁物分离和纯化遗传物质以用于另外的分析。

[0014] 因此，需要允许选择性分离混合样品中的原核生物核酸，从而允许进一步分析和表征靶原核生物基因组的方法。此外，需要允许基于非特异性原核生物性状的分开和分离以便可能鉴定和表征先前未知的细菌威胁物的方法。最后，需要不需要昂贵的定量PCR测定的方法。

[0015] 发明概述

[0016] 鉴于与目前分离方案相关的问题，本发明提供了用于从核酸的混合样品高效分离核酸(例如，将原核生物或细菌核酸与真核生物核酸分开)的方法、组合物和试剂盒。在一些实施方案中，方法利用对于原核生物界独特的DNA的表观遗传学修饰，从而提供了原核生物核酸从混合环境或临床样品的快速高效分离和鉴定。这样，本发明允许快速诊断和允许进一步基因组表征和分析生物威胁物。

[0017] 在一个实施方案中，方法包括步骤：(1)在足以允许表观遗传结合剂与具有表观遗传学修饰的核酸形成复合物的条件下，将表观遗传结合剂应用于样品；(2)分离表观遗传学结合剂/核酸复合物；(3)纯化存在于分离的复合物中的核酸；和(4)分析纯化的核酸。在一个方面，表观遗传学结合剂是特异性结合原核生物表观遗传学修饰的分子或分子复合物，所述表观遗传学修饰是例如选自N4-甲基胞嘧啶(N4mC)、N6-甲基腺嘌呤(N6mA)和任何其它原核生物特异性表观遗传学修饰。表观遗传学结合剂选自多克隆抗体、单克隆抗体、缀合的多克隆或单克隆抗体、限制性内切酶、缀合的限制性内切酶、结合-突变型限制性内切酶以及具有对于上述表观遗传学修饰的特异性亲和力的其它分子或分子复合物。

[0018] 在另一个实施方案中，提供了表观遗传学特异性降解法。方法包 括在足以允许表观遗传学特异性降解因子在缺乏特定表观遗传学修饰的序列上选择性切割核酸的条件下将表观遗传学特异性降解因子应用于样品，其中所述表观遗传学修饰存在于靶核酸中。在表观遗传学特异性切割后，非靶核酸被耗尽，并且靶核酸被分析。可向该方法添加额外的步骤，所述步骤将在下文中的详细说明中进行进一步论述。

[0019] 在另一个实施方案中，提供了表观遗传学-结合剂组合物。在优选实施方案中，表观遗传学结合剂是针对特异于靶核酸的表观遗传学修饰例如N4mC或N6mA的单克隆抗体或其抗原结合片段。在相关实施方案中，表观遗传学结合剂是突变的限制性内切酶，其在具有特异于靶核酸的表观遗传学修饰的子序列上选择性结合靶核酸，但不切割靶核酸。在任一实施方案中，任选地生物素化表观遗传学结合剂，或用第二分子缀合表观遗传学结合剂以帮助从样品分离结合剂/核酸复合物。

[0020] 本发明不限于上述实施方案，根据下文中的详细说明中提供的论述和实施例其它实施方案和应用将变得显然。

[0021] 附图概述

[0022] 根据下列详细说明和附图，可更全面地理解本发明的不同实施方案，所述详细说明和附图形成了本申请的部分。

[0023] 图1A显示了用于MADA展示的合成接头的序列(SEQ ID NO:1)。接头具有与GATC位点相容的多核苷酸悬突。引物使得能够扩增包含接头的片段(例如，引物#1和引物#2，如所标示)(SEQ ID NO:8和9)。必要时存在NotI限制性位点以用于片段的线性化。图1B显示可用于MADA展示的替代性合成接头序列(SEQ ID NO:2-7，其中SEQ ID NO:2与3退火，SEQ ID NO:4与5退火，SEQ ID NO:6与7退火)。

[0024] 图2显示甲基化选择性降解使得能够分离原核生物(大肠杆菌)和真核生物(小麦)DNA。DpnI仅切割在GATC位点的腺嘌呤上甲基化的DNA。DpnII仅当GATC未被甲基化时才切割。细菌和真核生物DNA的混合物是差异限制性的，从而使得能够通过限制性末端的尺寸或相容性来进行分离。

[0025] 可作图的序列读出的超高通量筛选(UHTS)鉴定在图3中显示了细菌的富集。将序列的MegaBlast分类作图，显示了细菌序列的近30倍的富集(图3A和3B)。还显示了纯化前和纯化后降解的生物体混合物中包含GATC位点的序列读出的分析(图3C和3D)。

[0026] 图4显示N6mA富集导致大肠杆菌K-12MG1655的高均匀覆盖。将ICx Bioassays SPEED导管用于将每一个读出的前32bp定位至染色体的线性图示。(图4A和4C)。覆盖深度从富集前的0.24跃升至富集后的6.0X。列出了99%的所得覆盖水平。(图4B和4D)。按位置的覆盖显示在整个染色体上的平均分布。

[0027] 图5显示连接至粘性BamHI末端的接头使分子环化并且保护它们免受降解，从而使得能够进行PCR扩增。

[0028] 图6显示线性相对于环状DNA分子的选择性降解，这使得能够选择性扩增靶分子。DpnII限制性酶切的人基因组DNA(gDNA)对质粒安全性DNA酶敏感(比较泳道2和3)，而通过接头连接产生的环状分子(泳道5,pUC19对照)对所述酶不敏感。

[0029] 图7显示利用接头连接的表观遗传学特异性降解法对于分离和扩增混合样品中的靶DNA是有效的。

[0030] 图8显示利用接头连接的表观遗传学特异性降解法有效地扩增细菌基因组DNA，同时选择性降解单个混合物中的人基因组DNA。

[0031] 图9在表观遗传学特异性富集后使用QPCR定量细菌基因组富集和人基因组降解的水平。针对人男性DNA的DYZ基因座和大肠杆菌细菌DNA的16S基因座的引物和探针用于测量扩增前和扩增后混合物中来自每一种生物体的基因组DNA的水平。

[0032] 图10显示在修饰条件下，限制性内切酶能选择性结合N6mA而不进行切割。

[0033] 图11显示生物素化的DpnI(bDpnI)优先于重叠的未甲基化的651bp DNA片段特异性结合甲基化477bp DNA片段并且阻滞其凝胶迁移。

[0034] 图12显示首先与甲基化的477bp DNA片段一起温育、随后与抗 生物素蛋白珠粒一起温育的bDpnI显示出比用bDpnI预先涂覆抗生物素蛋白珠粒时更低的特异性。

[0035] 图13显示通过凝胶分析评估的靶DNA在前哨DNA片段上的结合的特异度。将100ng的非靶DNA片段(651bp)和100ng的靶DNA片段(477bp)混合，将其与80ul至180ul的bDpnI涂覆的抗生物素蛋白珠粒结合。30分钟后，将来自洗涤或洗脱级份的样品加载至琼脂糖凝胶上。前哨片段可用作评估反应的效率的对照。

[0036] 图14显示从包含1ug的人DNA的混合样品回收细菌靶DNA的效率。将递减量的大肠杆菌基因组DNA(10ng-1pg)掺入1ug的人DNA。利用针对细菌16S和人DYZ(各自针对它们各自的标记物频率进行标准化)的定量聚合酶链式反应(qPCR)评估回收。

[0037] 图15显示细菌和人DNA的结合时间过程，所述结合时间过程显示本发明的实施方案的快速结合和高度特异性。将bDpnI涂覆的珠粒添加至500pg的大肠杆菌(带方框的虚线)与1ug的人男性DNA(带圆圈的虚线)的混合物中。在指定的时间上，利用磁铁收集珠粒并洗涤。将大肠杆菌的16S基因和人的DYZ的qPCR用于定量结合的量。

[0038] 图16显示示例性基因组混合物以及SCODA和DpnI富集法的作用。

[0039] 图17显示DpnI富集使基因组覆盖增加至约15倍而不在整个4.6MB基因组上引入显著的偏向性。图17A显示富集前覆盖，插图以20倍增加的尺度显示相同的数据来突出显示富集前基因组覆盖模式。图17B显示富集后覆盖显著增加。显示了关键特征例如基因组覆盖的低和高点(分别为末端和复制起始点(OriC))，和覆盖中的人工掺入(细菌噬菌体DLP、Rec和Qin)。

[0040] 图18显示抗血清对N6-甲基-2-脱氧腺苷(N6mA)的特异性。通过利用不同水平的腺嘌呤(方块)或N6mA(菱形)攻击在竞争性ELISA版式中测试一式三份血清样品。误差棒描述了样品间的标准差。仅100ng的N6mA导致50%的血清对N6mA涂覆的ELISA板的结合的抑制。与之相比较，10ug的腺嘌呤(试剂的100倍增加)导致约30%的抑制。

