一种利用牛蒡叶制备霉菌抑制剂的方法

摘要

一种利用牛蒡叶制备霉菌抑制剂的方法，其特征步骤为：将干牛蒡叶充分粉碎。加入水，进行复合酶酶解，得到牛蒡叶水提液，浓缩得到浓缩物a。然后向酶解过的牛蒡叶渣中，加入乙醇溶液，超声微波协同萃取，过滤，浓缩得提取物b。将浓缩物a和b合并，分散在水中，上大孔树脂柱层析，溶剂洗脱，所得乙醇洗脱物即为霉菌天然抑制剂。本发明利用超声微波协同萃取技术与生物酶技术进行提取，大大缩短了提取时间，提高了提取率，再采用柱层析技术进行纯化，得到了活性较强的霉菌天然抑制剂。

权利要求

1.一种利用牛蒡叶制备霉菌抑制剂的方法，其特征步骤为：

取干牛蒡叶5g，将干牛蒡叶粉碎至100目以下，然后将牛蒡叶粉末与水混合，牛蒡叶粉末与水的质量比为1∶10；加入由纤维素酶和蛋白酶组成的复合酶进行酶解，纤维素酶与蛋白酶的质量比为1∶1，复合酶与牛蒡叶粉末的质量比为1∶1000，酶解完成后过滤，得到牛蒡叶水提液，50℃减压浓缩至无溶剂，得到浓缩物a；所得牛蒡叶残渣待用；

在牛蒡叶残渣中加入10％的乙醇溶液作为溶剂，乙醇溶液与实验开始时所用的牛蒡叶粉末的质量比为2∶1，进行超声微波协同萃取，超声波功率为500w，微波功率为200w，提取时间为1min，过滤；将上清液50℃减压浓缩至无溶剂，得到浓缩物b；将浓缩物a和b合并，分散于水中，合并后的浓缩物与水的质量比为1∶6，得到悬液，上大孔树脂柱进行层析，悬液与大孔树脂的质量比为1∶5，依次分别采用水和20％乙醇溶液进行洗脱，水洗脱的体积为2个柱体积(BV)，乙醇溶液的洗脱体积为3BV，分别收集洗脱液；将乙醇溶液洗脱溶液50℃减压浓缩，60℃真空干燥，得到乙醇溶液洗脱组分，即为天然霉菌抑制剂。

说明书

一种利用牛蒡叶制备霉菌抑制剂的方法

技术领域

[0001] 本发明属于天然产物领域，本发明涉及以牛蒡叶为原料制备霉菌天然抑制剂的方法，特别是利用超声微波协同萃取技术、酶技术与柱层析技术制备霉菌天然抑制剂的方法。

背景技术

[0002] 据统计，我国牛蒡产量大，如牛蒡根在徐州地区的亩产达1500Kg，叶子约为每亩1000Kg。牛蒡叶基本全部废弃，造成了严重的资源浪费，而且容易污染环境。而牛蒡叶中含有的有效成分具有抗菌能力。因此对牛蒡叶中的多酚成分进行开发利用，既可以综合利用废弃资源，又可以制备大量的霉菌抑制活性成分，具有重要的经济、社会意义。

[0003] 目前，食品加工、储藏等领域所用的霉菌抑制剂，绝大部分都是人工合成的，食用过多时会引起许多危害人体健康的问题。随着人们生活水平的快速提高，人们对于合成的添加剂越来越不信任，而对于绿色、天然的添加剂表现出越来越多的兴趣，人们对于霉菌天然抑制剂的需求日益增长。与此同时，愈来愈多的学者开始关注并研究天然成分，包括各种天然成分的制备及抗霉菌活性的评价。众多研究表明，许多多酚成分具有较强的霉菌抑制活性，牛蒡叶富含多酚成分，是一种能够抑制霉菌的良好资源。然而关于牛蒡叶中霉菌抑制剂的研究较少，采用超声微波辅助提取及柱层析技术从牛蒡叶中分离制备霉菌抑制剂的研究未见报道。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种利用牛蒡叶制备霉菌抑制剂的方法，以牛蒡加工的副产物牛蒡叶为原料，分离制备霉菌天然抑制剂。这种方法能够充分利用牛蒡叶资源，并且能够提供高效的霉菌天然抑制剂，为牛蒡的综合利用与深加工提供了新的方法。

[0005] 本发明的技术方案：提供一种利用牛蒡叶制备霉菌抑制剂的方法，包括如下步骤：

[0006] (1)将干牛蒡叶粉碎，过筛，干牛蒡叶粉碎至50-200目以下，将牛蒡叶粉末与溶剂混合，以水为溶剂，牛蒡叶粉末与溶剂的质量比为1∶5-1∶100。加入复合酶进行酶解，复合酶由纤维素酶和蛋白酶组成，纤维素酶与蛋白酶的质量比为1∶0.5-1∶5，复合酶的添加量为0.1-100mg/g(牛蒡叶)，酶解完成后过滤，得到牛蒡叶水提液，30-90℃减压浓缩至无溶剂，得到浓缩物a。所得牛蒡叶残渣待用。

[0007] (2)在牛蒡叶残渣中加入5％-90％的乙醇溶液作为溶剂，乙醇溶液与实验开始时所用的牛蒡叶粉末的质量比为1∶1-100∶1，进行超声微波协同萃取，超声波功率为0.05-100Kw，微波功率为0.1-2500Kw，提取时间为0.2-1500min，过滤。将上清液30-90℃减压浓缩至无溶剂，得到浓缩物b。

