一株连香树红球菌及其筛选方法和应用

摘要

本发明公开了一株连香树红球菌及其筛选方法和应用。本发明的技术方案要点为：一株连香树红球菌Rhodococcus cercidiphylli，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.9067。本发明还公开了该连香树红球菌的筛选方法及其在降解亚硝胺类物质中的应用。本发明中连香树红球菌菌株的筛选方法操作简单、快速，可用于被亚硝胺类物质污染的饮用水中，降解去除亚硝胺类物质，对亚硝胺类物质污染的饮用水进行生物处理，降低其健康安全风险水平。

权利要求

1.一株连香树红球菌Rhodococcus cercidiphylli，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No. 9067。

2.权利要求1所述的连香树红球菌在降解亚硝胺类物质中的应用，其中亚硝胺类物质为亚硝基二甲胺、亚硝基二乙胺、亚硝基二丙胺、亚硝基吡咯烷和亚硝基二丁胺中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的连香树红球菌在降解亚硝胺类物质中的应用，其特征在于主要通过以下方式实现：（1）连香树红球菌湿细胞的制备，用接种环取连香树红球菌的新鲜斜面菌种，划线接种于固体富集培养基中，25℃培养3天后即可得到长有明显菌落的培养基平板，获得新鲜的连香树红球菌湿细胞（；2）取连香树红球菌湿细胞接种于含有亚硝胺类物质的矿物盐培养基中，在避光条件下于25℃对矿物盐培养基中的亚硝胺类物质进行降解，其中每100mL矿物盐培养基中接种0.6g连香树红球菌湿细胞。

4.权利要求1所述的连香树红球菌在降解饮用水中亚硝胺类物质中的应用，其中亚硝胺类物质为亚硝基二甲胺、亚硝基二乙胺、亚硝基二丙胺、亚硝基吡咯烷和亚硝基二丁胺中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的连香树红球菌在降解饮用水中亚硝胺类物质中的应用，其特征在于主要通过以下方式实现：（1）连香树红球菌湿细胞的制备，用接种环取连香树红球菌的新鲜斜面菌种，划线接种于固体富集培养基中，25℃培养3天后即可得到长有明显菌落的培养基平板，获得新鲜的连香树红球菌湿细胞；（2）取连香树红球菌湿细胞接种于饮用水中，在避光条件下于25℃对饮用水中的亚硝胺类物质进行降解，其中每100mL饮用水中接种

0.6g连香树红球菌湿细胞，并且饮用水在接种连香树红球菌湿细胞之前用磷酸盐缓冲液调节饮用水的pH=7.3。

说明书

一株连香树红球菌及其筛选方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于饮用水中亚硝胺类物质的微生物降解技术领域，具体涉及一株连香树红球菌及其筛选方法和应用。

背景技术

[0002] 饮用水消毒在保证生物安全性的同时，也产生一系列对人体危害的消毒副产物。在该过程中产生的亚硝胺类物质（Nitrosamines）消毒副产物，由于具有致癌、致畸和致突变的作用，而且毒性远远高于常见的的卤代消毒副产物（三卤甲烷和卤乙酸等），因此引起国内外广泛关注，已经成为环境和健康研究领域的热点问题。根据美国环保局（USEPA）的污染物风险信息数据库（Integrated Risk Information System, IRIS)）和标准风险评估方法外推得到10-6 致癌风险水平上饮用水中多种亚硝胺类物质的阈值浓度低于20ng/L，美国EPA将其中6种物质列入非控制性污染物检测名单2（UCMR 2），并作为2008-2010年监测的重点。

[0003] 在饮用水生产过程中，国内外普遍采用预氧化技术降低后续处理单元的负荷，导致亚硝胺类物质提前产生。由于此类物质属于高极性小分子有机物，因而水处理普遍采用的沙滤及活性炭过滤对其处理效果并不明显。目前针对亚硝胺类物质（主要是NDMA）有效的消减控制方面的研究主要有紫外及高级氧化技术（UV/H2O2，O3/H2O2等）。但不同的处理方法存在处理水量相对较小、在后续的消毒单元中容易重新生成亚硝胺类物质、经济成本过高及产生二次污染等问题。