[0041] 图19显示来自甲基化和未甲基化的寡核苷酸上的测试的多克隆和单克隆抗体的ELISA信号。图19A显示将含腺嘌呤(A)或N6m-腺嘌呤(6mA或N6mA)的寡核苷酸固定在微量滴定孔中，并且测试其对不同抗体的结合。来自N6mA寡核苷酸的高信号和相应地来自未甲基化的寡核苷酸的低信号表示特异性，如通过3个分隔的克隆所例示的。可将这些与来自小鼠1、4、8、9的最终取血多克隆血清(4个分隔的克隆)相比较。也显示了无抗体对照(无abs)。图
19B显示6mA对A的信号比。

[0042] 图20显示图19的抗体对人和大肠杆菌基因组DNA的特异性。通过滴定每一个孔中的列出的基因组DNA进行ELISA。450mm处的光密度(OD450)显示抗体对每一个基因组的反应性。

[0043] 图21显示实施例7的方法的流程图。

[0044] 图22显示掺入土壤样品的大肠杆菌DNA相较于单独的大肠杆菌DNA不能扩增，这表明PCR的抑制剂存在于土壤样品中。从喜林芋属或鸡蛋花属植物下方收集富含腐殖酸的商业表层土壤样品。级份表示为"非靶"或"靶"，如实施例8中描述的。

[0045] 图23显示从河床淤泥或浅表河水、赭石包被的沙或火山泥分离的DNA的16S PCR特征谱。无模板对照(NTC)和人DNA不被16S引物扩增，而100ng的大肠杆菌产生具有细菌生物体的特征的条带。此外，来自河床淤泥、珊瑚砂丘和火山泥洗液的分离的DNA和未结合的级份不扩增。结合和洗脱的级份从所有样品扩增。

[0046] 图24显示黑麦花粉对利用和不利用DpnI富集的大肠杆菌16SqPCR测定的影响。将通过16S qPCR测定检测的大肠杆菌DNA的量作为花粉输入物的函数作图(实线)，而大肠杆菌的水平保持恒定(虚线)。随后将抑制水平的花粉(10,000和100,000ug/ml)掺入使用DpnI分离的大肠杆菌样品。将结合的("DpnI结合的%")和未结合的("DpnI未结合的%")级份中检测到的大肠杆菌DNA的量以占大肠杆菌DNA的总量的百分比作图。

[0047] 发明详述

[0048] 本发明涉及特异于来自特定来源的核酸的表观遗传学修饰的利用。在一个应用中，本发明的实施方案可用于分开和分离存在于包含过量真核生物DNA的样品中的原核生物DNA。更具体地，本发明的实施方案涉及利用对于原核生物DNA独特的表观遗传学修饰，以选择性分离和分析在混合样品中发现的原核生物DNA。

[0049] 在一些实施方案中，本发明涉及用于从包含靶核酸和非靶核酸的混合样品分离靶核酸的方法。在一些实施方案中，方法包括将所述混合样品与非进行型内切核酸酶或结合靶核酸(例如，结合靶核酸的表观遗传学修饰或甲基化)的抗体或其抗原结合片段接触。在一些实施方案中，方法包括(i)将混合样品与非进行型内切核酸酶或结合靶核酸的抗体或其抗原结合片段接触；和(ii)将包含复合物的样品的第一级份与包含非靶核酸的样品的第二级份分开。在一些实施方案中，方法包括(i)将所述混合样品与非进行型内切核酸酶或结合靶核酸的抗体或其抗原结合片段接触，其中形成非进行型内切核酸酶或抗体或其抗原结合片段与靶核酸的复合物；和(ii)将包含复合物的样品的第一级份与包含非靶核酸的样品的第二级份分离。在一些实施方案中，保留第一级份和第二级份。在一些实施方案中，非进行型内切核酸酶结合靶核酸，但不切割靶核酸。在一些实施方案中，方法还包括(iii)将(ii)的第一级份与非进行型内切核酸酶或结合靶核酸的抗体或其抗原结合片段接触；其中非进行型内切核酸酶结合靶核酸，但不切割靶核酸；其中形成非进行型内切核酸酶或抗体或其抗原结合片段与靶核酸的复合物；和(vi)将包含(iii)的复合物的级份与包含非靶核酸的样品的级份分离。

[0050] 本发明的其它实施方案涉及用于富集包含靶核酸和非靶核酸的混合样品中的靶核酸的方法。在一些实施方案中，方法包括利用切割靶核酸但不切割非靶核酸的甲基化敏感性或甲基化依赖性内切核酸酶降解所述混合样品，或用结合表观遗传学修饰的抗体或其抗原结合片段温育所述混合样品。在一些实施方案中，方法还包括利用内切核酸酶降解样品；其中内切核酸酶切割非靶核酸但不切割靶核酸，从而导致与切割的靶核酸不相容的非靶核酸末端。在一些实施方案中，方法还 包括将连接子连接至切割的靶核酸，或环化切割的靶核酸。在一些实施方案中，方法还包括耗尽非靶核酸。

[0051] 本发明还涉及用于将靶核酸与混合样品分离的组合物和试剂盒。在一些实施方案中，组合物包含(i)含有靶核酸和非靶核酸的混合样品和(ii)结合靶核酸但不切割靶核酸的非进行型内切核酸酶，或结合靶核酸的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，试剂盒包括(i)结合靶核酸但不切割靶核酸的生物素化的非进行型内切核酸酶；和(ii)具有适合于非进行型内切核酸酶结合靶核酸但不切割靶核酸的条件的缓冲液。在一些实施方案中，试剂盒包括识别甲基化核酸的生物素化的非进行型内切核酸酶。在其它实施方案中，试剂盒包括(i)结合靶核酸但不切割靶核酸的生物素化的非进行型内切核酸酶，或结合靶核酸的生物素化抗体或其抗原结合片段；(ii)固体支持材料；和(iii)特异于生物素化的结合剂。在一些实施方案中，试剂盒还包括甲基化核酸阳性对照。

[0052] DNA的修饰见于所有界中。追寻本发明，检查DNA甲基化的不同形式，并指出N4-甲基胞嘧啶(N4mC)和N6-甲基腺嘌呤(N6mA)仅见于或主要见于细菌中。N6mA特别具有吸引力，因为其作为DNA腺嘌岭甲基化酶(DAM)蛋白修饰的结果仅见于细菌中，虽然在原核生物中还存在其它腺嘌呤甲基化酶。DAM是在细菌(包括但不限于霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotubercolosis))中发现的必需腺嘌呤甲基化酶。表1提供了显示dam甲基化的细菌的非完全列表。许多细菌在GATC序列内的腺嘌呤的N6位置甲基化，所述甲基化在染色体中大致每256个碱基发生一次，从而产生遍在的靶。细菌毒力通过N6mA进行控制，包括鞭毛、菌毛、粘着蛋白的产生、II、III和IV型分泌、毒素合成和输出。当细菌复制它们的基因组时，它们可通过甲基化的不存在将初生子链与亲代区分开来。因此，本发明的实施方案利用了细菌籍以识别它们自己的亲代DNA的该机制，这是对细菌的存活和病原性至关重要的功能，对于该功能已进行了研究。先前已利用抗体实现了除N6mA外的修饰的核苷酸的检测。

[0053] 表1.使用dam甲基化的威胁性细菌

[0054]

[0055]

[0056] 基于这些观察，本发明的一些实施方案利用可利用N6mA在细菌中的存在的分子。在一个实施方案中，提供了包含针对N6mA的抗体或其抗原结合片段的表观遗传学-结合剂组合物。含N6mA的DNA的免疫分离对于在测试的细菌中给予每KB大于1个N6mA的平均频率的细菌DNA可能是高度广泛的。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是由在ATCC保藏号PTA-13262或PTA-13263下保藏的杂交瘤细胞系产生的分离的抗体或其抗原结合片段。这提供了细菌DNA中的非序列特异性靶。可任选地生物素化或缀合抗体或其抗原结合片段以允许选择性分离。将抗体或其抗原结合片段用作表观遗传学结合剂提供了更加通用的替代品，因为其不依赖于特定序列基序(如在限制性内切酶实施方案中的情况那样)，从而可用于范围广泛的通常具有特定表观遗传学修饰的细菌。

[0057] 在一些实施方案中，本发明提供了由实施例中描述的和以ATCC保藏名称PTA-13262于2012年10月2日保藏在在美国典型培养物保 藏中心(ATCC),10801University Bouleard,Manassas,VA,20110-2209的，以ATCC保藏名称PTA-13263于2012年10月2日保藏在ATCC的杂交瘤细胞系产生的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供了以ATCC保藏名称PTA-13262于2012年10月2日保藏在ATCC的和以ATCC保藏名称PTA-13263于
2012年10月2日保藏在ATCC的杂交瘤细胞系。在一些实施方案中，本发明提供了由在ATCC保藏名称号PTA-13262或PTA-13263下保藏的杂交瘤细胞系产生的分离的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供了在ATCC保藏名称号PTA-13262或PTA-13263下保藏的杂交瘤细胞系。

