一种甘蔗愈伤组织显色控制基因ScSN及其应用

摘要

本发明提供了一种甘蔗愈伤组织显色控制基因ScSN及其应用，根据玉米花青素转录因子基因SN（GenBank:X60706.1）的上游、下游序列设计引物，利用同源克隆技术，从甘蔗上得到花青素转录因子基因ScSN的全长序列。甘蔗ScSN基因开放读码框长度为1722 bp，编码573个氨基酸。将甘蔗ScSN基因的编码区序列在NCBI中进行BLAST分析，与众多玉米花青素相关基因的BLAST同源搜索中，E值等于零，说明了所克隆的基因确实为甘蔗花青素合成相关基因。在ScSN序列两端分别添加KpnⅠ、SalⅠ酶切位点，构建植物表达载体pCAMBIA1301-35SN-ScSN，再通过基因枪轰击转化甘蔗愈伤组织，转化的愈伤组织颜色转变为暗红色，进一步证实所克隆的基因具有使甘蔗愈伤组织显色的功能。

权利要求

1.一种甘蔗愈伤组织显色控制基因ScSN，其特征在于：所述的控制基因ScSN序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种甘蔗愈伤组织显色控制基因ScSN，其特征在于：所述的基因ScSN开放读码框长度为1722 bp，编码573个氨基酸，转化甘蔗愈伤组织后可使转化组织呈现暗红色。

3.一种如权利要求1所述的一种甘蔗愈伤组织显色控制基因ScSN在控制甘蔗愈伤组织显色上的应用。

说明书

一种甘蔗愈伤组织显色控制基因ScSN及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种甘蔗愈伤组织显色控制基因ScSN及其应用。

背景技术

[0002] 花青素，也被称为花色素、花色苷，是一类自然界普遍存在的植物源水溶性色素。花青素也是植物呈色的主要因素，植物液泡中的不同PH值是影响植物花色呈现出不同的颜色关键。自然界的花青素不仅能使植物呈现丰富多彩的颜色，利于植物授粉，而且还可以保护植物果实免受紫外线的伤害。前人的研究表明，花青素具备很强的抗氧化能力，其抗氧化能力比维生素C高出20倍，比维生素E高出50倍。它是自由基的有效清除剂，在心血管疾病的预防、免疫活性的调节等方面，具有很高的营养和保健功能。

[0003] 目前，已从矮牵牛、金鱼草、紫苏、龙胆等诸多观赏植物中克隆了为数不少的花青素相关基因。这为更好地开发和利用花青素创造了条件，可以使其更直接、更准确、更有效地应用到人类生命健康、医学保健和有关研究上。

[0004] 已经有大量研究证明外源花青素调节基因对花青素合成的调控是有效的。同时也有研究表明，合理适当地运用花青素调控基因，可以建立一套新型的植物转基因研究可视化示踪系统。当前应用比较广泛的标记基因如GUS和 GFP等都存在着一定程度的不足和缺陷，如除了有报告功能外，没有其它实际应用价值；表达的蛋白需要消耗植物同化物，但对植物生长无益等，而花青素转录因子基因除了可以发挥标记基因的功能外，对植物的生长也具有重要作用，因此，对花青素表达有关基因的研究显得尤为重要。

[0005] 而在甘蔗方面，早在1975年，Harborne J.B就指出甘蔗茎色主要受到叶绿素和花青素含量的共同控制。1988年，广西农学院的李杨瑞等对不同基因型的甘蔗叶片的花青素含量进行了探究；2009年四川大学的涂斌等利用不同的分离方法，在甘蔗叶片上分离得到原花青素；2011年福建农林大阙友雄等利用电子克隆获得一个新的甘蔗MYB基因，初步确认为转录因子基因。植物花青素合成调节基因是一个家族，研究表明对花青素代谢起调控作用的转录因子主要有三类：bHLH、MYB类以及 WD40蛋白，其中MYB类是最主要转录因子。在花青素表达代谢调控过程中，通常是转录因子联合共同调控，但也有部分转录因子可以单独调控花青素的合成。近年来在甘蔗花青素基因方面的研究才刚刚起步，发现的基因还只是冰山一角。因此，在甘蔗中克隆出与花青素合成有关的转录因子基因，添加组成型启动子，形成转录因子基因持续表达的基因表达框，然后转化甘蔗愈伤组织，研究其显色效果，有望培育富含花青素的甘蔗新品种，并建立一套新型甘蔗转基因可视化报告体系，为进一步开发利用提供核心技术。

发明内容

[0006] 本发明的目的是克隆甘蔗愈伤组织显色控制基因并验证其功能。根据玉米花青素转录因子SN基因序列设计引物，利用同源克隆技术，从甘蔗上得到花青素转录因子基因ScSN的全长序列。克隆的甘蔗 ScSN基因开放读码框长度为1722 bp，编码573个氨基酸。将甘蔗ScSN基因的编码区序列在NCBI中进行BLAST分析，证明所克隆的基因为花青素转录调控有关基因，通过查新证明ScSN是新基因，再通过转化甘蔗愈伤组织，转化的愈伤组织颜色转变为暗红色，进一步证实了所克隆的基因具有使甘蔗愈伤组织显色的功能。