[0004] 与化学氧化及其它常规水处理方法相比，微生物处理法可以实现对特定污染物的定向去除，具有效果好、处理成本低、操作简便、不添加任何外来化学物质和避免化学处理引起的二次污染等特点，因此往往是污染物去除的首选技术。研究表明，大部分亚硝胺类物质是可以生物降解的，可通过二次基质代谢的途径实现降解。到目前为止，针对亚硝胺类物质的生物处理研究，国内外未见在地下水或饮用水过滤单元中筛选出有效的降解菌株。 因此，筛选针对亚硝胺类物质的有效降解菌株并进行降解效果评价是生物处理技术的首要任务。为此，从自然界中筛选出对亚硝胺类物质有高效降解能力的菌株，应用于饮用水中亚硝胺类物质的去除将具有实际的应用价值。

发明内容

[0005] 本发明解决的技术问题是提供了一株连香树红球菌及其筛选方法和应用，该连香树红球菌菌株是从实际运行的饮用水处理工艺中筛选得到的，其能够有效地降解多种亚硝胺类物质，并且该菌株能够有效降解饮用水氯胺消毒过程中出现的亚硝胺消毒副产物和被亚硝胺类物质污染的饮用水中的亚硝胺类物质，在饮用水净化处理方面具有良好的应用前景。

[0006] 本发明提供的连香树红球菌（Rhodococcus cercidiphylli），该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No. 9067，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期：2014年04月16日。

[0007] 本发明所述的连香树红球菌的筛选方法，其特征在于包括以下步骤（：1）驯化富集培养，在生物活性炭流动驯化处理装置的驯化柱中填充活性炭，该活性炭为饮用水处理厂连续运营三年以上的生物活性炭，饮用水处理厂的工艺依次为预氯化、混凝沉淀、生物活性炭滤池和氯消毒，生物活性炭流动驯化处理装置的进水为饮用水处理厂生物活性炭滤池出水，并在生物活性炭滤池出水中加入亚硝胺类物质调节进水的亚硝胺类物质的质量浓度为10μg/L，COD含量为1.0mg/L，用蠕动泵使进水在生物活性炭流动驯化处理装置中循环流动，保持水力停留时间为20min，进水经过活性炭吸附柱进行吸附和微生物降解处理，其中活性炭吸附柱的流速为10mL/min，活性炭吸附柱的总容积为500mL，该生物活性炭流动驯化处理装置于25℃连续运行2个月；（2）分离纯化培养，采集生物活性炭流动驯化处理装置中的活性炭与磷酸盐缓冲液混合，制得菌悬液接种到液体富集培养基中进行富集培养，其中磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠与磷酸二氢钠的混合溶液，pH=7.3，液体富集培养基的培养是避光条件，在温度为25℃，转速为180rpm的条件下传代培养3次，传代培养时间为15天/次，所述液体富集培养基的成分以g/L计为：蛋白胨30，其余成分为超纯水，液体富集培养基使用前于121℃温度下恒温灭菌20min，将富集培养物接种于固体富集培养基上进行分离纯化培养，其中固体富集培养基的培养是避光条件，温度为25℃，培养时间为2-3天/次，所述固体富集培养基的成分以g/L计为：蛋白胨30，琼脂20，其成分为超纯水，固体富集培养基使用前于121℃温度下恒温灭菌20min；（3）选择性培养，将步骤（2）分离纯化得到的纯培养物接种到选择性培养基中进行筛选，直到得到具有对亚硝胺类物质具有降解能力的连香树红球菌，其中选择性培养基为矿物盐培养基，其成分以g/L计为：K2HPO4·3H2O 4.25，NaH2PO4·H2O 1.00，MgSO4·7H2O 0.20，FeSO4·7H2O 0.012，MnSO4·H2O 0.003，ZnSO4·7H2O 0.003，CoSO4·7H2O 0.001，NH4Cl 2.0，其余成分为超纯水，pH=7.3，培养温度为20-30℃，该矿物盐培养基使用前于121℃温度下恒温灭菌20min。

[0008] 本发明所述的连香树红球菌的筛选方法中，所述的步骤（1）中磷酸盐缓冲液的配置方法为：在800mL超纯水中加入8g NaCl，0.2g KCl，1.44g磷酸氢二钠和0.24g磷酸二氢钾，用盐酸调节pH=7.3，加水定容至1000mL，在121℃温度下恒温灭菌20min后于室温保存，备用。