[0058] 在一些实施方案中，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段结合与被ATCC保藏名称号PTA-13262或PTA-13263下保藏的杂交瘤细胞系产生的抗体或其抗原结合片段结合的抗原大体上相同的抗原。可利用本领域已知的方法鉴定分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段结合与被ATCC保藏名称号PTA-13262或PTA-13263下保藏的杂交瘤细胞系产生的抗体或其抗原结合片段结合的抗原大体上相同的抗原。例如，配对结合实验测试两种抗体或抗原结合片段同时结合相同抗原的能力。针对分开的表位的抗体或其抗原结合片段将独立地结合，而针对相同或密切相关的表位的抗体将干扰彼此的结合。利用 的这些结合实验是容易进行的。例如，可
使用捕获分子结合第一抗体或抗原结合片段，随后相继地添加抗原和第二抗体或抗原结合片段。传感图将显示：(1)有多少抗原结合第一抗体或抗原结合片段，(2)第二抗体或抗原结合片段与表面附着的抗原所结合的程度，(3)如果第二抗体或抗原结合片段不结合，逆转配对测试的顺序是否改变结果。竞争性 ELISA实验(例如实施例6中描述的)还测试两种抗体或抗原结合片段同时结合相同抗原的能力。Itoh,K.,M.Mizugaki and N.Ishida,Preparation of a monoclonal antibody specific for1-methyladenosine and its application for the detection of elevated levels of1-methyladenosine in urines from cancer patients.Jpn J Cancer Res,1988.79(10):p.1130-8。

[0059] 在一些实施方案中，此类抗体或其抗原结合片段用于本发明的用于从混合样品分离靶核酸的方法、组合物和试剂盒。

[0060] 在本发明的其它实施方案中，非进行型内切核酸酶用于本发明的用于从混合样品分离靶核酸的方法、组合物和试剂盒。如本文中所使用，"非进行型内切核酸酶"是具有减小的或消除的内切核酸酶活性的修饰的内切核酸酶。这样的修饰的实例包括例如减小或消除内切核酸酶活性的内切核酸酶的突变或缓冲条件。可以是非进行型的内切核酸酶的实例包括例如限制性内切酶(例如，DpnI)、重组酶、解离酶、转座酶、整合酶或修复酶。此外，本发明的非进行型内切核酸酶当结合DNA时对表观遗传学修饰敏感(例如，具有甲基化敏感性)。

[0061] 在一些实施方案中，非进行型内切核酸酶具有例如比未修饰的内切核酸酶低10%、低9%、低8%、低7%、低6%、低5%、低4%、低3%、低2%、低1%、低0.9%、低0.8%、低0.7%、低0.6%、低0.5%、低0.4%、低0.3%、低0.2%或低0.1%或其值的任何范围的催化活性。在一些实施方案中，非进行型内切核酸酶具有比未修饰的内切核酸酶低例如10%至0.01%、9%至0.01%、8%至
0.01%、7%至0.01%、6%至0.01%、5%至0.01%、4%至0.01%、3%至0.01%、2%至0.01%、1%至0.01%、
10%至1%、9%至1%、8%至1%、7%至1%、6%至1%、5%至1%、4%至1%、3%至1%或2%至1%的催化活性。用于测定非进行型内切核酸酶的催化活性的方法在本领域中是已知的并且描述于本文中。

[0062] 在另一个实施方案中，本发明的限制性内切酶适合于在具有特定表观遗传学修饰的子序列上选择性结合但不切割所述序列。限制性内 切酶活性可以例如通过除去金属离子辅因子或可选择地通过蛋白质本身的氨基酸点突变来进行修饰。这允许选择性结合不具有表观遗传学修饰的DNA(例如不具有N6mA的真核生物DNA)或具有期望的表观遗传学修饰的DNA(具有N6mA的细菌DNA)以纯化和分析目标级份。表2提供了具有甲基化特异性的限制性内切酶和DNA蛋白结合剂的列表(Roberts,R.J.,等人,REBASE--a database for DNA restriction and modification:enzymes,genes and genomes.Nucleic Acids Res.38(Database issue):p.D234-6)。

[0063] 表2.具有甲基化特异性的限制性内切酶和DNA结合蛋白的实例

[0064]

[0065]

[0066] 在一些实施方案中，非进行型内切核酸酶包含引起内切核酸酶结合但不切割甲基化核酸识别或或切割位点的一个或多个突变。在一些实施方案中，突变存在于内切核酸酶的阳离子结合基序中。在一些实施方案中，非进行型内切核酸酶是具有选自下表3的突变的限制性内切酶。

[0067] 表3

[0068]

[0069]

[0070]

[0071]

[0072]

[0073]

[0074]

[0075]

[0076]

[0077] 在一些实施方案中，非进行型内切核酸酶包含选自PD基序、D/EXK基序、H-N-H基序或GIY-YIG基序的基序。

[0078] 在一些实施方案中，非进行型内切核酸酶结合具有甲基化核酸的识别位点(例如，具有甲基化特异性)。在一些实施方案中，非进行型内切核酸酶不结合具有甲基化核酸的识别位点(例如，不具有甲基化特异性)。在一些实施方案中，非进行型内切核酸酶具有对于N4-甲基胞嘧啶或N6-甲基腺嘌呤的特异性。

[0079] 本发明还提供了利用具有甲基化特异性的表观遗传学-结合剂组合物、非进行型内切核酸酶或抗体以从混合样品分开和分离靶核酸群体的方法。在一个实施方案中，方法包括在足以与靶DNA形成复合物的条件下将表观遗传学结合剂用于混合样品。随后可基于多种赋予表观遗传学结合剂的标记或物理性质从所述混合样品分离复合物。这类方法包括磁珠，通过光学性质分选的珠粒，基于蛋白质的结合的核酸的差异分离(如在电泳凝胶中)。分离的更精细机制可包括质谱法、FACS、acoustophoresis。应理解，可使用许多标记将复杂混合物分离为多种生物DNA供给物中。

[0080] 在另一个实施方案中，提供了表观遗传学特异性降解法。方法包括将表观遗传学特异性降解因子在足以允许所述因子在无特定表观遗传学修饰的子序列上选择性切割核酸的条件下应用于样品，其中表观遗传学修饰存在于靶核酸中。在表观遗传学特异性切割后，非靶核酸被耗尽并且靶核酸被分析。在该实施方案中，来自潜在地任何界的含 有混合核酸样品的生物体可被靶向来耗尽非靶DNA(真核生物或不期望的细菌)和广泛地扩增选择的细菌基因组。在优选实施方案中，表观遗传学特异性降解因子是选择性切割非甲基化识别序列从而耗尽非靶DNA的限制性内切酶。

[0081] 该实施方案包括4个一般步骤。第一，利用存在于所有基因组中的RE切割混合样品中的所有DNA以产生适度数目的大片段。第二，将接头添加至包含通用引发位点的片段，将片段连接以形成环。第三，通过用属性限制性内切核酸酶(即，KpnBI或DpnII)切割和利用线性特异性DNA酶处理(导致非靶DNA的耗尽)来选择非靶DNA。因此仅具有接头的核酸将在该阶段具有环状分子。第四，利用全基因组扩增或接头通用引物扩增靶DNA。

[0082] 表4提供了可用于实践表观遗传学特异性降解法的示例性材料和另外的修饰的列表。应当理解，存在多种本文中未列出的用于在表观遗传学特异性降解非靶DNA后分开、分离和扩增靶DNA的替代方法。

[0083] 表4

[0084]

[0085]

[0086] 如表4中上述步骤1中提供的，可使用在未甲基化和甲基化的子序列上选择性切割的限制性内切酶组合，以选择性耗尽非靶DNA并且额外地，允许将接头选择性插入靶DNA。在一个实施方案中，该选 择性通过选择在嵌套于被靶特异性限制性内切酶识别的子序列中的子序列上切割的非靶特异性限制性内切酶来进行。待用于本发明的该方法的适当的限制性内切酶组合的实例提供于表5中。

[0087] 表5

[0088]

[0089] 如本文中所使用，与本发明相关的混合样品包含靶核酸和非靶核酸。在一些实施方案中，与本发明相关的混合样品包含至少一种靶核酸和至少一种非靶核酸。在一些实施方案中，靶核酸是原核生物核酸(例如，细菌)或真核生物核酸(例如，人)。在一些实施方案中，所述混合样品包含来自至少两种不同原核生物体的核酸。在一些实施方案中，所述混合样品包含来自人和细菌生物体的核酸。在一些实施方案中，所述混合样品包含来自原核和真核生物体的核酸。在一些实施方案中，所述混合样品包含来自至少两种不同的真核生物体的核酸。在一些实施方案中，所述混合样品包含来自未知生物体的核酸。

[0090] 在一些实施方案中，本发明的方法和组合物可额外地包含抑制剂。 在一些实施方案中，抑制剂可分离至第一级份或第二级份。如本文中所使用，“抑制剂”包括抑制来自混合样品的核酸扩增的任意化合物，包括环境或临床污染物、腐殖酸、柴油机烟尘或选自下列表6的抑制剂( P.等人(2004)Pre-PCR processing:Strategies to generate 
PCR-compatible Samples.Mol.Biotechnol.26,133–46)。