[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0008] 一种甘蔗愈伤组织显色控制基因ScSN，所述的控制基因ScSN序列如SEQ ID NO.1所示。

[0009] 所述的基因ScSN开放读码框长度为1722 bp，编码573个氨基酸，转化甘蔗愈伤组织后可使转化组织呈现暗红色。

[0010] 一种甘蔗愈伤组织显色控制基因ScSN在控制甘蔗愈伤组织显色上的应用。

[0011] 在NCBI上查询到玉米花青素转录因子基因SN（GenBank:X60706.1）的序列，根据序列在起始密码子和终止密码子位置设计一对引物，提取甘蔗叶片总RNA，合成cDNA第一链，PCR扩增ScSN目的基因片段，回收ScSN基因目的片段并加尾，与pMD18-T vector连接，转化大肠杆菌，ScSN重组子验证，目的基因PCR产物的序列测定。设计带酶切位点引物，PCR获得带酶切位点ScSN基因，酶切载体和ScSN基因，回收并连接，获得重组质粒。基因枪轰击转化，将愈伤组织置于显微镜下观察、拍照。

[0012] 将甘蔗ScSN基因的编码区序列在NCBI中进行BLAST分析，结果发现，其与玉米的SN（登录号：X60706.1）基因、R1(S)（登录号： NM_001112603.1）基因、Lc（登录号：NM_001111869.1）基因的相似度均达到90%，与高粱b1-1（登录号：AY542311.1）基因序列一致性达89%，与狗尾草R-S类似蛋白基因（登录号：NM_004970820.1）一致性达83%。特别是与众多玉米花青素相关基因的BLAST同源搜索中，E值等于零，说明了所克隆的基因确实为甘蔗花青素合成相关基因。在ScSN序列两端分别添加 KpnⅠ、SalⅠ酶切位点，构建植物表达载体pCAMBIA1301-35SN-ScSN，再通过基因枪轰击转化甘蔗愈伤组织，转化的愈伤组织颜色转变为暗红色，进一步证实所克隆的基因具有使甘蔗愈伤组织显色的功能。

[0013] 本发明的优点在于：

[0014] （1）显色效果好：本发明获得的甘蔗花青素调节基因ScSN转化甘蔗愈伤组织，可以使愈伤组织呈暗红色，与非转化愈伤组织的浅黄色形成鲜明对比，有利于区分转化和非转化愈伤组织；

[0015] （2）生态安全性高：由于该基因显色效果好，在甘蔗转基因中可以替代现在常用的抗生素筛选标记基因，而抗生素筛选标记对于生态安全有潜在风险。由于ScSN基因来源于甘蔗而非致病微生物，用花青素调节基因ScSN替代抗生素筛选标记基因可以降低、甚至消除转基因生物的生态风险。

[0016] （3）食品安全性高：长期食用转基因食品，其中含有的抗生素筛选标记有可能使微生物产生抗生素抗性，而用花青素调节基因ScSN替代抗生素筛选标记基因则不存在这方面问题。

[0017] （4）效益高：花青素调节基因ScSN可以使花青素大量表达，富含花青素的农产品或食品经济价值大大高于同类其它产品。

附图说明

[0018] 图1 甘蔗ScSN基因PCR产物，泳道1、2：ROC22扩增条带；泳道3、4：FN39扩增条带；泳道5、6：空白对照；M1：100bp marker；M2：15000+2000 bp marker。

[0019] 图2 重组质粒酶切验证.，泳道1：质粒pCAMBIA1301-35SN-ScSN；泳道2：pCAMBIA1301-35SN-ScSN用SalⅠ和 KpnⅠ酶切消化；泳道3：pCAMBIA1301-35SN-ScSN用SalⅠ酶切消化；泳道4：pCAMBIA1301-35SN-ScSN用KpnⅠ酶切消化；泳道5：空白对照。M：
15000+2000 bp marker。

[0020] 图3 A为转ScSN基因的愈伤组织（轰击后20天）；B为转ScSN基因愈伤组织显微观察结果。

具体实施方式

[0021] 为了充分公开本发明一种甘蔗愈伤组织显色控制基因ScSN及其应用，以下结合实施例加以说明。

[0022] 实施例1：

[0023] 一种甘蔗愈伤组织显色控制基因ScSN及其应用，具体包括甘蔗花青素调节基因ScSN的克隆和遗传转化，具体如下：

[0024] (1) PCR引物设计：在NCBI上查询到玉米 SN（GenBank: X60706.1）的序列，根据序列在起始密码子和终止密码子位置设计引物，序列为：