[0009] 本发明所述的连香树红球菌的筛选方法中，所述的步骤（3）中选择性培养基的培养温度为25℃。

[0010] 本发明所述的连香树红球菌在降解亚硝胺类物质中的应用，主要通过以下方式实现：（1）连香树红球菌湿细胞的制备，用接种环取连香树红球菌的新鲜斜面菌种，划线接种于固体富集培养基中，25℃培养3天后即可得到长有明显菌落的培养基平板，获得新鲜的连香树红球菌湿细胞；（2）取连香树红球菌湿细胞接种于含有亚硝胺类物质的矿物盐培养基中，在避光条件下于25℃对矿物盐培养基中的亚硝胺类物质进行降解，其中每100mL矿物盐培养基中接种0.6g连香树红球菌湿细胞。

[0011] 本发明所述的亚硝胺类物质为亚硝基二甲胺（NDMA）、亚硝基二乙胺（NDEA）、亚硝基二丙胺（NDPA）、亚硝基吡咯烷（Npyr）和亚硝基二丁胺（NDBA）中的一种或多种。

[0012] 本发明所述的连香树红球菌在降解饮用水中亚硝胺类物质中的应用，主要通过以下方式实现（：1）连香树红球菌湿细胞的制备，用接种环取连香树红球菌的新鲜斜面菌种，划线接种于固体富集培养基中，25℃培养3天后即可得到长有明显菌落的培养基平板，获得新鲜的连香树红球菌湿细胞；（2）取连香树红球菌湿细胞接种于饮用水中，在避光条件下于25℃对饮用水中的亚硝胺类物质进行降解，其中每100mL饮用水中接种0.6g连香树红球菌湿细胞，并且饮用水在接种连香树红球菌湿细胞之前用磷酸盐缓冲液调节饮用水的pH=
7.3。

[0013] 将筛选的连香树红球菌进行遗传学鉴定，所述遗传学鉴定为提取菌株的DNA，进行序列测定，将测序结果提交NCBI基因文库进行比对。

[0014] 本发明涉及的连香树红球菌菌株具有以下特征：

[0015] 1、连香树红球菌菌株适宜在中性偏碱性（pH7-8）的培养介质中生长，适合的生长温度为25℃左右，其细菌学形态特征为细胞呈扁平椭圆状，大小为2.5-5.0μm×0.5-2.0μm，属革兰氏阳性，不生芽孢，无鞭毛；

[0016] 2、连香树红球菌菌株在固体富集培养基的琼脂平板上的菌落形态一致，培养3天的菌落中间呈淡红黄色，湿润，圆形，凸起，不透明，边缘较为整齐；

[0017] 3、16S rRNA基因序列特征为：连香树红球菌菌株的16S rRNA序列长度为1201bp。

[0018] 本发明具有以下有益效果：

[0019] 1、本发明中连香树红球菌菌株的筛选方法操作简单、快速；

[0020] 2、本发明筛选的连香树红球菌对亚硝胺类物质具有较好的降解效果，特别是对于饮用水中痕量浓度（浓度为200ng/L）的亚硝胺类物质在短时间内的降解去除率范围为38-80%；

[0021] 3、本发明筛选的连香树红球菌用于处理饮用水中经预氯化提前生成的亚硝胺类物质，能有效降解NDMA，Npyr，NDEA，NDPA和NDBA 5种亚硝胺类物质，提高饮用水的安全性；

[0022] 4、本发明筛选的连香树红球菌可用于被亚硝胺类物质污染的饮用水中，降解去除亚硝胺类物质，对亚硝胺类物质污染的饮用水进行生物处理，降低其健康安全风险水平；

[0023] 5、本发明筛选的连香树红球菌菌株可投加于生物活性炭工艺单元，作为对亚硝胺类物质进行生物降解的深度强化处理手段，方法简单，运行及维护成本较低，在规模化处理亚硝胺类物质中具有良好的应用前景。

附图说明

[0024] 图1是本发明筛选的连香树红球菌在培养基上的菌落图，图2是本发明连香树红球菌菌株的细胞形态图，图3是本发明实施例3中连香树红球菌对矿物盐培养基中5种亚硝胺类物质降解的质量浓度变化曲线，图4是本发明实施例3中连香树红球菌对被亚硝胺类物质污染的饮用水中5种亚硝胺类物质降解的质量浓度变化曲线。