[0091] 表6

[0092]

[0093] 在一些实施方案中，本发明的非进行型内切核酸酶因方法或组合物的体外缓冲条件而结合靶核酸但不切割核酸。在一些实施方案中，缓冲液包含适合于非进行型内切核酸酶结合靶核酸但不切割靶核酸的Mg2+浓度。在一些实施方案中，Mg2+浓度是例如低于10mM、低于9mM、低于8mM、低于7mM、低于6mM、低于5mM、低于4mM、低于3mM、低于2mM、低于1mM或其值的任意范围。在一些实施方案中，Mg2+浓度是例如10mM至1mM、9mM至1mM、8mM 至1mM、7mM至1mM、6mM至1mM、5mM至1mM、4mM至1mM、3mM至1mM或2mM至1mM。在一些实施方案中，缓冲液不包含Mg2+。在一些实施方案中，缓冲液包含二价阳离子。在一些实施方案中，缓冲液包含Ca2+、Cd2+、Sr2+、Ba2+、Co2+或Mn2+。在一些实施方案中，Ca2+浓度是例如至少50mM、至少60mM、至少70mM、至少80mM、至少90mM、至少100mM或其值的任意范围。在一些实施方案中，Ca2+浓度是例如50mM至100mM、60mM至100mM、70mM至100mM、80mM至100mM或90mM至100mM。在一些实施方案中，缓冲液包含例如为缓冲液的Mg2+浓度的至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少
800倍、至少900倍、至少1,000倍或其值的任意范围的Ca2+浓度。在一些实施方案中，缓冲液包含为缓冲液的Mg2+浓度的500至1,000、600至1,000、700至1,000、800至1,000或900至1,
000倍的Ca2+浓度。在一些实施方案中，缓冲液包含抑制内切核酸酶活性的pH。已显示大于5的pH使对特异性DpnI序列的结合相对于非特异性序列最大化。类似的结果已被其它研究者观察到(Engler等人(1997).Specific binding by EcoRV endonuclease to its DNA recognition site GATATC.J Mol Biol.269(1):82-101.)。虽然DNA催化速率在低于pH7下迅速下降(Stanford等人(1999).DNA cleavage by the EcoRV restriction 
endonuclease:pH dependence and proton transfers in catalysis.J Mol Biol.288(1):105-16。因此5-7的pH值促进特异性结合同时减小催化活性。

[0094] 在一些实施方案中，本发明的非进行型内切核酸酶或抗体或其抗原结合片段包含可检测标记。可检测标记的实例包括例如生物素、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、多组氨酸(HIS)和地高辛。

[0095] 在一些实施方案中，本发明的方法、组合物或试剂盒包含结合至固体基质的非进行型内切核酸酶或抗体或其抗原结合片段。固体基质的实例包括例如磁珠、微量滴定板孔和柱表面。

[0096] 在一些实施方案中，本发明的方法、组合物或试剂盒产生等于例 如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%的靶基因组或其值的任意范围的分离的核酸。在一些实施方案中，本发明的方法、组合物或试剂盒产生等于例如50%至100%、60%至
100%、70%至100%、80%至100%、90%至100%或95%至100%的靶基因组的分离的核酸。

[0097] 在一些实施方案中，本发明的方法、组合物或试剂盒花费例如少于80分钟、少于70分钟、少于60分钟、少于50分钟、少于40分钟、少于30分钟、少于20分钟、少于10分钟或少于5分钟或其值的任意范围来完成。在一些实施方案中，本发明的方法、组合物或试剂盒花费例如80分钟至5分钟、70分钟至5分钟、60分钟至5分钟、50分钟至5分钟、40分钟至5分钟、30分钟至5分钟、20分钟至5分钟或10分钟至5分钟来完成。

[0098] 在一些实施方案中，本发明的方法、组合物或试剂盒导致所述混合样品中的例如少于10%、少于9%、少于8%、少于7%、少于6%、少于5%、少于4%、少于3%、少于2%或少于1%或其值的任意范围的非靶核酸被分离至第一级份中。在一些实施方案中，本发明的方法、组合物或试剂盒导致所述混合样品中的例如10%至1%、9%至1%、8%至1%、7%至1%、6%至1%、5%至1%、4%至1%、3%至1%或2%至1%的非靶核酸分离至第一级份中。

[0099] 在一些实施方案中，本发明的方法、组合物或试剂盒导致所述混合样品中的例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%或其值的任意范围的靶核酸分离至第一级份中。在一些实施方案中，本发明的方法、组合物或试剂盒导致所述混合样品中的例如50%至100%、60%至100%、70%至100%、80%至100%、90%至100%或95%至100%的靶核酸被分离至第一级份中。

[0100] 在一些实施方案中，所述混合样品包含例如5、6、7、8、9、10、20或更多log或其值的任何范围的非靶核酸。在一些实施方案中，所述混合样品包含例如5至20log、6至20log、7至20log、8至20log、9至20log或10至20log的非靶核酸。在其它实施方案中，所述混合 样品包含例如少于10pg、少于9pg、少于8pg、少于7pg、少于6pg、少于5pg、少于4pg、少于3pg、少于
2pg或少于1pg的靶核酸，或其值的任意范围。在一些实施方案中，所述混合样品包含例如
10pg至1pg、9pg至1pg、8pg至1pg、7pg至1pg、6pg至1pg、5pg至1pg、4pg至1pg、3pg至1pg或2pg至1pg的非靶核酸。

[0101] 在一些实施方案中，本发明涉及用于在包含来自靶生物体和非靶生物体的核酸的样品中分离和检测来自靶生物体的核酸的方法，其包括步骤：在足以允许表观遗传学结合剂结合存在于靶生物体的核酸中的表观遗传学修饰、从而形成表观遗传学结合剂-核酸复合物的条件下将表观遗传学结合剂应用于样品；从样品分离表观遗传学结合剂-核酸复合物；和纯化存在于分离的复合物中的核酸。在一些实施方案中，表观遗传学修饰是原核生物特异性表观遗传学修饰。在一些实施方案中，表观遗传学修饰选自N4-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤和硫修饰。在一些实施方案中，表观遗传学结合剂是具有对于具有N6-甲基腺嘌呤修饰的核酸的亲和力的单克隆抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，表观遗传学结合剂是具有对于具有N4-甲基胞嘧啶修饰的核酸的亲和力的单克隆抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，表观遗传学结合剂是生物素化限制性内切酶。在一些实施方案中，表观遗传学结合剂是具有对于具有磷代磷酸酯化修饰的核酸的亲和力的单克隆抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，表观遗传学结合剂是限制性内切酶。在一些实施方案中，足以允许表观遗传学结合剂-核酸复合物的形成的条件在反应缓冲液中不包含限制性内切酶辅因子。在一些实施方案中，表观遗传学结合剂是限制性内切酶的非切割突变体。在一些实施方案中，靶生物体是原核生物体。在一些实施方案中，靶生物体是细菌。在一些实施方案中，分离表观遗传学结合剂-核酸复合物的步骤包括使用免疫沉淀。在一些实施方案中，分离表观遗传学结合剂-核酸复合物的步骤包括使用凝胶阻滞法。

[0102] 在一些实施方案中，本发明涉及用于在包含来自靶生物体和非靶生物体的核酸的样品中分离和检测来自靶生物体的核酸的方法，其包 括步骤：在足以允许表观遗传学降解因子在不含特定表观遗传学修饰的子序列上选择性切割核酸的条件下将表观遗传学特异性降解因子应用于样品，其中靶生物体的核酸在子序列上包含特定的表观遗传学修饰并且非靶生物体的核酸在子序列上不含特定表观遗传学修饰；和分离靶生物体的未切割的核酸。在一些实施方案中，方法还包括在足以耗尽基本上全部非靶生物体的核酸的条件下将耗尽因子(depletion factor)应用于样品的步骤。在一些实施方案中，特定表观遗传学修饰选自N4-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤和硫代硫酸酯。在一些实施方案中，靶生物体是原核生物并且非靶生物体是真核生物。

[0103] 用于分离和检测包含原核和真核生物核酸的样品中的原核生物核酸的方法，其包括步骤：在足以允许表观遗传学特异性降解因子在不含特定表观遗传学修饰的第一子序列上选择性切割核酸的条件下将表观遗传学特异性降解因子应用于样品，其中原核生物核酸包括第一子序列上的表观遗传学修饰并且真核生物核酸不包括第一子序列上的特定表观遗传学修饰；将非-表观遗传学特异性降解因子应用于样品，其中所述非-表观遗传学特异性降解因子在第二子序列上切割，其中将第一子序列嵌套于第二子序列的切割位点内；将接头盒插入第二子序列的切割位点之间，以便仅未被表观遗传学特异性降解因子切割的核酸可接受接头，其中接头盒包含嵌入的聚合酶链式反应引物序列；将耗尽因子应用于样品以降解不具有插入的接头盒的核酸；和扩增包含接头盒的核酸。