[0025] SNF1： 5’-ATGGCGCTTTCAGCTTCCCGAGTTC-3’；

[0026] SNR1：5’-TCACCGCTTCCCTATAGCTTTGCGA -3’。

[0027] （2）甘蔗叶片总RNA的提取

[0028] ①取新鲜的甘蔗叶片，用75 %的酒精将叶片表面擦拭干净，在液氮作用下迅速研磨成粉。将研磨好的材料转移至预先加入1 mL TRIZOL试剂的1.5 mL Eppendorf离心管中，用力振荡、混匀，室温放置5 min，于4 ℃，12 000 rpm离心5 min。

[0029] ②小心吸取800 μl上清液，移入新的1.5 mL Eppendorf离心管中，并加入200 μl氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡，待充分乳化，溶液呈乳白状后，室温静置5 min, 12 000 rpm，4 ℃，离心15 min。

[0030] ③小心取出离心管，吸取500 μl上清液转移至另一新的1.5 mL离心管中，忌吸出白色中间层。向上清中加入500 μl的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30 ℃下静置10 min。12 000 rpm，4 ℃，离心10 min。

[0031] ④小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75 %的乙醇l mL，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12 000 rpm，4 ℃，离心10 min。小心弃去乙醇。

[0032] ⑤重复步骤④。

[0033] ⑥室温干燥沉淀2-5分钟，加入适量的RNase-free水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80 ℃保存。

[0034] （3） cDNA第一链的合成

[0035] 以甘蔗叶片总RNA为模板，使用天根公司TIANscript RT Kit试剂盒合成cDNA第一链。

[0036] （4） PCR扩增 ScSN目的基因片段

[0037] 如下，配制50 μl的PCR反应体系：

[0038]

[0039] 反应条件如下：

[0040]

[0041] 采用OMEGA胶回收试剂盒回收目的片段。

[0042] （5） ScSN基因目的片段加尾和克隆

[0043] 在微量离心管内配制下列反应液：

[0044]

[0045] 于PCR仪上70 ℃，温育20 min。此ScSN基因加尾反应液直接用于TA克隆。吸反应液5 μl，在离心管中配制下列反应液：

[0046]

[0047] 完成加样后，稍离心使之集于离心管底部，16 ℃反应30 min，可延长至数小时或过夜，连接产物。

[0048] 大肠杆菌Escherichia coli.DH5α感受态细胞购自天根公司，参照说明书进行转化实验，具体步骤如下：

[0049] ①将10 μl ScSN基因的连接产物分别加入100 μl感受态细胞中，并用枪头混匀，冰浴30 min，42 ℃热击90 s；

[0050] ② 迅速放置冰上5 min；

[0051] ③ 加入1 mL LB液体培养基(不含Amp+)，混匀，37 ℃振荡培养4 h；

[0052] ④ 吸取200 μl菌液加上40 μl X-gal(20 mg/ml)和16 μl IPTG(50 mg/ml)+混匀，涂在含1000 μg/mL Amp的LB固体培养基上；

[0053] ⑤ 待菌液吸干后，封上封口膜，倒置培养皿，37 ℃培养16 h。对长出的单菌落提取质粒DNA和重组子验证。

[0054] （6）质粒DNA提取与重组子验证

[0055] 质粒提取按照常规方法或OMEGA质粒提取试剂盒说明书进行。重组子的PCR验证：

[0056] 如下，配制20 μl的PCR反应体系：

[0057]

[0058] 反应条件如下：

[0059]

[0060] （7）目的基因PCR产物的序列测定

[0061] 将提取的质粒DNA经过PCR验证后，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

[0062] （8）植物表达载体构建

[0063] 带酶切位点引物设计和目的序列获得：根据目的基因序列和旁侧载体序列，设计克隆目的基因的特异引物，并在引物的两端添加内切酶位点SalⅠ和 KpnⅠ，引物序列如下：

[0064] SNF2：, 5’ACGC GTCGAC ATGGCGCTTTCAGCTTCCCGAGTTC3’；

[0065] SNR2：, 5’GG GGTACCTCACCGCTTCCCTATAGCTTTGCGA 3’

[0066] 以重组子为模板，通过PCR获得加内切酶位点目的序列，PCR反应体系同（6）中重组子验证。采用OMEGA胶回收试剂盒回收目的片段。

[0067] 构建表达载体pCAMBIA1301+35SN+ScSN：PCR产物和载体pCAMBIA1301+35SN进行SalⅠ和 KpnⅠ双酶切及切胶回收。pCAMBIA1301+35SN回收大片段，并与PCR酶切回收产物进行连接，用T4 DNA连接酶连接16 ℃，连接10 h。连接体系如下：

[0068]

[0069] 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞重组质粒PCR验证同（6），PCR引物用SNF2、SNR2引物对。提取质粒再进行SalⅠ和 KpnⅠ双酶切验证。

[0070] （9）基因枪法转化甘蔗

[0071] 甘蔗愈伤组织利用诱导培养基MS+3 mg/L 2,4-D+7.0 g/L琼脂+30 g/L蔗糖（pH5.8），28 ℃条件下暗培养，诱导产生愈伤，备用。基因枪轰击方法按照美国Bio-Rad生物公司生产的PDS-1000/He说明书进行。愈伤组织利用显微镜观察拍照见图3。

[0072] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。