具体实施方式

[0025] 以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

[0026] 实施例1  菌株的分离与纯化

[0027] 1、培养基的制备

[0028] （1）矿物盐培养基

[0029] K2HPO4·3H2O：4.25.00g，NaH2PO4·H2O：1.00g，MgSO4·7H2O：0.20g，FeSO4·7H2O：0.012g，MnSO4·H2O：0.003g，ZnSO4·7H2O：0.003g，CoSO4·7H2O：0.001g，NH4Cl 2.0g，超纯水1000mL，pH=7.3，矿物盐培养基在121℃下恒温灭菌20分钟。

[0030] （2）固体富集培养基

[0031] Tryptonye Soya Broth（Oxoid LTD, England）30g，琼脂20g，超纯水1000mL，固体富集培养基使用前在121℃下恒温灭菌20分钟。

[0032] 2、驯化富集培养

[0033] 在生物活性炭流动驯化处理装置进行微生物驯化富集培养，该驯化处理装置中用水取自饮用水处理厂生物活性炭滤池出水，在水中加入NDMA，Npyr，NDEA，NDPA和NDBA5种亚硝胺物质，活性炭为饮用水处理厂运营三年以上的生物活性炭。在驯化柱中填充活性炭，用蠕动泵使进水在驯化处理装置中循环流动，保持水力停留时间20min，水流经活性炭吸附柱，进行吸附和生物降解处理，其中驯化处理装置在常温（25℃）条件下连续运行2个月，活性炭吸附柱的流速为10mL/min，生物活性碳吸附柱的总容积为500mL，进水的亚硝胺类物质的质量浓度为10μg/L，COD含量为1.0mg/L。

[0034] 称取采集于生物活性炭流动驯化处理装置中的生物活性炭10g，放入250mL三角瓶中，加入50mL磷酸盐缓冲液，并加适量玻璃珠，置于振荡器快速震荡4-5h。所得到的生物膜悬液为附着生物膜悬液，取5mL所得生物膜悬液，接种于事先灭菌的250mL亚硝胺类物质的质量浓度为1.0μg/L的矿物盐培养基中，25℃避光培养7天，获得第一代培养液，共传代3次。

[0035] 3、分离纯化培养

[0036] 将第三代培养液稀释106倍后接种于固体富集培养基平板，放入恒温培养箱中于25℃下培养3天。挑取平板上形成的单个菌落，划线接种于固体富集培养基中，进行分离培养，于25℃下培养3天后对平板培养物进行显微镜检查，如果获得的培养物菌种不纯，则按上述方法挑取平板培养物划线接种于平板分离、纯化培养基中继续纯化，直到显微镜检查结果表明为纯菌为止，经纯化得到纯连香树红球菌菌株。

[0037] 实施例2  连香树红球菌菌株的微生物学特性研究

[0038] 1、菌落形态观察

[0039] 将分离纯化培养得到的连香树红球菌单胞菌株划线接种于固体富集培养基中，于25℃下培养至长出菌落，观察菌落形态，结果如下表明菌株的菌落特征为：在固体富集培养基平板上培养3天的菌落直径大小约为1-2mm，菌落呈圆形，凸起，不透明，中心呈淡红黄色，边缘整齐，如图1所示。

[0040] 2、细胞形态观察

[0041] 挑取在固体富集培养基平板上培养3天的菌株菌落，依次用戊二醛固定、磷酸盐缓冲液（pH7.3）漂洗、梯度乙醇脱水、醋酸异戊酯处理以及二氧化碳临界点干燥、喷金、将样品放入观察室后进行电镜扫描，电镜扫描结果如图2，表明连香树红球菌呈扁椭圆状，不生芽孢，无鞭毛，大小为2.5-5.0μm×0.5-2.0μm。

[0042] 3、16S rRNA基因序列测定

[0043] 将接种于液体富集培养基中的单胞菌株于25℃，180rpm培养3天后的单胞菌细胞收集后采用DNA提取试剂盒（FastDNA SPIN kit, Takara  Biotechnology Co., Ltd., Japanese），提取单胞菌的DNA，送测序公司，进行测序，将测序结果在NCBI基因文库(http://blast.ncbi. nlm. nih.gov/)上进行比对。其中，菌株的16S rRNA （SEQ ID NO.1）序列长度为1210bp。