[0104] 在一些实施方案中，本发明涉及用于结合原核生物核酸中的表观遗传学修饰的组合物，其包含：具有对于具有N6-甲基腺嘌呤修饰的核酸的亲和力的单克隆抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合片段被生物素化。

[0105] 在一些实施方案中，本发明涉及用于结合原核生物核酸中的表观遗传学修饰的组合物，其包含：选择性结合选自N4-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤和硫代磷酸酯的表观遗传学修饰的限制性内切酶，其中限制性内切酶的切割区域的氨基酸已被修饰来破坏切割能力。在一些实 施方案中，限制性内切酶被生物素化。
实施例

[0106] 实施例1

[0107] 本实施例提供了用于实践本发明的表观遗传学结合剂法的一般方案。

[0108] 材料

[0109] 待富集细菌基因组DNA的DNA混合物

[0110] 甲基结合剂

[0111] 生物素化DpnI结合剂

[0112] 生物素化αN6mA mAb

[0113] 重悬浮缓冲液(TE或去离子水)

[0114] mAb结合缓冲液(10mM NaK pH7,140mM NaCl,0.05%Triton X100)

[0115] 生物素化DpnI结合缓冲液(10mM TrisHCl ph7.5,100mM NaCl,0.1%Tween20)[0116] SA-Dyna磁珠(Dynal Inc)

[0117] QiaQuick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)

[0118] 方法

[0119] 如果想无序列依赖性地收集单链DNA，选择mAb。如果想利用双链DNA工作并且靶具有甲基化GATC位点，选择DpnI结合剂。

[0120] 其它试剂包括：αN4mA mAb，以及预期使用下列相同的基本方案的其它生物素化限制性内切酶。

[0121] 珠粒的制备

[0122] o将DpnI结合剂偶联至珠粒

[0123] o洗涤珠粒

[0124] DNA的制备

[0125] o将DNA重悬浮于TE缓冲液或水中

[0126] o将DNA在冰上分级分离(超声处理)至约5KB。其它方法包括酶促限制性消化等，并且取决于下游应用。对于免疫沉淀，更小的片段表现很好。重要的变量是每片段结合位点的数目。预期在6个甲基结合位点上发生结合饱和，这在约1.5kb中发生。更大的片段确保基因组的更大覆盖。

[0127] o将5ug分级分离的DNA稀释至TE或水中。DNA的量当然可变化。常见应用将使用0.5-10ug的DNA。

[0128] o mAb结合唯一步骤：通过在沸水浴中加热10分钟和在冰上淬灭5分钟来使DNA成为单链。

[0129] o将DNA溶液与0.11体积的10x结合缓冲液混合。

[0130] 靶DNA的结合和洗脱

[0131] o将5ug甲基-结合剂(3:1质量比是标准的)添加至DNA溶液，并且在室温下混合温育1小时。

[0132] o mAb结合通过更长的温育时间得以改善并且在4℃表现良好。

[0133] o利用结合缓冲液洗涤缀合有结合剂的珠粒2次。利用蛋白酶K在50℃处理3小时至过夜来释放DNA。还可通过pH或离子强度的改变来快速释放DpnI结合剂。

[0134] o使用QiaQuick PCR纯化试剂盒纯化结合的DNA，将其于TE缓冲液中进行洗脱。

[0135] o随需要分析洗脱的DNA。我们使用实时定量PCR。

[0136] 实施例2

[0137] 本实施例提供了用于实践本发明的方法的另一个一般方案。

[0138] 珠粒制备：首先，通过旋转或涡旋重悬浮磁珠来制备涂覆的磁珠。使用如下公式基于需要的样品数目计算所需的磁珠的量("工作体积")：(样品数目X20ul)+10ul=工作体积。每样品需要20ul的磁珠。对于多个样品，可大量制备珠粒，虽然当计算需要的珠粒工作体积时推荐考虑到因移液而造成的体积损失。

[0139] 随后，将一个工作体积的磁珠转移至新管，将其置于磁体上进行 1-2min。在将管置于磁体上的同时通过利用移液器抽吸移除所得的上清液。随后将管从磁体移开，将至少一个工作体积的洗涤缓冲液添加至管的内部，在管内收集珠粒，通过旋转或用移液器吸打轻轻地重悬浮混合物。重复这些磁化、抽吸、洗涤和重悬浮步骤2次，进行总共2次洗涤。在第二次洗涤后，将磁珠重悬浮于相同工作体积的洗涤缓冲液中。随后添加1/10的工作体积的生物素化蛋白质溶液，在New Brunswick TC-7上通过以例如16rpm轻轻地上下颠倒地旋转于室温(23-25℃)温育30分钟。随后将管置于磁体上进行2-3min，在将管被置于磁体上的同时通过用移液器抽吸弃去上清液。在上述磁化、抽吸、洗涤和重悬浮步骤后，用一个工作体积的洗涤缓冲液洗涤涂覆的珠粒2次。随后洗涤珠粒1次，将其重悬浮于一个工作体积的结合缓冲液中，并且等分至每反应管20ul。

[0140] DNA制备：将DNA悬浮于Tris EDTA(TE)、水或类似缓冲液中，并且将45ul的DNA溶液等分至5ul的结合缓冲液中。

[0141] DNA固定：将制备的珠粒的反应管置于磁体中进行2-3min，弃去上清液。随后将管在New Brunswick TC-7上通过以例如16rpm轻轻地上下颠倒地旋转于室温(23-25℃)温育30分钟。从旋转器取出管，将其置于磁体上进行至少2分钟。在将管置于磁体上的同时，利用移液器抽吸移除所得的上清液(即，非靶级份)。随后在上述磁化、抽吸、洗涤和重悬浮步骤后，用200ul的洗涤缓冲液洗涤珠粒2次。

[0142] 细菌DNA洗脱(可选步骤)：将样品管置于磁体上进行2-3min，在将管置于磁体上的同时，利用移液器抽吸弃去上清液。随后将20ul的洗脱缓冲液添加至每一个样品，在室温涡旋样品5分钟。随后，将样品置于磁体上进行2-3min，通过用移液器抽吸除去上清液。利用第二20ul洗脱缓冲液重复上述洗脱步骤，将其组合以形成靶级份。

[0143] 脱盐(可选步骤)：如果下游应用对变性高盐缓冲液敏感，则推荐按照制造商的方案使用脱盐旋转柱进行脱盐步骤。

[0144] 实施例3

[0145] 下列实施例提供数据：表观遗传学特异性降解法的一个实施方案 对于从混合样品分离细菌DNA是有效的。实施例3利用来自上述表4的步骤1和3。

[0146] 1.甲基化选择性降解

[0147] 制备来自真核生物体小麦(Triticum aestivum)的DNA和来自细菌(大肠杆菌)的DNA的混合物(表7)。将DpnII用于降解混合物中仅包含在腺嘌呤的N6位置上未被甲基化的GATC位点的DNA(小麦DNA被限制性降解，但大肠杆菌DNA未被限制性降解)(表7)。

[0148] 表7.

[0149]

[0150] 图2显示甲基化选择性降解使得能够分离原核与真核生物DNA。DpnI仅切割在GATC位点的腺嘌呤上甲基化的DNA。DpnII仅切割未被甲基化的GATC。细菌和真核生物DNA的混合物被差异地限制性降解，从而使得能够通过大小或限制性末端的相容性来进行分离。

[0151] 2.非靶DNA的耗尽

[0152] 将DpnII处理的混合物在1%琼脂糖TBE凝胶上于50V分离2小时。使用Qiagen试剂盒从琼脂糖切片分离和提取对应于输入DNA的条带。制备富集的和富集前的样品的等份，在Illumina GA-II上进行测序。

[0153] 数据分析

[0154] 从富集前样品获得6,322,925个可作图的序列读出。将MegaBlast(NCBI)用于将6,277,786个读出分配给小麦，将45,139个读出分配给大肠杆菌，或初始混合物中0.7%的大肠杆菌读出(图3)。在甲基化选 择降解和耗尽后，获得5,430,392个可作图的序列读出。令人惊讶地，1,250,777个读出来自大肠杆菌，占据整整23%，明显富集了32倍。

[0155] 为了特异性检查真核生物DNA的差异甲基化降解的效率，我们在纯化之前和纯化之后计数每一个生物体中包含GATC的序列读出。具有GATC的细菌读出的分数从10.2%跃升至75.6%。然而具有GATC的小麦读出的百分比从89.76降至24.4%。数据未指明为什么一些小麦序列仍未被切割。可能的解释是使用的酶的量不足以降解全部3ug的小麦，这表明富集可得到显著改善。

[0156] 我们观察到大肠杆菌的序列覆盖深度无明显偏倚地从0.24增加至6倍(图4A-D)。所得的覆盖超过99%(图4C)，从而允许清楚地鉴定痕量细菌。

[0157] 实施例4

[0158] 下列实施例提供了数据：表观遗传学特异性降解法的一个实施方案对于从混合样品分离细菌DNA是有效的。实施例4利用上述表4的步骤1至4。通过使用人和pUC19DNA的混合物实现靶DNA富集(图7)和使用人和大肠杆菌DNA的混合物实现靶DNA富集(图8)来单独地显示对细菌或人DNA进行的步骤(图5-6)。选择产生具有高效连接末端的靶DNA和具有无效平端或不相容末端的杂乱DNA的限制性内切酶组合。必要时，将非靶切割位点嵌入靶切割位点来破坏靶DNA切割位点(例如，将GATC嵌入GGATCC)。可能需要进行非靶分子的平端化(Klenow、T4聚合酶、绿豆核酸酶)。

[0159] 1.甲基化选择性降解

[0160] a)按照表8进行的非靶DNA的DpnII降解。

[0161] 表8.