[0008] (3)将浓缩物a和b合并，分散于水中，合并后的浓缩物与水的质量比为1∶1-1∶50，得到悬液，上大孔树脂柱进行层析，悬液与大孔树脂的质量比为1∶2-1∶100，依次分别采用水和乙醇溶液进行洗脱，水洗脱的体积为1-10个柱体积(BV)，乙醇溶液的洗脱体积为1-10BV，乙醇溶液中乙醇的质量浓度为5％-60％。分别收集洗脱液，得到水洗脱溶液和乙醇溶液洗脱溶液。

[0009] (4)将乙醇溶液洗脱溶液30-90℃减压浓缩，20-100℃真空干燥或80-130℃喷雾干燥或0.5-200Kw微波辅助干燥。得到乙醇溶液洗脱组分，即为天然霉菌抑制剂。

[0010] 本发明的有益效果是：本发明利用超声微波协同萃取技术与生物酶技术进行提取，大大缩短了提取时间，提高了提取率，再采用柱层析技术进行纯化，得到了活性较强的霉菌天然抑制剂。对水果青霉病菌等霉菌的抑制能力较强，测得所制备的霉菌抑制剂抑制青霉病菌的MIC为0.5-1mg/ml。

具体实施方式

[0011] 以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但本发明不局限于这些实例。

[0012] 实施例1

[0013] 取干牛蒡叶5g，将干牛蒡叶粉碎至100目以下，然后将牛蒡叶粉末与水混合，牛蒡叶粉末与水的质量比为1∶10。加入复合酶进行酶解，纤维素酶与蛋白酶的质量比为1∶1，复合酶的添加量为1mg/g(牛蒡叶)，酶解完成后过滤，得到牛蒡叶水提液，50℃减压浓缩至无溶剂，得到浓缩物a。所得牛蒡叶残渣待用。

[0014] 在牛蒡叶残渣中加入10％的乙醇溶液作为溶剂，乙醇溶液与实验开始时所用的牛蒡叶粉末的质量比为2∶1，进行超声微波协同萃取，超声波功率为500w，微波功率为200w，提取时间为1min，过滤。将上清液50℃减压浓缩至无溶剂，得到浓缩物b。将浓缩物a和b合并，分散于水中，合并后的浓缩物与水的比例为1∶6，得到悬液，上大孔树脂柱进行层析，悬液与大孔树脂的质量比为1∶5，依次分别采用水和20％乙醇溶液进行洗脱，水洗脱的体积为2BV，乙醇溶液的洗脱体积为3BV，分别收集洗脱液。将乙醇溶液洗脱溶液50℃减压浓缩，60℃真空干燥，得到乙醇溶液洗脱组分，即为天然霉菌抑制剂。

[0015] 实施例2

[0016] 将干牛蒡叶粉碎至50目以下，将100g牛蒡叶粉末与水混合，牛蒡叶粉末与水的质量比为1∶5。加入复合酶进行酶解，纤维素酶与蛋白酶的质量比为1∶2，复合酶的添加量为0.5mg/g(牛蒡叶)，酶解完成后过滤，得到牛蒡叶水提液，60℃减压浓缩至无溶剂，得到浓缩物a。在牛蒡叶残渣中加入20％的乙醇溶液作为溶剂，乙醇溶液与实验开始时所用的牛蒡叶粉末的质量比为10∶1，进行超声微波协同萃取，超声波功率为1Kw，微波功率为1Kw，提取时间为8min，过滤。将上清液55℃减压浓缩至无溶剂，得到浓缩物b。将浓缩物a和b合并，分散于水中，合并后的浓缩物与水的比例为1∶5，得到悬液，上大孔树脂柱进行层析，悬液与大孔树脂的质量比为1∶3，依次分别采用水和30％乙醇溶液进行洗脱，水洗脱的体积为4BV，乙醇溶液的洗脱体积为5BV，分别收集洗脱液，得到水洗脱溶液和乙醇溶液洗脱溶液。将乙醇溶液洗脱溶液65℃减压浓缩，95℃喷雾干燥，得到乙醇溶液洗脱组分，即为天然霉菌抑制剂。

[0017] 实施例3

[0018] 取牛蒡叶1000g，粉碎至200目以下，将牛蒡叶粉末与40升水混合，加入20g复合酶进行酶解，纤维素酶与蛋白酶的质量比为2∶1，酶解完成后过滤，得到牛蒡叶水提液，65℃减压浓缩至无溶剂，得到浓缩物a。在牛蒡叶残渣中加入4000ml35％的乙醇溶液作为溶剂，进行超声微波协同萃取，超声波功率为1Kw，微波功率为2Kw，提取时间为20min，过滤。将上清液60℃减压浓缩至无溶剂，得到浓缩物b。将浓缩物a和b合并，分散于水中，合并后的浓缩物与水的比例为1∶9，得到悬液，上大孔树脂柱进行层析，悬液与大孔树脂的质量比为1∶10，依次分别采用水和30％乙醇溶液进行洗脱，水洗脱的体积为3BV，乙醇溶液的洗脱体积5BV。分别收集洗脱液。将乙醇溶液洗脱溶液65℃减压浓缩，70℃真空干燥，得到乙醇溶液洗脱组分，即为天然霉菌抑制剂。