[0044] 根据菌株的菌落形态特征，细胞形态特征以及其16S rRNA基因序列的比对结果，鉴定菌株属于连香树红球菌Rhodococcus cercidiphylli。

[0045] 实施例3  连香树红球菌的应用

[0046] 1、制备连香树红球菌单胞菌单胞菌株的湿细胞

[0047] 用接种环取连香树红球菌的新鲜斜面菌种，划线接种于固体富集培养基上，25℃温度下，培养3天后即可得到长有明显菌落的培养基平板，获得新鲜连香树红球菌湿细胞。

[0048] 2、去除5种亚硝胺物质试验

[0049] 挑取菌种连香树红球菌的湿细胞接种于矿物盐培养基中，在避光条件下，于25℃进行培养，其中，每100mL矿物盐培养基中接种0.6g湿细胞；矿物盐培养基中的5种亚硝胺类物质的质量浓度分别为200ng/L，检测方法根据前期研究，采用超高液相串联质谱（UPLC/MS/MS）测定，测定接种前培养基和接种后第1天、3天、5天、7天、10天的矿物盐培养基中5种亚硝胺类物质的质量浓度值，测定结果如图3所示。

[0050] 连香树红球菌除了将接种的湿细胞后立即进行高压蒸汽灭菌，即在121℃高压下蒸汽灭菌20分钟，使接种的连香树红球菌立即灭活之外，得到无生物活性的对照组，其余条件相同，测定接种前培养基和接种后第1天、3天、5天、7天、10天的相应矿物盐培养基中亚硝胺类物质的质量浓度。

[0051] 测定结果表明：扣除空白对照，本发明中筛选的连香树红球菌对5种亚硝胺类物质具有很好的降解效果，去除效率高，在接种量为0.6g连香树红球菌湿细胞/100mL矿物盐培养基时，接种10天后饮用水中NDMA，NDEA，NDPA，Npyr和NDBA浓度分别降低至14.6%，52.3%，21.2%，51.5%和62%，说明连香树红球菌对5种亚硝胺类物质的去除率分别为85.4%，47.7%，
78.8%，48.5%和38%，进而表明矿物盐培养基中亚硝胺类物质的变化是由连香树红球菌引起的，且降解亚硝胺类物质效率高，因此，连香树红球菌能够有效地去除亚硝胺类物质，可用于亚硝胺类物质的降解。

[0052] 3、去除亚硝胺类物质污染的饮用水中的亚硝胺类物质试验

[0053] 1）用接种环取连香树红球菌菌株的新鲜斜面菌种，划线接种于固体富集培养基上，于25℃温度下，培养3天后即可得到长有明显菌落的培养基平板，获得新鲜的连香树红球菌湿细胞，备用；

[0054] 2）将加入磷酸盐缓冲液的饮用水高压灭菌处理，饮用水的pH=7.3；

[0055] 3）向饮用水中加入5种亚硝胺类物质，使饮用水中每种亚硝胺类物质的质量浓度均为200ng/L；

[0056] 4）取灭菌后的饮用水500mL置于500mL棕色瓶中，接种连香树红球菌湿细胞，密封后在避光条件下，于25℃温度下培养，每隔1h震荡1min，降解饮用水中的亚硝胺类物质，接种量为每100mL的饮用水中加入0.6 g连香树红球菌湿细胞；

[0057] 5）检测方法根据前期研究，采用超高液相串联质谱（UPLC/MS/MS）测定接种后第1天、3天、5天、7天、10天的饮用水中亚硝胺类物质的质量浓度，测定结果如图4所示。

[0058] 测定结果显示：在接种连香树红球菌之后，连香树红球菌从第三天开始显著降解5种亚硝胺类物质，饮用水中的亚硝胺类物质的质量浓度迅速下降，接种10天后饮用水中NDMA，NDEA，NDPA，Npyr和NDBA等5种亚硝胺类物质的质量浓度分别降低至25.6%，65.4%，32.9%，64.5%和69.3%，说明连香树红球菌对5种亚硝胺类物质的降解率分别为74.4%，
34.6%，67.1%，35.5%和30.7%，进而表明连香树红球菌对饮用水中的亚硝胺类物质具有较高的降解率。

[0059] 以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。