[0162]试剂 浓度
DNA混合物 --
DpnII缓冲液NEB 1x
DpnII 1x

[0163] 在37℃温育1小时。在65℃加热灭活20分钟。(参见图2)。

[0164] b)按照表9产生平端DpnII悬突。

[0165] 表9.

[0166] 任选项1.T4DNA聚合酶        任选项2.绿豆核酸酶

[0167]

[0168] c)按照表10进行靶DNA的BamHI降解。

[0169] 表10.

[0170]试剂 浓度
DNA混合物 --
NEB缓冲液3 1x
牛血清白蛋白  
BamHI 1x

[0171] 在37℃温育1小时。清洁柱子以除去酶。

[0172] 2.接头连接/环化

[0173] 添加摩尔过量的接头分子以驱动接头的连接。驱动粘性末端靶分子以环化(图5,7)。

[0174] a)按照表11连接连接子。

[0175] 表11.

[0176]试剂 浓度
DNA混合物 1pmol/ul
退火的连接子 2-10pmol/ul
T4DNA连接酶缓冲液 1x
T4DNA连接酶 1x

[0177]  在22℃温育10分钟。

[0178] 在65℃加热灭活10分钟。

[0179] 图5显示连接至粘性BamHI末端的接头(SEQ ID NO:1)使分子环化并且保护它们免受降解，从而使得能够进行PCR扩增。

[0180] 3.非靶DNA的耗尽

[0181] 非靶DNA的DNA酶降解基于：线性相对于环状分子和/或接头保护(图6,7)。

[0182] a）降解非环状DNA，按照表12利用DpnII重新连接。

[0183] 表12.

[0184]试剂 浓度
DNA混合物 --
质粒安全缓冲液 1x
ATP  
质粒安全核酸酶 1x
DpnII 1x

[0185] 图6显示线性相对于环状DNA分子的选择性降解，所述降解使得能够选择性扩增靶分子。DpnII限制性人基因组DNA(gDNA)对质粒安全DNA酶敏感(比较泳道2和3)，而通过接头连接产生的环状分子(泳道5，pUC19对照)对质粒安全DNA酶不敏感。

[0186] 4.靶的扩增

[0187] 使用合成接头(图5泳道4)中的引物PCR扩增细菌DNA(图7泳道12，图8泳道6和7)。

[0188] a）按照表13和14PCR扩增靶DNA。

[0189] 表13.

[0190]试剂 浓度
DNA混合物 1ul
Taq PCR预混合物试剂盒(Qiagen) 1x
引物1(SEQ ID NO:8) 0.2uM
引物2(SEQ ID NO:9) 0.2uM

[0191]  表14.

[0192]

[0193] 图7显示利用接头连接的表观遗传学特异性降解法对于分离和扩增混合样品中的靶DNA以及降解非靶DNA是有效的。凝胶的泳道如下：泳道1–线性KB梯度；泳道2–人基因组DNA(hgDNA)；泳道3-1000:1的在1ug的人基因组DNA中包含1ng的pUC19DNA(dam甲基化细菌DNA的替代物)的混合物；泳道4–超螺旋pUC19。通过DpnII降解和末端的T4聚合酶平端化、随后进行BamHI降解、柱纯化和接头连接介导的环化来实现甲基选择。每一个这样处理的模板的样品示于泳道5-8中，显示了人DNA的弥散和细菌DNA的保存。人DNA的耗尽通过质粒安全DNA酶和DpnII降解来实现(泳道8-9)，这显示了人DNA的去除。利用接头特异性引物的扩增显示输入pUC19(泳道13)甚至从降解的混合物(泳道12)但不从仅人的DNA(泳道11)的扩增。未处理的hgDNA(泳道14)、未处理的pUC19(泳道15)或无模板的模板阴性对照不产生扩增的信号。

[0194] 图8显示利用接头连接的表观遗传学特异性降解法对于分离和扩增混合样品中的靶基因组以及降解非靶基因组是有效的。凝胶的泳道如下：泳道1–接头KB梯度；泳道2–人基因组DNA(hDNA)；泳道3-大肠杆菌基因组DNA(E.coli gDNA)；泳道4-pUC19；泳道5-表观遗传学特异性降解和扩增后的人基因组DNA(hDNA)；泳道6-表观遗传学特异性降解和扩增后的混合的人基因组DNA与10ng大肠杆菌DNA(hDNA+10ng Ec)；泳道7–表观遗传学特异性降解和扩增后的10ng大肠杆菌基因组DNA(10ng Ec gDNA)；泳道8-表观遗传学 特异性降解和扩增后的pUC19。

[0195] 图9定量来自复杂混合物的富集的水平。初始混合物包括约100pg的大肠杆菌DNA和1ug的人DNA或1:10,000的比率。使用存在于男性DNA中的DYZ基因座(具有垂直条纹的条柱)和存在于大肠杆菌中的16S基因座(具有水平条纹的条柱)对DNA进行qPCR测量。在表观遗传学特异性降解和扩增后，qPCR测量出比率为1:0.3的细菌DNA:人，33,000X倍的富集。

[0196] 实施例5

[0197] 下列实施方案提供了数据：表观遗传学特异性降解法的一个实施方案对于从混合样品分离细菌基因组DNA是有效的。实施例5利用来自上述表4的步骤1至4。选择产生具有高效连接末端的靶DNA和具有不相容末端的杂乱DNA的限制性内切酶组合。用BstKI(不切割在腺嘌呤上甲基化的细菌GATC位点)切割第一非靶基因组。随后用Sau3AI切割细菌DNA，从而在细菌的GATC位点产生粘性末端。添加的连接子仅特异于细菌Sau3AI末端，从而保护细菌片段免受随后添加的外切核酸酶降解。扩增从嵌入连接子的位点发生。

[0198] 1.退火连接子：GATC-4nt有义和反义

[0199] a.将5ul的每一种S和A添加至90ul

[0200] b.在95℃加热5min

[0201] c.在加热块中缓慢冷却至室温。

[0202] 2.BstKTI降解(被Dam甲基化阻断的–将不切割大肠杆菌)

[0203] a.按照表15制备DNA样品–仅人(1)、人+大肠杆菌(2)和仅大肠杆菌(3)。

[0204] 表15.

[0205]

[0206]

[0207] b.在37℃降解60min。

[0208] c.在65℃加热灭活20min。

[0209] 3.Sau3AI降解(产生GATC5’悬突)

[0210] a.按照表16制备反应物。

[0211] 表16.

[0212]

[0213] b.每反应添加5ul。

[0214] c.在37℃温育60分钟。

[0215] d.在65℃加热灭活20min。

[0216] 4.连接连接子

[0217] a.用BstY1切割1ng MG1655DNA产生1.04E-03pmol的分子或1.04fmol的DNA。

[0218] b.对于50:1，需要52fmol连接子

[0219] c.按照表17将连接子从5pmol/ul稀释至10fmol/ul(1:50于tris或DI中)。

[0220] 表17.

[0221]

[0222] d.在室温温育5min。

[0223] e.在65℃加热灭活10分钟。

[0224] 5.ExoIII降解

[0225] a.组合表18的下更组分，将其添加至DNA-10ul/管

[0226] 表18.

[0227]

[0228] b.在37℃温育30min。

[0229] c.在65℃加执灭活15分钟。

[0230] 6.按照表19通过PCR进行样品的扩增。

[0231] a.对照)

[0232] b.仅需要MeR(反向)引物

[0233] c.样品:

[0234] 1.处理的hDNA

[0235] 2.hDNA+处理的大肠杆菌

[0236] 3.处理的大肠杆菌

[0237] 表19.

[0238]

[0239] PCR反应:

[0240]

[0241] 结果.

[0242] 图9中的结果显示初始样品混合物具有约1ug的测量水平的人DNA和正好高于100pg的测量水平的大肠杆菌DNA(当利用qPCR测试时)。在表观遗传学选择性修饰后，存在人DNA的水平(低于10pg)显著降低和细菌DNA的扩增(超过1ng)。在本实施例中，将扩增保持至25个循环，但应理解，更高水平的扩增是可能的。1:10,000的大肠杆菌对人DNA的比率的变化改变约33,000倍至1:0.3。这显示了高水平的富集，这在人DNA的高本底的选择性降解中是尤其独特的。

[0243] 实施例6

[0244] 下列实施例提供了显示表观遗传学结合剂从混合样品分离细菌DNA的可操作性的数据。具体地，将凝胶阻滞用于确定表观遗传学结合剂限制性内切酶DpnI是否以甲基特异性方式结合和用于确保结合 条件不能使DNA限制性降解。本文中提供的结果描述了DpnI的无DNA切割的甲基化特异性结合。

[0245] 材料

[0246] 699ng/ul生物素化FLIR DpnI

[0247] 10个单位/ul DpnI(NEB)

[0248] 1KB梯度(Bioline)

[0249] TBE中3%的琼脂糖凝胶

[0250] 结合缓冲液

[0251] 限制性缓冲液

[0252] NEB缓冲液4

[0253] 阳离子:10mM Mg++或10mM Ca++

[0254] 150ng DpnI或20个单位的NEB DpnI

[0255] 10X结合缓冲液

[0256] mM阳离子(在列出的情况下)

[0257] 去离子水至终体积

[0258] 100ng pUC19DNA

[0259] 方法

[0260] 将DpnI添加至20ul含有结合缓冲液的变种和DNA模板pUC19的溶液。结合缓冲液包含所列终浓度的Mg++或Ca++。通过在dam+株MG1655中传代来在GATC位点甲基化N6mA pUC19，在dam-株BL21中对未甲基化的pUC19进行传代。将DpnI与pUC19一起在室温(对于结合)或37℃(对于降解)温育2小时。小心地将反应物加载至琼脂糖凝胶上。通过标准琼脂糖凝胶电泳将蛋白质-DNA复合物与未结合的DNA分离。在实验结束时，使用来自Cell Biosciences的Alpha Imager HP对凝胶进行成像。

[0261] 结果

[0262] 图10中的结果显示：在修饰条件下，限制性内切酶能选择性结合 N6mA而不切割。第一，用Ca++替代Mg++导致N6mA pUC19以剂量依赖性的方式的结合，如通过凝胶阻滞显示的。例如，在400ng DpnI时，所有DNA与DpnI复合，如通过孔中的保留证明的。然而，在DpnI不存在的情况下，不存在凝胶阻滞并且DNA相应地迁移。相反地，当将Mg++替代至反应中时，DpnI在N6mA pUC19上切割，如通过多个条带证明的。如在图10的右图框中显示的，DpnI的结合作用对于N6mA是特异性的，因为对于未甲基化的DNA(pUC19)未显示凝胶阻滞。综上所述，这些结果证明在适当的条件下，限制性内切酶可用于特异性结合表观遗传学修饰而不切割。这提供了限制性内切酶可用作表观遗传学结合剂来从混合样品分开和分离原核生物DNA的证据。此外，可对限制性内切酶进行修饰以帮助分离限制性内切酶-DNA复合物，例如生物素化或其它缀合。

[0263] DpnI的生物素化

[0264] 将纯化的DpnI生物素化(bDpnI)，因为商业可得的制剂通常仅是部分纯化的并且包含大量的添加的牛血清白蛋白(BSA)。HABA测定导致每DpnI分子掺入2.8个生物素。将引物组用于产生在长度上为477bp和651bp的两个DNA片段，所述片段覆盖来自pUC19的相同6个GATC位点。片段在PCR扩增后未被甲基化，如通过甲基敏感性MboI限制性降解验证的。将Dam甲基转移酶(DMT)用于甲基化477bp片段(M477)，从而将其转变成DpnI的底物。

[0265] 将DpnI(bDpnI)的生物素化形式与未甲基化的651bp和M477片段的混合物一起用于结合反应。bDpnI选择性减少M477片段的凝胶迁移，表明甲基特异性DNA结合(图11)。

[0266] 对于抗生物素蛋白涂覆的珠粒上的生物素化DpnI的活性

[0267] 随后，评估bDpnI在溶液相中进行结合的性能。用200ng的M477bp和未甲基化的651bp片段(unM651)的每一种温育400ng的bDpnI，进行1小时。随后添加抗生物素蛋白涂覆的珠粒，进行另外1小时的温育。通过磁力收集珠粒，保存上清液，洗涤珠粒。随后将级份在
3%琼脂糖凝胶上进行电泳(图12)。上清液仅包含unM651bp片段，然而 结合的级份包含两种DNA产物。该更低的特异性可能可通过改变结合条件来解决。

[0268] 相反地，当将bDpnI预结合至珠粒时，特异性是优异的。将递增量的bDpnI-珠粒添加至混合的unM651和m477bp片段。在30分钟的温育后，将来自非靶或靶级份的样品加载至凝胶上以进行分析。非靶级份随着bDpnI珠粒的水平升高特异性地丧失m477bp片段。靶级份仅包含m477片段(图13)。

[0269] 从基因组混合物分离细菌DNA的特异性

[0270] 为了测定细菌DNA特异性的极限，在1ug人DNA的本底中从10ng向下至1pg滴定大肠杆菌基因组DNA以产生一系列基因组混合物，随后将所述基因组混合物与bDpnI珠粒一起温育。在该方案中，洗涤珠粒1次，收集靶和非靶级份，随后测试每一个级份中的人和大肠杆菌DNA的水平。利用qPCR评估对细菌16S和人DYZ的回收，将每一种针对它们各自的标记物频率进行标准化。在靶级份中恒定地回收了约10%的人DNA。在pg水平上回收了不少于30%的大肠杆菌DNA，然而对于10ng的输入，回收超过80%的大肠杆菌。

[0271] 为了测定bDpnI-珠粒和DNA温育的最短时间，在5至60分钟的温育时间上测试1ug的人和500pg的大肠杆菌DNA的混合物。在该方案中，使用bDpnI-珠粒DNA复合物的3次洗涤，随后用qPCR测试级份的DYZ和细菌16S rDNA。回收在整个测量的温育时间上是恒定的(图14和15)。此外，非靶人DNA的结合降至1%(图14和15)。在其它实验中，观察到人DNA结合随延长的温育时间而增加。

[0272] 基因组回收的覆盖

[0273] 为了评估全局性基因回收效率，制备细菌的混合物，在DpnI珠粒富集之前和之后对进行测序。样品包含萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌和两种病毒：苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNVP)和λ噬菌体。对于DpnI富集的评估，混合物被认为是相关的，因为其包括基于Dam(GmATC)DNA基序的存在预期其无富集(芽孢杆菌属)、部分富集(假单胞菌属) 和完全富集(大肠杆菌)的生物体。

[0274] 随后将细胞/病毒混合物用于DpnI富集，随后制备DNA以用于使用HiSeq的下一代测序。这些数据的概述示于图16中。观察到大肠杆菌的14倍富集，并且具有优良的覆盖(图17)，基因组覆盖的至关重要的物理特征也得到维持。这样的特征包括复制起始点(OriC)与末端之间的覆盖比率。等于1的比率表示处于静止生长期的生物体，而高比率(4、8、16和32)代表不断增加的快速生长。这样的信息在评估威胁生物体的来源和生长方法中是非常重要的。在富集过程程中低覆盖偏向性和物理覆盖特性的维持是高度期望的。应当指出覆盖峰(coverage spike)是假象，并且高覆盖发生，因为噬菌体(DLP、Rec和Qin)存在于来自该混合物的其它细菌中，从而导致假的夸大。

[0275] 实施例6

[0276] 下列实施例显示了在一组集中于生物威胁物的细菌和代表性真核生物上进行的针对N6-甲基腺苷(N6mA)产生的初始多克隆血清的表征。腺嘌呤甲基化是细菌DNA与常见真核生物基因组的鉴别器，但一些病原体不提供可检测的腺嘌呤甲基化。本实施例显示进行免疫沉淀以及产生一组单克隆抗体的潜在可能。这些方法也可用于鉴定生物体的腺嘌呤甲基化状态和用于细菌基因组的一般富集。

[0277] 材料和方法

[0278] 免疫原、缀合物和DNA样品。N6-甲基腺苷5′-单磷酸钠盐、N6-甲基-2-脱氧腺苷和2-脱氧腺苷5-单磷酸盐、牛血清白蛋白(BSA)和钥孔血蓝蛋(KLH)购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。如先前所述进行KLH至N6-甲基腺苷5′-单磷酸钠盐的缀合(N6mA-KLH)(作为免疫原)和BSA至N6-甲基腺苷5′-单磷酸钠盐(N6mA-BSA)的缀合(以进行计数筛选)。
Erlanger,B.F.and S.M.Beiser,Antibodies Specific for Ribonucleosides and Ribonucleotides and Their Reaction with DNA.Proc Natl Acad Sci U S A,1964.52:
p.68-74。购买人男性的基因组DNA(Zyagen,San Diego,CA)，使用标准DNA提取方案(Qiagen,Germantown,MD)从大肠杆菌MG1655(ATCC)分离基因组DNA。

[0279] 抗体产生和筛选。将N6-甲基腺苷5′-单磷酸钠盐缀合至KLH并且用作抗原。Erlanger,B.F.and S.M.Beiser,Antibodies Specific for Ribonucleosides and Ribonucleotides and Their Reaction with DNA.Proc Natl Acad Sci U S A,1964.52:
p.68-74。如先前所述免疫9只Balb/c小鼠。Reynaud,C.,等人,Monitoring of urinary excretion of modified nucleosides in cancer patients using a set of six monoclonal antibodies.Cancer Lett,1992.61(3):p.255-62。在每一次免疫后收集免疫前取血和测试取血以通过间接ELISA和使用N6-甲基-2-脱氧腺苷和2-脱氧腺苷5-单磷酸盐的竞争性ELISA进行监控。将已经建立的程序用于产生与SP2/0细胞的杂交瘤，如上所述再筛选所得的融合物。Shulman,M.,C.D.Wilde和G.Kohler,A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies.Nature,1978.276(5685):p.269-70。

[0280] 进行直接核苷酸ELISA以滴定抗体，用100ul的1ug/ml的pH7.4的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的N6-甲基腺苷5’-单磷酸钠盐-BSA缀合物涂覆孔。利用缀合有HRP的山羊抗-小鼠IgG(Jackson Labs Technologies,Inc.,Los Gatos,CA)进行检测。根据最高稀释(其中样品的OD为空白的2.1倍)鉴定滴度。

[0281] 如先前所述进行竞争性ELISA。Itoh,K.,M.Mizugaki和N.Ishida,Preparation of a monoclonal antibody specific for1-Methyladenosine and its application for the detection of elevated levels of1-Methyladenosine in urines from cancer patients.Jpn J Cancer Res,1988.79(10):p.1130-8。用N6mA-BSA缀合物涂覆孔，从而确保结合活性不针对免疫原的KLH组分。通过用N6-甲基-2-脱氧腺苷(期望的活性的特异性抑制剂)或2-脱氧腺苷5-单磷酸盐温育抗血清、将其添加至涂覆的孔中来测定特异性。当抗血清结合至涂覆的孔时，不存在竞争。

[0282] 使用两个具有下列序列：GCAGGATCAACAGTCACACT的寡核苷酸(TriLink Biotechnologies,Inc.,San Diego,CA)进行寡核苷酸 ELISA，其中加下划线的腺嘌呤在一个组中未被甲基化或在另一个组中被N6-甲基化。将每一个寡核苷酸与等体积的Reacti-Bind DNA涂覆溶液(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)于玻璃管中以8μg寡核苷酸/ml的终DNA浓度混合。将100ul的该涂覆混合物转移至96孔圆底EIA板的孔中，在轨道混合器上于室温温育2小时。温育，然后用洗涤缓冲液(TBS和0.05%Tween-20)洗涤3次，随后每孔用
200μl封闭溶液(TBS,0.05%Tween-20,和1%BSA)在室温封闭1小时。在除去封闭溶液后，将孔与100μl含抗甲基腺嘌呤小鼠多克隆抗血清(以1:10,000稀释)的封闭溶液温育孔1小时，用洗涤缓冲液洗涤3次，随后用封闭溶液中的缀合有HRP的山羊抗-小鼠IgG(Jackson Labs)温育30分钟。通过利用洗涤缓冲液洗涤3次除去未结合的抗体，随后每孔用100μl 1-Step Ultra TMB-ELISAs溶液(Thermo Scientific)对ELISA进行显色。15分钟后，利用100μl2M硫酸终止酶促反应，以450nm吸光度测量形成的颜色。为了进行基因组DNA ELISA，以每一个实验中列出的浓度用DNA替代寡核苷酸。

[0283] 结果

[0284] 在所有测试的小鼠中免疫反应都强，需要100,000倍的稀释。通过比较对腺嘌呤和N6-甲基-腺嘌呤的反应性来测定所有血清的特异性(图19)。我们观察到仅100ng的N6mA导致血清对N6mA涂覆的ELISA板的结合的50%的抑制。相比较之下，10ug的腺嘌令(试剂的100倍增加)导致约30%的抑制。选择来自1、4、8和9的终取血来产生融合物。

[0285] 筛选约500个融合物，在亚克隆后，在初始直接核苷酸ELISA中利用对N6mA的特异性鉴定了16个杂交瘤(其中的2个在ATCC保藏号PTA-13262和PTA-13263下进行保藏)。随后使用oligo ELISA测试终取血和这16个杂交瘤(图19)。所有测试的多克隆血清具有超过10倍的对N6mA的偏爱性，一个杂交瘤显示接近40倍的对于N6mA的甄别性(相对于未甲基化的寡核苷酸)。

[0286] 进一步评估多克隆血清以将它们对从大肠提取的DNA的反应性与对人DNA的反应性相比较(图20)。使用基因组ELISA，并且滴定用于这些测试的涂覆孔的基因组DNA的量。对于高于6ng的基因组DNA观察到对细菌的差异性敏感性。

[0287] 实施例7

[0288] 下列实施例提供了数据：使用非进行型内切核酸酶进行DNA分离的本发明的实施方案将细菌基因组与PCR抑制剂分离。收集环境样品，包括腐殖土和海洋以及在圣地亚哥暴风雨过程中城市径流位置的污染的水样品、赭石包被的砂粒、含石膏的火山泥和来自犹他州的高矿物质含量地区的河床淤泥。评价从不同且通常难操作的样品类型(已知PCR的抑制剂含量较高)富集细菌DNA的能力。

[0289] 使用MoBio试剂盒处理样品以分离总DNA，随后利用DpnI-珠粒来产生γ-变形杆菌基因组的富集的靶级份和使用实施例2中的方案产生其它基因组的非靶级份。使用通用16S引物评价原始样品和所有随后级份的多样性。工作流程概述于图21中。样品类型和16S扩增的结果的概述列于表20中。

[0290] 表20.使用DpnI分离测试样品类型的PCR抑制减轻

[0291]

[0292] 大多数水样品和空气样品产生指征细菌存在的16S扩增子。城市咸水河样品扩增差，并且从腐殖土样品、砂、泥或淤泥的任一种未看到16S扩增。在每一种其中MoBio分离的DNA不产生16S特征谱的情况下，未结合的级份也不产生16S特征谱。然而，结合的靶级份不含抑制并且显示来自微环境的细菌存在，所述微环境通常无可见的植物、动物或细菌生长。

[0293] 图22显示来自两种腐殖土样品的非靶DNA级份未扩增。当掺入土壤样品的大肠杆菌DNA相较于单独的大肠杆菌DNA未扩增时，表明PCR抑制剂存在。然而，靶级份未显示抑制，从而事实上显示了16S条带的高度多样性。土壤样品的初始多样性不能被评价，非靶级份的多样性也不能被评价。这样，从样品类型获得了先前不可获得的有用的信息。

[0294] 图23显示直接用MoBio试剂盒分离的DNA不能用16S引物从土壤样品(淤泥、砂和火山泥)扩增。已知这些样品分别地在盐、赭石和石膏中含量较高。在DpnI分离后，所有样品可扩增。

[0295] 实施例8

[0296] 下列实施例提供了数据：使用非进行型内切核酸酶进行DNA分离的本发明的实施方案将细菌基因组与特定PCR抑制剂分离。表21提供了常见干扰物的列表，测定了它们在DpnI分离中所处的水平，利用和不利用DpnI分离所得的检测。

[0297] 表21.测试的常见PCR干扰物

[0298]

[0299] 图24显示当将150pg大肠杆菌DNA置于16S大肠杆菌特异性qPCR测定时，其被100%检测到。当黑麦花粉的水平升高至约10,000ug/ml时，检测降至0%。随后在10,000ug/ml或100,000ug/ml黑麦花粉存在的情况下测试150ng大肠杆菌DNA的提取物。在两种情况下，PCR抑制得以减轻，恢复了一定水平的大肠杆菌检测。

[0300] 可理解，通过本领域技术人员改变实施例2的方案，包括缓冲液洗涤的次数或类型，添加剂(EDTA、抑制剂的灭活剂)的添加或升高DpnI的水平(以减轻竞争性抑制)可导致对此处提供的方法的改善。

[0301] 应当理解，本文中描述的实施例和解释仅用于举例说明本发明的实施方案并且无意限定本文中描述的方法或组合物。可将本文中描述的所有不同方面、实施方案和选项组合在任何和所有变化中。本说明书中提及的所有公开案、专利和专利申请通过引用并入本文中，其引用程度就如同将每一个别公开案、专利或专利申请特定且个别地以引用的方式并入。

[0302] 如本文中所使用，术语"包含"、"包括"、"具有"或其任何其它变型意指非排他性的或开放式的。同样地，本发明的元素或组分之前的不定冠词“一个/一种”对于实例(即，元素或组分的存在)的数目意欲是非限定性的。因此，“一个/一种”应当理解包括一个/种或至少一个/种，并且除非数目明确地意指为单数，否则元素或组分的单数形式还包括复数形式。